不同載體表面及糖暴露后具核梭桿菌黏附及生物膜特性

邵青意 馮丹峰 虞臻迪 陳丹蕾 計友棋 程東慶

具核梭桿菌（F.nucleatum）是梭桿菌門梭桿菌屬的代表細菌，目前研究主要聚焦于潰瘍性結腸炎、克羅恩病，尤其是結直腸癌［1］。消化系統存在口腔-腸道微生物群軸，F.nucleatum不僅聚集于結腸，也大量定居于口腔微環境［2-3］，是導致牙周病的主要病原體。F.nucleatum在口腔中具有高致病性與強侵襲性，在生物膜結構中作為“組織者”，連接早期定植微生物與晚期定植微生物、共生菌與致病菌［1］。F.nucleatum通過黏附素RadD、孔蛋白FomA及脂肪酸結合蛋白2（fattyacid-binding protein 2，Fap2）的介導，與后期病原微生物牙卟啉單胞菌等實現共聚與黏附，從而幫助其定植［1］。細菌生物膜是指附著于有生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有一定三維結構和功能的細菌群體［4］。在復雜的口腔微環境內，細菌生物膜易形成于多種材料表面，人造材料上的口腔生物膜影響假牙和修復體的使用壽命，還會導致種植體周圍炎等疾病［4］。同時，不同碳水化合物飲食可以促進或預防齲齒生物膜的發展［5］。本文探討F.nucleatum在不同口腔材料表面的聚集、黏附與生物膜形成特性，以及常見糖暴露的影響，旨在了解其在復雜的口腔微環境中的定植情況，揭示F.nucleatum在不同口腔條件下的致病力。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑與儀器 菌株：F.nucleatum多形亞種（Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum）BNCC336949保存于本實驗室。主要試劑與材料：蔗糖（麥克林）、乳糖（麥克林）、木糖醇（阿拉丁）、牛心腦浸液培養基（海博生物）、瓊脂粉（杭州濱和微生物）、氯化血紅素（源葉生物）、微生物K1注射液（海博生物）、無菌脫纖維羊血（源葉生物）、厭氧袋（三菱，日本）、鈦片（購自淘寶海源科研金屬）、樹脂義齒（購自淘寶丞誠口腔材料模具）、24孔板（康寧）等。主要儀器：多功能酶標儀（Tecan，瑞士）、微孔板分光光度計（Bio Tek，美國）、場發射掃描電子顯微鏡（日立，日本）等。

1.2 樣品處理 鈦片使用噴砂機于不同顆粒大小石英砂45 m、125 m、350 m加工，在100℃下，60%H2SO4、10%HCL和去離子水以1∶1∶2體積比組成的混酸中酸蝕20 min，加工成粗糙度為0.1 m、0.5 m、1.5 m、3.0 m及4.0 m五組微米結構表面鈦片。所有純鈦鈦片試件先用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，再用無水乙醇超聲降解15 min，高壓蒸汽滅菌備用。樹脂義齒用無水乙醇超聲降解15 min，高壓蒸汽滅菌備用。

1.3 細菌培養與實驗菌懸液制備 將凍存的F.nucleatum接種至含1%維生素K1和氯化高鐵血紅素儲備液（50 mg氯化高鐵血紅素、1 mL微生物K1注射液/100 mL）的BHI血平板，37℃厭氧培養，24～36 h可形成菌落，應用革蘭染色進行純度鑒定。將上述單菌落接入含10%小牛血清的BHI液體培養基中，37℃厭氧培養36 h，將菌液離心（1,000 r/min，5 min），使用無菌PBS重懸，并將菌懸液調節至A600值為0.8。

1.4 F.nucleatum自聚集 細菌自聚集是指菌體在培養過程中，大量并快速繁殖從而導致其自行聚集成團的現象。不同載體環境：將1.2中鈦片、樹脂義齒分別置于24孔板內，設置聚苯乙烯對照組，加入實驗菌懸液，37℃培養48 h，形成穩定生物膜。參考文獻［6］中方法，應用無菌聚集緩沖液（150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Tris-HCL pH 8、0.1 mmol/L CaCl2和0.1 mmol/L MgCl2）將F.nucleatum生物膜超聲（100 Hz，10 min）洗脫、重懸，于A600測吸光度記作A0，靜置，每30 min離心生物膜懸液（2,000 r/min，2 min），取上清液于A600測吸光度記作At。不同糖培養基環境：F.nucleatum于含有1%不同糖（蔗糖、乳糖、木糖醇、空白培養基）的培養基中37℃培養48 h，收集生物膜，檢測方法同上。聚集率計算：Aggregation %=（A0-At）/A0×100%。

1.5 F.nucleatum黏附作用 細菌黏附作用是指細菌可通過黏附素附著在載體或宿主細胞表面。不同載體環境：將1.2中鈦片、樹脂義齒分別置于24孔板內，設置聚苯乙烯對照組，加入實驗菌液，37℃厭氧分別培養0 h、2 h、4 h、6 h、8 h。將試件用PBS沖洗3次，99%甲醇固定15 min，參考文獻［7］，在干燥后用1%結晶紫溶液染色5 min，PBS洗滌干燥后加入33%乙酸混勻溶解結晶紫，于A570處測定各時間點吸光度值。不同糖培養基環境：F.nucleatum于含有不同糖的培養基或原培養基（空白對照）中37℃培養0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，檢測方法同上。黏附率（%）=（Ath-A0h）/A0h×100%。

1.6 電鏡表征不同粗糙度鈦與F.nucleatum黏附時期形態 菌懸液于每組粗糙度試件表面培養6 h后，取出試件，用PBS沖洗試件3次，立即放入2.5%戊二醛溶液中，4℃過夜，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水，干燥，噴金，掃描電鏡表征黏附時期不同粗糙度鈦片表面細菌形態。

1.7 F.nucleatum生物膜形成 細菌生物膜形成通常包含細菌與底物表面通過黏附因子相互作用階段，微菌落形成階段，生物膜成熟階段，細菌脫落或擴散階段。不同載體環境：將不同粗糙度試件、樹脂牙齒分別置于24孔板內，設置聚苯乙烯對照組，加入實驗菌懸液，37℃厭氧分別培養12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，參照1.5中步驟，得到各時間點生物膜總量。不同糖培養基環境：F.nucleatum于含有不同糖的培養基與原培養基中37℃培養12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，檢測方法同上。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism進行數據統計學處理與繪圖。

2 結果

2.1 自聚集能力 蔗糖培養基中的生物膜內F.nucleatum在30 min時自聚集率為60.58%，在90 min時達到69.43%；其次為乳糖培養基，其中生物膜內F.nucleatum在30 min時自聚集率為43.36%，90 min達到51.58%；最后為木糖醇與普通培養基組（30 min分別為36.50%、37.00%；90 min分別為34.39%、44.04%）（見圖1A）。蔗糖組F.nucleatum自聚集率大于其他組。載體組F.nucleatum自聚集率除聚苯乙烯組均在30 min達到最大值，0.1 m、0.5 m、1.5 m、3 m、4 m鈦片、聚苯乙烯、樹脂義齒組最大自聚集率分別為36.14%、53.76%、46.18%、45.08%、44.83%、50.22%與49.87%（見圖1B）。

圖1 不同載體表面、不同含糖培養基F.nucleatum生物膜細菌自聚集率

2.2 黏附作用 F.nucleatum具有較好的黏附作用，在8 h內能夠黏附在不同粗糙度鈦片、樹脂義齒、聚苯乙烯板條上，在含不同糖的培養基內也能夠黏附于載體表面。不同載體組，8 h時，聚苯乙烯板條表面F.nucleatum黏附率最高，為548.00%，除4.0 m鈦片組與聚苯乙烯板條組外，其余均在6 h達到最大黏附率，完成黏附。6 h時0.1 m鈦片、0.5 m鈦片、1.5 m鈦片、3.0 m鈦片組黏附率分別為98.00%、180.00%、177.00%、40.00%。不同糖培養基組，8 h時蔗糖組F.nucleatum黏附率最高，為370.00%。除蔗糖組外，其余不同含糖培養基均在6 h達到最大黏附率，完成黏附。6 h時乳糖、木糖醇、培養基組黏附率分別為196.00%、144.00%、97.00%。見圖2。

圖2 F.nucleatum黏附時期不同載體、培養基內黏附情況與黏附率

2.3 掃描電鏡表征鈦表面不同粗糙度與鈦表面黏附時期細菌形態 掃描電子顯微鏡下表征不同粗糙度鈦片表面，可見細微劃痕于光滑鈦片表面，深淺不同的微米凹坑分布于不同粗糙度鈦表面，0.5 m鈦表面多為2 m直徑凹坑，其余粗糙度鈦片表面凹坑大小不一、深淺不一；粗糙度越大，凹坑越致密。鈦片表面F.nucleatum黏附6 h經掃描電鏡發現相同放大倍數時隨機視野下可見隨著鈦表面粗糙度變大，黏附的細菌數量增加，F.nucleatum菌體變長。在材料表面凹陷處，細菌聚集更為顯著。粗糙度大的鈦表面，為細菌提供容納場所，從而在初期抵抗外界流水沖刷，使其能夠更好黏附于載體表面。見圖3。

圖3 鈦表面F.nucleatum黏附時期掃描電鏡圖像

2.4 F.nucleatum生物膜形成 F.nucleatum在所有載體表面均能夠形成生物膜。生物膜在2 d時成熟：除了0.1 m、3 m鈦表面外，其他粗糙度表面與聚苯乙烯表面F.nucleatum生物膜均在2 d時到達峰值。聚苯乙烯表面F.nucleatum生物量最大，其次為4 m鈦片、1.5 m鈦片表面，0.1 m鈦片表面生物量最小。F.nucleatum生物量在所有材料表面均于3 d后開始減少，生物膜結構逐漸衰老、瓦解。不同含糖培養基組，在蔗糖作用下生物膜含量最大，在48 h為A570=3.75，其次為乳糖組、純培養基組、木糖醇組。所有組內生物膜均在2 d時達到最大生物量，生物膜成熟，在3 d后開始減少，生物膜逐漸瓦解。不同培養條件下48 h生物膜結晶紫染色后形態觀察，含蔗糖培養基內生物膜生物膜明顯大于其他培養基，且不同載體表面均有生物膜形成。見圖4。

圖4 F.nucleatum生物膜形成時期生物量

3 討論

F.nucleatum是口腔齦上和齦下生物膜中豐度最高的革蘭陰性厭氧菌之一，是健康和疾病牙周微生物群的重要組成［3，8］。F.nucleatum聚集作用強，介導多種浮游細菌共聚集，聚集作用促進細菌聚攏成團，進一步加強其黏附作用［9］。同時，F.nucleatum作為一種“黏附型”微生物，其黏附能力強，在防止唾液沖刷的同時，還促進多微生物交流與代謝互作［10-11］。F.nucleatum與口腔微生物群其他成員有著互惠關系，與其他口腔微生物互作以驅動疾病發生，是生物膜形成的關鍵病原體［12-14］。口腔微生物群對口腔健康有重要作用，多微生物形成的生物膜轉變為生態失調狀態時，口腔微生物群可能導致多種疾病［15］。

在復雜的口腔環境中，F.nucleatum因其黏附、生物膜形成能力被認為可能有助于種植體周圍疾病的發生和發展［16］。在種植體周圍炎中，通過附著于牙齦和種植體表面的生物膜形成群落，繼而破壞周圍組織。F.nucleatum在口腔內繁殖，分泌代謝產物，刺激牙齦組織，導致牙齦發炎和出血［15］。本研究發現F.nucleatum在大部分載體表面都能夠黏附并形成良好的生物膜。在蔗糖的存在下，相比于其他培養基，該細菌的黏附與生物膜形成能力均較強。提示臨床對于潛在F.nucleatum感染的患者應該注意減少蔗糖攝入，從而減少牙齒疾病的發生。

本研究發現，F.nucleatum在不同載體表面與不同糖暴露下均有良好的聚集、黏附與生物膜形成能力。已有研究發現，這可能來源于其黏附素的作用，F.nucleatum產生淀粉樣蛋白特性黏附素FadA，介導了良好的種間共聚集能力、黏附能力和多物種生物膜形成，使其在生物膜形成過程中充當支架，同時賦予其耐酸性使其能夠存活于口腔微環境［17］。ENGEVIK等［18］發現F.nucleatum通過RadD黏附素黏附在艱難梭菌，并增加生物膜形成與胞外多糖的產生，提示F.nucleatum通過黏附素發揮良好的黏附能力，增加生物膜形成。各種研究均發現F.nucleatum在黏附素介導下具有良好的黏附與生物膜形成能力，這也提示后續可以針對黏附素進行其致病性研究。本研究發現，F.nucleatum在不同載體上與不同糖暴露后均有優良的聚集、黏附、生物膜形成能力。電鏡觀察下隨著粗糙度增加，黏附細菌數量增加，但黏附率在3 m時減小，這可能由于電鏡觀察存在選擇偏差。