馬齒莧中吲哚類生物堿的生物活性研究

蘭秀娟 郭勝男 王金煥 王呈玉 英錫相

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，又名長(zhǎng)命菜、五行草等，為藥食兩用植物[1]。馬齒莧生命力頑強(qiáng)，分布范圍廣泛，多見(jiàn)于田野路邊，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為世界上應(yīng)用最廣泛的藥用植物之一[2-3]。馬齒莧作為傳統(tǒng)中藥已經(jīng)有上千年的歷史，其味酸、性寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效。馬齒莧中含有多種化學(xué)成分，如生物堿[4-6]、黃酮[7，8]、有機(jī)酸[9]、萜類[10]等，具有抗氧化[11]、抗乙酰膽堿酯酶[12]、抗炎[13]等多種藥理活性。課題組長(zhǎng)期從事馬齒莧研究工作，其中生物堿類成分為馬齒莧活性成分之一，本文對(duì)課題組分離得到的吲哚類生物堿進(jìn)行生物活性研究。

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶障礙、認(rèn)知障礙和行為異常等癥狀，給患者身體帶來(lái)傷害，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[14]。研究[15]表明，抑制膽堿酯酶可以使乙酰膽堿堆積，興奮膽堿受體，改善AD患者學(xué)習(xí)和記憶能力。因此，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的馬齒莧吲哚類生物堿進(jìn)行了抗膽堿酯酶活性研究，為AD藥物的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，自由基氧化損傷被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森、AD等)的重要因素[16]，抗氧化作用可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療方法，故本文還對(duì)馬齒莧中吲哚類生物堿進(jìn)行了抗氧化活性研究，期望為馬齒莧中生物堿成分的深入研究提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 Oleraindole A、Oleraindole B、Oleraindole C、Oleraindole D、Oleraindole E、Oleraindole F及Oleraindole G(均由本實(shí)驗(yàn)室分離所得，純度>97%)，毒扁豆堿(上海瀚翔生物科技有限公司)，碘代硫化乙酰膽堿(ATCI)和乙酰膽堿酯酶(AChE)(大連美倫生物科技有限公司)，二硫代二硝基甲酸(DTNB)(上海金水生物科技有限公司)，磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉(上海國(guó)藥控股試劑有限公司)，1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)(美國(guó)sigma公司)，丁基羥基茴香醚(BHA)(上海祥瑞生物有限公司)，甲醇(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 HBS-1096A96孔酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Hitachi UV-3010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司)，十萬(wàn)分之一天平(瑞士METTLER)，HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 抗膽堿酯酶試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)改良的Ellman法測(cè)定各個(gè)化合物的抗膽堿酯酶活性。精密稱取oleraindole系列化合物及毒扁豆堿，用甲醇配制成五個(gè)系列濃度31.25 μM、62.5 μM、125 μM、250 μM和500 μM的樣品溶液。具體操作如下：于96孔酶標(biāo)板中加入140 μL的磷酸緩沖鹽溶液(0.1 M，pH=8.0，包含0.1 moL/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉)，20 μL的樣品溶液，15 μL的AChE(0.2 U/mL)，于37 ℃下孵育10 min后，加入10 μL的ATCI(15 mmoL/L)和10 μL的DTNB(15 mmoL/L)，于37 ℃下孵育20 min后，將96孔板置于酶標(biāo)儀中，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各組樣品的吸光度值。其中，以甲醇代替樣品溶液作為空白組，以毒扁豆堿代替樣品溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組。各化合物膽堿酯酶抑制率按下列公式計(jì)算(A代表吸光度)：

抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100%

2.2 抗氧化試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)使用DPPH自由基清除法測(cè)定各個(gè)化合物的抗氧化活性。精密稱取oleraindole系列化合物及BHA，用甲醇配制成10 μM、20 μM、30 μM、50 μM和100 μM五個(gè)系列濃度的樣品溶液。此外，DPPH溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，精密稱取適量DPPH，用甲醇配制成濃度為80 μM的溶液，全程避光操作。具體操作如下：將1 mL的樣品溶液與1 mL的DPPH溶液充分混合，于室溫、避光環(huán)境下放置10 min，將紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為517 nm后，測(cè)量樣品的吸光度值。其中，以甲醇代替樣品溶液作為空白組，以BHA代替樣品溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組，以1 mL甲醇與1 mL樣品溶液的混合溶液作為對(duì)照組。各化合物DPPH清除率按下列公式計(jì)算(A代表吸光度)：

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]× 100%

3 結(jié)果

3.1 各化合物抗膽堿酯酶活性 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，其抗膽堿酯酶活性結(jié)果如圖2所示，從活性結(jié)果中可以看出，oleraindole A至oleraindole G均表現(xiàn)出一定的抗膽堿酯酶活性，且各化合物對(duì)膽堿酯酶的抑制作用隨著化合物濃度的增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性的趨勢(shì)。

圖2 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G和毒扁豆堿的抗膽堿酯酶活性

表1所示結(jié)果為各化合物抗膽堿酯酶作用的IC50值，由此結(jié)果可知，oleraindole B 的抗膽堿酯酶活性最強(qiáng)，其IC50值為40.22 μM，與陽(yáng)性藥毒扁豆堿(IC50=37.92 μM)的活性相當(dāng)。在苷元結(jié)構(gòu)中，Oleraindole A 的活性次之，而在苯環(huán)上有兩個(gè)羥基取代的oleraindole C活性最弱。與苷元oleraindole B和oleraindole A 的活性相比，其苷類結(jié)構(gòu)即oleraindole E 、oleraindole D、oleraindole F和oleraindole G的活性均下降。

表1 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G和毒扁豆堿抗膽堿酯酶作用的IC50值

3.2 各化合物抗氧化活性 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G的抗氧化活性結(jié)果如圖3所示，從活性結(jié)果中可以看出，oleraindole A、oleraindole B、oleraindole C、oleraindole D、oleraindole G均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，且各化合物的抗氧化作用隨著化合物濃度的增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性的趨勢(shì)。

圖3 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G和BHA的抗氧化活性

表2所示結(jié)果為各化合物抗氧化作用的IC50值，由此結(jié)果可知，oleraindole C的抗氧化活性最強(qiáng)(IC50=7.49 μM)，oleraindole A的活性次之(IC50=9.68 μM)，且二者的抗氧化活性均優(yōu)于陽(yáng)性藥BHA(IC50=37.81 μM)。在苷元結(jié)構(gòu)中，oleraindole B的活性最弱(IC50=42.10 μM)。與苷元oleraindole A和oleraindole B的活性相比，其苷類結(jié)構(gòu)中，oleraindole G(IC50=41.87 μM)和oleraindole D(IC50=62.30 μM)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，而oleraindole F和oleraindole E的活性明顯降低。

表2 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G和BHA抗氧化作用的IC50值

4 討論

馬齒莧作為傳統(tǒng)中藥已經(jīng)有上千年歷史，其具有化學(xué)成分多樣性和藥理活性多樣性的特點(diǎn)，受到了學(xué)者們的關(guān)注。課題組長(zhǎng)期從事馬齒莧相關(guān)研究工作，從馬齒莧當(dāng)中分離出了多種化學(xué)成分，生物堿類化學(xué)成分作為馬齒莧活性成分之一，有必要對(duì)其生物活性進(jìn)行研究。

AD又稱老年癡呆，是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、執(zhí)行功能障礙、行為改變、人格改變等特征，病因迄今未明。膽堿能系統(tǒng)改變與AD的認(rèn)知功能損害程度密切相關(guān)，通過(guò)抑制膽堿酯酶來(lái)增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)傳遞是治療AD的有效方法之一[17]。研究[18]表明，生物堿類常表現(xiàn)出乙酰膽堿酯酶抑制作用，具有治療AD的潛力，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬齒莧中吲哚類生物堿進(jìn)行抗膽堿酯酶活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示oleraindole B的抗膽堿酯酶活性最優(yōu)，oleraindole A的活性次之，oleraindole C的活性明顯下降，通過(guò)比較各化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可以推斷化學(xué)結(jié)構(gòu)中-3″位置的取代基對(duì)活性影響較大，其中，當(dāng)-3″位置為疏水基團(tuán)甲氧基取代時(shí)，oleraindole B的活性最優(yōu)；當(dāng)-3″位置無(wú)取代基團(tuán)時(shí)，oleraindole A的活性次之；而當(dāng)-3″位置為親水基團(tuán)羥基取代時(shí)，oleraindole C的活性則明顯下降。與苷元結(jié)構(gòu)相比，oleraindole D至oleraindole G的抗膽堿酯酶活性均下降，說(shuō)明oleraindole系列的糖苷形式不利于化合物抗膽堿酯酶活性的發(fā)揮。

細(xì)胞受到氧化損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如精神分裂、帕金森氏癥、腦癱阿爾茨海默病)發(fā)生的重要因素，抗氧化作用可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的潛在手段，且研究[19]表明含有酚羥基基團(tuán)的生物堿類化學(xué)成分常具有較強(qiáng)的抗氧化活性。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬齒莧中吲哚類生物堿進(jìn)行抗氧化活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示oleraindole C的抗氧化活性最優(yōu)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中-3″和-4″位置含有兩個(gè)酚羥基；oleraindole A的-3″位置無(wú)酚羥基取代，其活性次之；而oleraindole B的-3″位置為供電子集團(tuán)甲氧基，使其抗氧化活性下降。與苷元結(jié)構(gòu)相比，oleraindole D-oleraindole G的抗氧化活性均下降，其中，oleraindole G的-6位有兩個(gè)葡萄糖取代，其抗氧化活性與oleraindole B的活性相當(dāng)。上述活性結(jié)果提示生物堿抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)中酚羥基的個(gè)數(shù)相關(guān)，酚羥基個(gè)數(shù)越多，抗氧化活性越強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)馬齒莧中吲哚類生物堿oleraindole A-oleraindole G進(jìn)行了抗膽堿酯酶活性及抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)oleraindole A既表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗膽堿酯酶活性，又表現(xiàn)出較優(yōu)的抗氧化活性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。此外，oleraindole B抗膽堿酯酶活性最佳，oleraindole C抗氧化活性最佳，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為吲哚類生物堿的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。