大黃素聯合紫杉醇治療非小細胞肺癌的作用機制探討

王潘紅 鄭明 蔡云峰

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，據2019年美國相關統計數據表明NSCLC約占所有肺癌患者的85%［1-2］。大黃素是中藥大黃、何首烏和虎杖中的主要有效成分，現代藥理研究表明其具有抗癌抗腫瘤、抗炎、鎮痛、保護器官等多種藥理作用，因其抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的突出作用多用于抗癌的相關研究中［3-5］。紫杉醇是由紅豆杉中提取出的二萜類植物抗腫瘤藥物，因其抗瘤療效、延緩腫瘤進展和過敏反應較低等優勢臨床上廣泛應用于多種惡性腫瘤的治療［6-8］。本研究探討大黃素聯合紫杉醇治療NSCLC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞株A549購自美國典型生物收藏中心；DMEM高糖培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司、MTT粉劑及二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒（TP53批號：202004，CASP3批號：202007）購自南京碧云天科技公司；多功能酶標儀，美國Molecular Devices有限公司，型號：M5。

1.2 方法 （1）大黃素聯合紫杉醇的成分-靶點網絡構建：在研究中藥分子機制的在線生物信息學分析工具TCMSP以及醫藥信息查詢庫藥智數據中輸入“大黃素”、“紫杉醇”搜集兩者的所有化學成分及靶點，將得到的數據建立大黃素聯合紫杉醇的化學成分-靶點數據庫，輸入Cytoscape 3.7.0軟件以建立大黃素聯合紫杉醇的成分-靶點網絡。（2）大黃素聯合紫杉醇與NSCLC的PPI網絡構建：通過GeneCards（http：//www.genecards.org/）數據庫獲取NSCLC相關的疾病基因，然后在EXCEL中應用“VLOOKUP”函數篩選出大黃素聯合紫杉醇與NSCLC的交集靶點。根據獲得的交集靶點數據輸入STRING數據庫中，將物種僅限于智人（Homo sapiens），置信度得分＞0.4，構建蛋白相互作用網絡 （PPI），并尋找PPI網絡的核心靶點。（3）靶點的生物學功能及通路分析：將1.2中得到的大黃素聯合紫杉醇-NSCLC交集蛋白靶標基因輸入Cytoscape中的ClueGo插件進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，僅考慮P值＜0.05的生物學功能和富集通路，分析大黃素聯合紫杉醇作用于NSCLC的潛在生物學功能及相關通路。（4）MTT法檢測細胞活力：分為空白對照組、大黃素組、紫杉醇組與聯合用藥組，待A549細胞處于生長對數期時接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養過夜貼壁后，空白對照組加入含胎牛血清（10%）的DMEM培養基處理48 h，大黃素組分別加入30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L 的大黃素溶液處理48 h，紫杉醇組分別加入0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L的紫杉醇溶液處理48 h，聯合用藥組加入90μmol/L大黃素分別聯合0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L 的紫杉醇溶液處理48 h。每孔加入20μL 5 mg/mL MTT液繼續培養4 h后吸棄培養液，加入150μL DMSO于室溫下振蕩10 min，然后用酶標儀選定490 nm波長測定OD值。每組設6個復孔，然后根據公式計算抑制率：腫瘤抑制率=（1-藥物組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。（5）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：分為空白對照組、大黃素組、紫杉醇組與聯合用藥組，待A549細胞處于生長對數期時接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養過夜貼壁后，空白對照組加入含胎牛血清（10%）的 DMEM 培養基培養48 h，大黃素組加入90 μmol/L的大黃素溶液處理48 h，紫杉醇組加入0.2 μmol/L 的紫杉醇溶液處理48 h，聯合用藥組加入90 μmol/L大黃素聯合0.2 μmol/L紫杉醇溶液處理48 h。按照上述分組給藥后收集各組細胞上清液于4 ℃ 3,000 r/min 離心10 min，然后吸取上層清液，按照試劑盒中的步驟用酶標儀分別測定樣品的吸光度，計算相應的CASP3、TNF-α的水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS26.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立成分-靶標網絡 從TCMSP和藥智數據數據庫中篩選出大黃素聯合紫杉醇的41個靶標基因，應用Cytoscape 3.7.0軟件構建成分-靶點網絡，獲得所示43個節點和41個邊緣的目標網絡。見圖1。

圖1 大黃素聯合紫杉醇成分-靶點網絡圖

2.2 靶點-靶點互作網絡 應用GeneCards數據庫，獲得關于NSCLC的4,910個疾病相關基因，采用EXCEL函數篩選出大黃素聯合紫杉醇與NSCLC的共同靶點基因32個。將32個共同基因輸入STRING，獲得31個節點、149個邊緣的靶點—靶點互作網絡（見圖2）。選擇具有高度連接性的前10個靶基因作為中樞基因。大黃素聯合紫杉醇在NSCLC發展過程中可能發揮重要作用的是細胞腫瘤抗原p53（TP53）、半胱天冬酶3（CASP3）、腫瘤壞死因子（TNF）、前表皮生長因子（EGF）、前列腺素G / H合酶2（PTGS2）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、血管內皮生長因子受體2（KDR）、轉化生長因子beta-1（TGFB1）、基質金屬蛋白酶9 （MMP9）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）。

圖2 大黃素聯合紫杉醇-NSCLC靶點-靶點互作網絡

2.3 GO與KEGG富集分析 GO富集分析由生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）三部分組成。應用Cluego將293個靶點基因上傳到數據庫，獲得GO和KEGG通路信息。見圖3-4。GO分析共得到150個生物學過程，前10個生物學過程見表1。KEGG通路分析得到45條相關通路，前10個相關通路見表2。

表1 GO分析前10個生物學過程

表2 KEGG分析前10個通路

圖3 大黃素聯合紫杉醇-NSCLC共同靶點GO分析圖

圖4 大黃素聯合紫杉醇-NSCLC共同靶點KEGG分析圖

2.4 大黃素聯合紫杉醇對A549增殖的影響 90 μmol/L大黃素+0.1μmol/L紫杉醇與90μmol/L大黃素+0.2 μmol/L紫杉醇對A549的抑制率明顯高于其他各組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度大黃素及大黃素聯合紫杉醇對A549增殖的比較

2.5 ELISA檢測CASP3、TNF-α水平 由上述結果可知90μmol/L大黃素和0.2μmol/L紫杉醇這兩個濃度效果最好，因此選取這兩個濃度分成單用與聯用三組。與空白對照組相比，大黃素組、紫杉醇組與聯合組CASP3含量明顯增加（P＜0.05），聯合組CASP3含量高于大黃素組和紫杉醇組（P＜0.05）。與空白對照組相比，大黃素組、紫杉醇組與聯合組TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），紫杉醇組TNF-α含量低于大黃素組，聯合組TNF-α含量低于大黃素組和紫杉醇組（P＜0.05）。見表4。

表4 大黃素、紫杉醇以及兩藥聯合對CASP3、TNF-α水平的影響（±s）

表4 大黃素、紫杉醇以及兩藥聯合對CASP3、TNF-α水平的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與大黃素組比較，#P＜0.05；與紫杉醇組比較，△P＜0.05

組別nCASP3（ng/L）TNF-α（ng/L）空白對照65.96±0.36101.25±3.35 90μmol/L大黃素67.75±0.65*79.57±2.78*0.2μmol/L紫杉醇67.99±0.31*70±2.69*#90μmol/L大黃素+0.2μmol/L紫杉醇610.91±0.43*#△52.01±1.98*#△

3 討論

目前臨床上針對NSCLC的治療方法主要有手術治療、放化療、分子靶向藥治療、中藥治療等，其中約80%的患者診斷時即為晚期無法接受手術治療，放化療及分子靶向藥物存在耐藥現象和毒副作用等問題，中藥治療NSCLC具有多靶點的優勢，且毒性較低，受到國內外學者的廣泛關注［9］。紫杉醇是一種廣譜抗癌藥物，已被證實對于多種癌癥如NSCLC、卵巢癌、乳腺癌等均有明顯作用，但因其耐藥性及毒副作用的問題使紫杉醇在臨床應用方面受到限制［7］。有研究表明大黃素能夠有效抑制NSCLC細胞增殖，在減少化療藥物耐藥性方面具有較好的應用前景［10］。

MTT結果表明，大黃素聯合紫杉醇有抑制A549細胞增殖的作用，且聯合用藥抑制率高于大黃素及紫杉醇單獨用藥，提示大黃素聯合紫杉醇治療NSCLC具有一定潛力。網絡藥理學結果表明，大黃素聯合紫杉醇作用于NSCLC的潛在靶基因主要有TP53、CASP3、TNF等。研究表明腫瘤抑制基因TP53突變狀態作為NSCLC治療反應的預測標志和生存預后標志起到一定作用，同時與NSCLC患者總體存活率較低有關［11］。有研究表明CASP3基因表達降低的NSCLC患者總體存活率明顯較低，其中CASP3（-1337C＞G）多態性可能參與NSCLC的發生發展［12］。有研究結果顯示，TNF-α在NSCLC患者癌組織中高表達，表明TNF-α與NSCLC的發生發展密切相關［13］。ELISA結果表明，大黃素與紫杉醇聯合能明顯增加A549細胞CASP3含量，降低TNF-α含量，提示大黃素聯合紫杉醇可能通過調控CASP3、TNF-α水平作用于NSCLC。從GO富集分析結果可知，大黃素聯合紫杉醇是通過調節細胞增殖與凋亡、調控基因表達等多個生物學過程發揮抗NSCLC作用，這也體現在機制研究所涉及的信號通路中。KEGG 分析結果涉及MAPK 信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等，可能與 NSCLC的生長和抑制密切相關。

綜上所述，大黃素聯合紫杉醇可能通過調控CASP3、TNF-α等多個靶點以及調節細胞增殖與凋亡、調控腫瘤抑制基因表達、炎癥反應等多個生物學功能或途徑對NSCLC起到治療作用。