基于液質(zhì)聯(lián)用和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討天花粉防治糖尿病的作用機(jī)制

梁浩威 徐純依 關(guān)旸 張卓文 張芮芹 吳成 王輝

中醫(yī)藥治療糖尿病歷史悠久，研究表明，天花粉主清熱瀉火、生津止渴，可用于預(yù)防和治療內(nèi)熱消渴的糖尿病，對(duì)應(yīng)癥狀以用藥劑量治療無(wú)毒副作用，常見于古今糖尿病方劑［1］。天花粉化學(xué)成分較為復(fù)雜，難以解析，在防治疾病過程更是涉及多種成分、靶點(diǎn)及途徑，致使研究天花粉活性成分及作用機(jī)制存在較大難度［2］。液質(zhì)聯(lián)用作為一種先進(jìn)的成分分析方法，憑借高分辨率和靈敏度可快速標(biāo)記中藥內(nèi)化合物組成，廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)領(lǐng)域［3］。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)雜成分和多個(gè)靶點(diǎn)的中藥藥理研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以系統(tǒng)研究中藥防治疾病機(jī)制［4］。因此，本研究通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)解析天花粉防治糖尿病的活性成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)系統(tǒng)性探究其作用機(jī)制，以期為天花粉等中藥防治糖尿病的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 超純水系統(tǒng)（Milli-Q IQ 7000，Merck KGaA）；500 mL套式恒溫器（TC-15，新華醫(yī)療器械廠）；高分辨四級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀（SYNAPT G2-Si，Waters）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-5298，上海榮亞生化儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 天花粉（批號(hào)220824）購(gòu)自杭州方回春堂國(guó)藥館有限公司，為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。甲醇（批號(hào)l1116707042）、乙腈（批號(hào)JB092530）購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。甲酸（批號(hào)H1913009）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。CORTECS UPLC T3 column色譜柱（2.1×100 mm，1.6 μm）和BEH C18 Van Guard保護(hù)柱（2.1×50 mm，1.7 μm）購(gòu)自沃特世科技（北京）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)網(wǎng)站 SwissADME（www.swissadme.ch/）；Swiss Target Prediction（www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（www.genecards.org/）；STRING（cn.string-db.org/）；Metascape（metascape.org/）；UniProt（www.uniprot.org/）。

1.4 方法 （1）天花粉水提物制備：精密稱取天花粉30.0 g，置于500 mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入300 mL超純水浸泡30 min。冷凝回流加熱，煮沸1 h過濾，重復(fù)1次。冷卻后合并2次濾液，濃縮至1.0 g生藥/mL立即使用。天花粉水提液5.0 mL，超純水和甲醇稀釋為10 mg生藥/mL（甲醇含量50%）的供試液，50%甲醇水溶液為對(duì)照液，3,000 r/min離心5 min取上清，0.22 μm濾膜過濾后用于液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。（2）色譜與質(zhì)譜條件：①色譜條件：流動(dòng)相：A溶劑（乙腈）；B溶劑（0.1%甲酸溶液）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫，柱溫：25℃；進(jìn)樣量：2 μL。②質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）分別采用正負(fù)離子掃描模式；離子源溫度：120℃；錐孔電壓：20.0 V；毛細(xì)管電壓：3.0 kV（+）、2.5 kV（-）；鎖定質(zhì)量溶液：Lockspray在線校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M-H］-=554.2615）；掃描模式為MSe；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～1,200 Da，掃描時(shí)間0.2 s；工作站：MassLynx V4.1工作站。（3）成分分析：將數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)nifi數(shù)據(jù)處理工作站，使用軟件UNIFI 2.0分析色譜圖及各色譜峰的質(zhì)譜信息，分析天花粉水提物組分及結(jié)構(gòu)，得到天花粉成分。（4）天花粉成分篩選：SwissADME為全面藥物代謝性質(zhì)分析網(wǎng)站，可依據(jù)藥物代謝信息對(duì)活性成分進(jìn)行篩選。將天花粉成分導(dǎo)入SwissADME網(wǎng)站，以腸胃道的吸收“GI absorption”為“High”，類藥性“Druglikeness”中的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge等5項(xiàng)根據(jù)Lipinski五原則，依據(jù)Yes的數(shù)量≥2個(gè)作為限制條件，篩選得到天花粉潛在活性成分。（5）藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：將天花粉潛在活性成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，選擇Probability不為0的靶點(diǎn)作為天花粉相關(guān)的藥物靶點(diǎn)。（6）疾病靶點(diǎn)收集：在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diabetes”為檢索詞，檢索得到糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)，以中位數(shù)篩選法獲取候選糖尿病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。（7）蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選：將藥物和疾病靶點(diǎn)做交集可得天花粉防治糖尿病潛在靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)輸入STRING網(wǎng)站中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種為“Homo species”，置信度設(shè)置最高為0.90，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，篩選獲得主要靶點(diǎn)，可視化繪制PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape軟件的cytohubba插件以MCC算法篩選核心靶點(diǎn)。（8）相關(guān)靶點(diǎn)GO功能分析及KEGG通路富集分析：將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape網(wǎng)站中進(jìn)行GO功能富集分析包括生物過程（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）及KEGG富集分析，選擇“Homo species”，P value設(shè)置為0.01。獲得富集分析結(jié)果后，用R 4.1.2軟件的ggplot2包實(shí)現(xiàn)可視化，GO富集采用柱狀圖形式展示，KEGG富集以氣泡圖形式展示。（9）“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建：根據(jù)蛋白靶點(diǎn)與KEGG信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，選取關(guān)鍵通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape軟件可視化為網(wǎng)絡(luò)圖。（10）分子對(duì)接：結(jié)合AutoDock Vina通過分子精細(xì)對(duì)接進(jìn)一步研究天花粉與核心靶點(diǎn)的相互作用。根據(jù)Cytoscape軟件預(yù)測(cè)的核心靶點(diǎn)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)的pdb文件，進(jìn)行去除配體、去除水分子、加氫等常規(guī)處理后作為對(duì)接受體。以天花粉中主要成分為配體，用半柔性對(duì)接的方法進(jìn)行分子對(duì)接。并用Pymol 2.5.0軟件對(duì)結(jié)合能＜-8 kcal/mol的“分子-蛋白”結(jié)合進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 天花粉成分鑒定結(jié)果 將天花粉分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)unifi軟件鑒定得到的化學(xué)成分共15種，主要包括氨基酸、四環(huán)三萜類、脂肪酸酯類、烯酮類、芳香醛類等化合物。見表1、圖1。

圖1 天花粉液質(zhì)聯(lián)用的總離子流圖

表1 天花粉成分表

2.2 天花粉活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 將天花粉15種化學(xué)成分經(jīng)SwissADME篩選后得到Benzaldehyde、L-Citrulline、Dibutyl Phthalate、Cucurbitacin D、Geranylacetone、Methyl Pentadecanoate等6種潛在活性成分。將潛在活性成分導(dǎo)入SwissTarget Prediction網(wǎng)站預(yù)測(cè)得329個(gè)蛋白靶點(diǎn)。以“diabetes”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)并以Score值的8倍中位數(shù)篩選得到1,339個(gè)糖尿病高相關(guān)靶點(diǎn)。通過R軟件運(yùn)行g(shù)gvenn包分析得到93個(gè)天花粉防治糖尿病靶點(diǎn)，并可視化為Venn圖，見圖2。

圖2 天花粉與糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)Venn圖

2.3 蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將藥物和疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，獲得61個(gè)高置信度蛋白靶點(diǎn)，經(jīng)Cytoscape軟件可視化為PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析篩選得到相關(guān)度較高的STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、TNF、EGFR、PPARA等10個(gè)核心靶點(diǎn)。

圖3 天花粉和糖尿病共同作用靶點(diǎn)PPI及核心靶點(diǎn)圖

2.4 GO富集分析 GO功能富集通過天花粉61個(gè)高置信度靶點(diǎn)得到523個(gè)生物過程、77個(gè)分子功能、34個(gè)細(xì)胞組成等功能進(jìn)程。其中多涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)（cellular response to chemical stress）等細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、脂肪酸代謝過程（fatty acid metabolic process）等脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物過程部分以及氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）為代表的氧化應(yīng)激類分子的分子功能部分，并包含細(xì)胞膜上的膜筏（membrane raft）細(xì)胞膜組成類的細(xì)胞組成部分，見圖4。

圖4 GO富集分析二級(jí)分類柱狀圖

2.5 KEGG富集分析 將天花粉61個(gè)高置信度靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集，得到顯著相關(guān)（P＜0.01）的通路共126條，其中與糖尿病相關(guān)通路有38條，可視化得到KEGG富集分析氣泡圖，見圖5。主要涉及Insulin resistance（胰島素抵抗）、Endocrine resistance（內(nèi)分泌抵抗）、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號(hào)通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路）、Non-alcoholic fatty liver disease（非酒精性脂肪肝）、Apoptosis（細(xì)胞凋亡）、HIF-1 signaling pathway（缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路）、Pancreatic cancer（胰腺癌）、Insulin signaling pathway（胰島素信號(hào)通路）、VEGF signaling pathway（VEGF信號(hào)通路）等糖尿病相關(guān)通路。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

2.6 “藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將篩選得到天花粉的活性成分、靶點(diǎn)及KEGG富集通路前10條通路導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖6 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接 分子對(duì)接結(jié)合能若≤-7.0 kcal/mol表明有較好的結(jié)合能力。通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)Cucurbitacin D僅與TNF結(jié)合能＞-7.0 kcal/mol，與STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、EGFR、PPARA等9個(gè)核心蛋白的結(jié)合度均較強(qiáng)。其中，Cucurbitacin D與PIK3CA的結(jié)合能高達(dá)-9.2 kcal/mol。此外，Geranylacetone與MAPK14的結(jié)合度也較高，擁有較好的結(jié)合能力。見圖7。

圖7 分子對(duì)接熱圖及高結(jié)合度“分子-蛋白”結(jié)合圖（TOP 3）

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》有論及糖尿病具有內(nèi)熱消渴的特點(diǎn)［5］。天花粉，又名栝樓根，《神農(nóng)本草經(jīng)》中有對(duì)其作用的描述“主消渴，身熱，煩滿，大熱，補(bǔ)虛安中，續(xù)絕傷”，可見天花粉治療內(nèi)熱消渴的糖尿病由來(lái)已久?！秱s病論》中也提及天花粉養(yǎng)陰止渴法治療糖尿病的經(jīng)方，如栝樓牡蠣散、栝樓瞿麥丸等［6］。

研究表明，天花粉和多數(shù)中藥一樣通過多種組分、多個(gè)靶點(diǎn)和多條通路發(fā)揮高效低毒的預(yù)防和治療作用［7］。中藥擁有整體性、系統(tǒng)性多點(diǎn)作用治療帶來(lái)優(yōu)越性，但所涉及復(fù)雜的化學(xué)成分和多樣的藥理作用的問題，也為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制帶來(lái)了巨大的難度［8-9］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立在高通量數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，使用算法計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，生成“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)而闡述藥物治療疾病的具體途徑，為傳統(tǒng)中藥研究提供新的思路［10］。液質(zhì)聯(lián)用則從整體的角度出發(fā)，系統(tǒng)解析天花粉的化學(xué)成分組成，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)提供更為精準(zhǔn)的分析數(shù)據(jù)，為通路作用機(jī)制的探索打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)快速解析得到天花粉存在以Benzaldehyde、L-Citrulline、Dibutyl Phthalate、Cucurbitacin D、Geranylacetone、Methyl Pentadecanoate等為代表的活性成分。其中Cucurbitacin D通過調(diào)節(jié)JAK/STAT3、PI3K/Akt/mTOR和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)凋亡，這可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制［11］。L-Citrulline通過胰島素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路影響血壓調(diào)節(jié)、降脂和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，在糖尿病和相關(guān)并發(fā)癥的防治中發(fā)揮重要作用［12］。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、TNF、EGFR、PPARA等可能為天花粉發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn)。研究表明，STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)與細(xì)胞存活、增殖、激活和分化相關(guān)的基因的表達(dá)，并在胰島發(fā)育和胰島素分泌中發(fā)揮重要作用［13］。AKT1是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的重要組成部分，參與遷移、增殖、生長(zhǎng)和存活的細(xì)胞過程，并在葡萄糖代謝中起到重要作用［14］。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，天花粉可能主要通過氧化還原酶等潛在分子功能以調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化應(yīng)激生物學(xué)過程，作用于涉及細(xì)胞膜等細(xì)胞組分方面以及脂質(zhì)代謝等生物學(xué)進(jìn)程，從而發(fā)揮防治作用。為進(jìn)一步探究天花粉防治糖尿病的分子機(jī)制，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向用藥和新藥的開發(fā)，采用KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高置信度的相關(guān)靶點(diǎn)主要集中在胰島素抵抗、內(nèi)分泌抵抗、胰島素信號(hào)通路、胰腺癌等以胰島素為核心的通路，這些通路被證實(shí)和糖尿病具有高相關(guān)性［15］。天花粉防治糖尿病亦與TNF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等氧化應(yīng)激通路和細(xì)胞凋亡通路相關(guān)。此外還與非酒精性脂肪肝、VEGF信號(hào)通路等關(guān)聯(lián)性疾病通路存在一定的聯(lián)系。較多研究表明，HIF-1通路與糖尿病有關(guān)，HIF-1α對(duì)于維持胰腺β細(xì)胞的功能和存活很重要，且T1DM患者中HIF-2β的mRNA表達(dá)降低［16］。通過分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，天花粉可能主要通過Cucurbitacin D作用STAT3、MAPK14、PIK3CA等關(guān)鍵靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)改善糖尿病的效果。后續(xù)可結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬、人工智能等方法進(jìn)一步探究其機(jī)制［17-18］。

通過液質(zhì)聯(lián)用聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，天花粉可能通過Cucurbitacin D等活性成分調(diào)控以AGE-RAGE信號(hào)通路（在糖尿病并發(fā)癥中）、胰島素抵抗為代表的胰島素相關(guān)通路，提升胰島素的分泌和敏感性，從而作用于機(jī)體的細(xì)胞以調(diào)節(jié)血糖，預(yù)防糖尿病的發(fā)生或延緩糖尿病的發(fā)展，平衡機(jī)體血糖等重要組分以形成穩(wěn)態(tài)，達(dá)到防治糖尿病的作用。