莧黃洗劑的質(zhì)量控制

高 珊

唐山市婦幼保健院藥劑科，河北 唐山 063000

莧黃洗劑是唐山市婦幼保健院根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)所得的自制制劑(冀藥制字Z20050596)，該處方由馬齒莧、苦參、黃柏等組成，具有清熱解毒、燥濕祛疹的功效。自獲得批準(zhǔn)文號(hào)以來，該制劑已治愈上千余人。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有苦參堿和鹽酸小檗堿的薄層鑒別，未見含量測(cè)定方法，存在不足。為有效控制制劑質(zhì)量，保證用藥安全，本試驗(yàn)對(duì)苦參堿和鹽酸小檗堿的鑒別方法進(jìn)行了改進(jìn)，并新增HPLC法同時(shí)測(cè)定苦參堿和鹽酸小檗堿的含量[1-4]，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為該制劑的質(zhì)量控制提供了保證。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，配備LC-20AT泵、SL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、島津LC solution 色譜工作站(日本島津公司)、SPD-20A紫外可見光檢測(cè)器；UV-2501PC紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；BP211D電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

苦參堿對(duì)照品(批號(hào)：110805-200005)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-200609)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所；莧黃洗劑(批號(hào)：200717、200905、201016)由唐山市婦幼保健院制劑室制備(冀藥制字Z20050596)；乙腈為色譜純(天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；水為重蒸餾水；磷酸為分析純。

2 鑒別

2.1 苦參堿 取本品10 mL，加濃氨試液2.5 mL，用氯仿振搖，提取2次，每次15 mL，合并氯仿提取液，過濾，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取苦參堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇(10∶6∶1∶1)為展開劑，置氨蒸汽飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以改良的碘化鉍鉀試液。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色斑點(diǎn)。表明無干擾，結(jié)果如圖1所示。

2.2 鹽酸小檗堿 取本品10 mL，加濃氨試液 2.5 mL，用氯仿振搖，提取2次，每次15 mL，合并氯仿提取液，過濾，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)為展開劑，置氨蒸汽飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和20 min后，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)。無干擾，結(jié)果如圖2所示。

1、3、5：樣品；2：鹽酸小檗堿；4：陰性圖2 鹽酸小檗堿TLC圖

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×150 mm)，5 μm；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH6.8，v/v=45∶55)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；苦參堿、鹽酸小檗堿分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以鹽酸小檗堿算大于4000。

3.2 溶液制備 標(biāo)準(zhǔn)品溶液：用天平精密秤取鹽酸小檗堿對(duì)照品10.6 mg和苦參堿對(duì)照品11.6 mg，置于50 mL容量瓶中。用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液：取莧黃洗劑10 mL，加入濃氨水2.5 mL，并用三氯甲烷進(jìn)行振搖萃取3次，每次15 mL。將萃取液歸并、過濾，濾液蒸干。用甲醇溶解殘?jiān)⒎湃? mL容量瓶中，稀釋至刻度，用0.45 μm針式濾器過濾，即得。

陰性樣品溶液：按莧黃洗劑處方構(gòu)成分別制備不含苦參和黃柏的陰性樣品，按照配制樣品溶液的方式進(jìn)行操作，即得。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL、樣品溶液20 μL、陰性樣品溶液各20 μL，根據(jù)“3.1”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)3種溶液進(jìn)樣，如圖3所示，陰性樣品在相應(yīng)的苦參堿及鹽酸小檗堿處無色譜峰，無干擾。

A.對(duì)照品；B.樣品；C.缺黃柏陰性樣品；D.缺苦參陰性樣品；1.苦參堿；2.鹽酸小檗堿圖3 高效液相圖

3.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL，放入10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖晃至均勻，即得。根據(jù)“3.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣，記下色譜圖并測(cè)定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用最小二乘法線性回歸分析對(duì)曲線進(jìn)行矯正，得苦參堿和鹽酸小檗堿的回歸方程式：Y=1.7585×104X+2，275×103，r=0.9999；Y=4.0506×104X+5.825×103，r=0.9996結(jié)果表明，苦參堿濃度在11.6～174 μg·mL-1、鹽酸小檗堿濃度在10.6～159 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

3.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)“3.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣，持續(xù)進(jìn)樣6次，以計(jì)算苦參堿峰面積RSD為0.76%和鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.08%，說明此方式具有優(yōu)良的精密性。

3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同樣品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，得苦參堿和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為0.82%、1.32%，在2%范圍內(nèi)，說明溶液在24h內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次莧黃洗劑樣品6份(批號(hào)：200717)，根據(jù)“3.2”項(xiàng)制成樣品溶液，根據(jù)“3.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，測(cè)得苦參堿平均含量為77.2 μg·mL-1，RSD為1.22%(n=6)；鹽酸小檗堿平均含量為59.85 μg·mL-1，RSD為1.78%(n=6)。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量樣品6份(批號(hào)：200717)，每份5 mL，分別按低、中、高3個(gè)濃度加入苦參堿和鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，根據(jù)“3.2”項(xiàng)制成樣品溶液，根據(jù)“3.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，記下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，測(cè)得苦參堿平均加樣回收率98.66%、RSD值1.16%，鹽酸小檗堿平均加樣回收率98.09%和RSD值1.10%。符合《中國(guó)藥典規(guī)定范圍》，表明該方法測(cè)得含量準(zhǔn)確、可靠。

3.3.7 樣品含量測(cè)定 取莧黃洗劑3批次，每批3份，根據(jù)“3.2”項(xiàng)制成樣品溶液，進(jìn)樣并進(jìn)行含量測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (μg·mL-1，n=3)

4 討論

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是控制藥物制劑質(zhì)量的基本，只有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善與提升，才能更加安全、有效地控制制劑質(zhì)量。莧黃洗劑的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目較少，不能滿足現(xiàn)行質(zhì)量要求，故本試驗(yàn)完善莧黃洗劑的質(zhì)量控制，制定更加科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)比了以甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)和苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇(10∶6∶1∶1)為展開劑對(duì)苦參堿鑒別的影響，結(jié)果甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)為展開劑時(shí)，斑點(diǎn)不太清晰；甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)為展開劑時(shí)，展開后現(xiàn)象不明顯；以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇(10∶6∶1∶1)為展開劑，斑點(diǎn)清晰，展開效果好，且重現(xiàn)性好。

苦參堿和鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法有HPLC、毛細(xì)管電泳、紫外分光光度法等[5-9]，尋找一種高效、便捷、穩(wěn)定的檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)研發(fā)工作有重要意義。毛細(xì)管電泳、紫外分光光度法靈敏度低、易受其他成分影響、分離重現(xiàn)性差；HPLC法分離速度快、重復(fù)性高、分析精確度高，故本試驗(yàn)選擇使用HPLC法同時(shí)測(cè)定苦參堿及鹽酸小檗堿含量。

苦參堿及鹽酸小檗堿均為生物堿，在堿性溶液中處于游離狀態(tài)，能很好地溶于非極性溶劑，因此加入濃氨水堿化樣品。參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]選擇甲醇、75%甲醇和三氯甲烷作為提取劑，結(jié)果表明苦參堿及鹽酸小檗堿均能很好地被三氯甲烷萃取，故選擇三氯甲烷為提取劑。

對(duì)苦參堿和鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品分別在200～400 nm下進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示苦參堿在220 nm處有強(qiáng)吸收，而鹽酸小檗堿在227 nm和265 nm處均有強(qiáng)吸收。為提高檢測(cè)靈敏度，使兩組分在同一波長(zhǎng)下均有較好吸收且無干擾，故選擇225 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，在此波長(zhǎng)下，苦參堿和鹽酸小檗堿分離良好，保留時(shí)間充足。

本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，考慮到HPLC條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的差異，分別考察了不同流動(dòng)相比例(35∶65、45∶55)、不同流速(1.0 mL·min、1.5 mL·min)和不同pH值(pH6.8、pH7.4)下兩種成分的出峰時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH6.8，v/v=45∶55)，流速：1.0 mL·min-1，分離效果和峰形更好，保留時(shí)間適中，基線穩(wěn)定。

5 小結(jié)

莧黃洗劑為治療火熱毒邪發(fā)于肌表皮膚所出的斑疹而設(shè)。全方以苦參清熱燥濕為君；黃柏瀉火解毒為臣。苦參主要含有苦參堿、氧化苦參堿、黃酮類等有效成分，黃柏主要含有鹽酸小檗堿、黃柏堿等。本試驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)莧黃洗劑中苦參堿和鹽酸小檗堿進(jìn)行定性鑒別，專屬性高、呈現(xiàn)性好；采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定苦參堿和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。優(yōu)化了莧黃洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，節(jié)約了時(shí)間，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，為更好地控制莧黃洗劑的質(zhì)量提供了科學(xué)、可靠的依據(jù)，可用于該制劑的工業(yè)生產(chǎn)。