缺血性卒中無復流動物模型建立和多維度評價方案☆

楊馨漩 田昊 趙家慧 鄭麗娜 劉麗萍

血管再通是急性缺血性腦卒中治療的一個重要手段[1-2]。然而，約有一半的患者無法通過血管再通治療獲得良好神經功能預后[3]，稱為無效再通。約有1/4 的患者不能成功再灌注[4]。除責任血管再閉塞外，微血管循環障礙導致的無復流而不能獲得再灌注是主要的病理變化[5]。無復流機制尚不清楚，還需進一步的研究。既往研究中建立和評估腦無復流模型的方法各不相同[6-8]，所用小鼠品系及造模方式和缺血時間各有不同，沒有公認的方法。本研究目的是為了建立合適的腦無復流模型并對灌注減低進行多維度評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性C57BL/6 及BALB/c 小鼠（體質量25～30g，8～12 周齡）購買于斯貝福實驗動物科技有限公司（北京，中國）。實驗動物飼養于北京市神經外科研究所動物實驗室，飼養環境溫度（22±2）℃，光照/黑暗周期為12 h，小鼠可自由飲水和采食。實驗流程和動物福利保護嚴格按照實驗動物福利倫理法律法規執行。本實驗由北京市神經外科研究所實驗動物福利倫理委員會批準，批準倫理號為202002005和202201003。

共用雄性C57BL/6 小鼠16 只，5 只用于活體雙光子監測（其中2只顱骨窗質量差，成像差），5只用于C57BL/6 sham 組激光散斑血流監測，6 只用于C57BL/6 MCAO 組光散斑血流監測（其中1 只死亡）。BALB/c 小鼠37 只，8 只用于活體雙光子監測（其中3 只顱骨窗質量差成像差或死亡），5 只用于BALB/c sham組激光散斑血流監測，6只用于BALB/c tMCAO 1 h 組激光散斑血流監測（其中1 只死亡），7只用于BALB/c tMCAO 1.5 h 組激光散斑血流監測（其中2 只死亡），處死后用于評估全腦灌注改變及免疫熒光染色評估微血管灌注改變；5 只用于BALB/c sham 組行為學評估，6 只用于BALB/c tMCAO 1.5 h組行為學評估（其中1只死亡），處死后用于免疫熒光染色評估腦梗死面積。

1.2 方法

1.2.1 小鼠短暫性大腦中動脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型的制作 4%～5%異氟烷誘導小鼠進行深度麻醉， 1%～2%異氟烷維持麻醉。參照既往研究[9]，結扎和切斷頸外動脈遠端，并從頸外動脈殘端將6-0 硅膠涂層線栓（602256PK5Re，Doccol）插入頸內動脈。線栓進一步推進到有輕微阻力，從頸外動脈起始處進入頸內動脈約8～9 mm，即為大腦中動脈起始處。1 h 或1.5 h后，通過抽出線栓使大腦中動脈再通。假手術組（sham 組）進行除了插入線栓以外的操作。在手術和麻醉恢復期間，將小鼠放在加熱墊上，保持（37.0±0.5）℃。

1.2.2 激光散斑對比成像動態評估小鼠腦皮質血流變化 參考既往研究[10]使用激光散斑血流成像儀（RFLSI III，深圳瑞沃德生命科技有限公司）測量激光散斑對比成像圖。在缺血前、缺血期間以及再通后2 h 和24 h，對皮質灌注進行監測。感興趣區選在雙側大腦中動脈流域內。此外，計算梗死同側/對側腦血流的相對比例。

1.2.3 組織準備 建模后24 h，在處死前10 min通過尾靜脈注射100 μL 70 kD 的羅丹明B 異硫氰酸酯（RITC）-葡聚糖（R9379，sigma，5%W/V）。小鼠腦用4%多聚甲醛固定過夜，然后用含有30%蔗糖的4%多聚甲醛溶液固定48 h。使用冰凍切片機收集50 μm或30 μm厚的連續冠狀切片。

1.2.4 免疫熒光染色 免疫熒光染色用漂片，血管基底膜用抗膠原IV 抗體（1∶250，Abcam，ab19808）標記，用兔源抗MAP2抗體（1∶200，cst，8707S）染色來評估梗死區。將切片在含有5%山羊血清（Solarbio, SL038）和0.3% Triton X-100 的0.1 mol/L PBS中在室溫下封閉1 h。然后一抗4 ℃下孵育過夜，用PBS/Triton X-100 洗滌后，將切片與二抗在室溫下孵育1 h。二抗是山羊抗兔Alexa Flour 488（1∶500；Thermo Fisher Scientific，A-11008）。用PBS/Triton X-100 清洗后，用抗熒光衰減封片劑（Solarbio，S2100）封片。通過激光共聚焦顯微鏡（LSM 710；Zeiss，德國）獲得用于血管分析的Z-堆圖。MAP2染色的圖像用Vectra Polaris（PerkinElmer, Spokane,WA, United States）進行掃描。

1.2.5 梗死面積的量化 從前囟層面開始每隔7 張腦片選取一張30 μm 厚切片用于評估梗死面積，使用ImageJ（1.53t 版，美國NIH）計算MAP2陰性和全腦的面積。用梗死面積÷全腦面積，得到梗死面積與全腦的占比。

1.2.6 顱窗手術 用顱骨鉆在運動感覺皮質上方做一個直徑3 mm顱骨窗（右側，距Bregma點-3.0 mm，外側3.5～4.0 mm）。其余暴露顱骨表面用牙科水泥封閉，并用牙科水泥將定制頭件固定在顱骨上。

1.2.7 雙光子成像觀察大腦中動脈血流及測量微血管流速變化 在雙光子成像前一天制作顱內窗。在缺血前、缺血期間以及再通后2 h 和24 h，使用配備有MaiTai 雙光子激光器和20 倍水浸物鏡的雙光子顯微鏡（LSM 880, Axio Examiner；蔡司）進行成像。顯微鏡由ZEN 2011 軟件（黑色版，蔡司，德國）控制，在測量過程中，小鼠固定在定制金屬板上，并如造模所述保持麻醉狀態。在成像前10 min，從尾靜脈注射100 μL RITC-葡聚糖，并用800 nm 激光激發，以觀察血管。血管的Z-堆記錄為512 × 512 像素，幀掃描時間943.72 ms，覆蓋約425 μm×425 μm×120 μm 的體積。此外，每個Z-堆記錄10 幀。紅細胞的流速和流量通過線掃描獲得[11]，2000 循環，幀掃描時間為1.84 ms。

1.2.8 全腦灌注分析 從前囟對應腦平面開始，每7片腦切片選取一片30 μm 厚代表腦片，一共6 片腦片，封片后用Vectra Polaris (PerkinElmer，華盛頓州斯波坎，美國)儀器進行成像，使用Image J（1.53t，美國國立衛生研究院）軟件測量每個半腦切片的平均RITC-葡聚糖信號強度，并對其進行偽彩色化。該信號可評估腦組織灌注。此外，計算梗死同側/對側RITC-葡聚糖信號強度的比。

1.2.9 行為學評估 行為學評估在再通后24 h 進行，使用改良神經功能評分（modified neurological function score, mNSS）。mNSS 的評分標準為0～18分（分數越高代表損傷越嚴重）：0 分，正常；1～6分，輕度損傷；7～12 分，中度損傷；13～18 分，嚴重損傷[12-14]。

1.3 統計學方法統計分析及作圖采用GraphPad Prism（9.4.0 版）。數據使用D'Agostino & Pearson 檢驗進行正態性測試，用±s描述數據。正態分布數據用t檢驗比較，同一批小鼠多時間點血流數據比較用兩因素重復測量方差分析。非正態分布數據用Mann-Whitney檢驗分析。檢測水準α=0.05。

2 結果

2.1 腦無復流模型的建立

2.1.1 C57BL/6 sham 組和C57BL/6 tMCAO 1 h 組多時間點皮質灌注對比 激光散斑血流監測顯示，腦血流數據采用兩因素重復測量方差分析，發現組間（F=40.452，P＜0.001）、時間（F=73.712，校正P＜0.001）、時間與組間（F=22.798，校正P＜0.001）存在交互效應，故進行成對比較。分析發現大腦中動脈阻塞時，C57BL/6 tMCAO 1 h 組皮質灌注減少70.3%，而C57BL/6 sham 組減少11.3%。再通后2 h，C57BL/6 tMCAO 1 h組與C57BL/6 sham 組間的差異有統計學意義（P＜0.001）。當再通后24 h 時，兩組無統計學差異（P＞0.999）。見圖1和表1。

Fig.1 Scattered representative images of C57BL/6 mice sham group and tMCAO 1 h group at multiple time points showing cortical perfusion圖1 C57BL/6 小鼠sham 組和 tMCAO 1 h 組多時間點的散斑代表圖，顯示皮質灌注情況

Tab.1 Changes in cerebral blood flow in mice assessed by laser scatter contrast imaging（±s，n=5）表1 激光散斑血流儀評估小鼠腦血流變化（±s，n=5）

Tab.1 Changes in cerebral blood flow in mice assessed by laser scatter contrast imaging（±s，n=5）表1 激光散斑血流儀評估小鼠腦血流變化（±s，n=5）

1）與C57BL/6 sham 組比較，采用兩因素重復測量方差分析，P＜0.05；2）與BALB/c sham 組比較，采用兩因素重復測量方差分析，P＜0.05；3）與C57BL/6 tMCAO 1 h組比較，采用兩因素重復測量方差分析，P＜0.05。

分組C57BL/6 sham C57BL/6 tMCAO 1 h BALB/c sham BALB/c tMCAO 1 h BALB/c tMCAO 1.5 h術前100.0%±0.0%100.0%±0.0%100.0%±0.0%100.0%±0.0%100.0%±0.0%MCA閉塞中88.7%±9.8%29.7%±4.7%1）88.9%±9.8%30.1%±5.0%2）32.3%±9.2%2）再通2h 95.8%±11.4%51.5%±12.9%1）91.3%±2.5%63.3%±18.4%2）64.9%±8.7%2）再通24h 99.4%±8.5%96.3%±16.8%1）89.0%±5.3%79.9%±5.8%76.1%±9.8%2）3）

2.1.2 C57BL/6 與BALB/c 小鼠雙光子活體成像多時間點血流對比 見圖2。活體雙光子顯微鏡觀察中，C57BL/6 小鼠在大腦中動脈閉塞時，大腦中動脈主干遠端的血流在缺血期間方向逆轉（圖2C 大白箭頭指示），并且大腦中動脈流域內幾乎所有毛細血管血流仍然流動。大腦中動脈阻塞期間BALB/c 小鼠大腦中動脈遠端主干的血流幾乎停滯。BALB/c 小鼠大腦中動脈區域內大多數毛細血管是阻塞狀態，一些毛細血管在再通后2 h 和24 h后仍然阻塞。

Fig.2 Comparison of two-photon in vivo imaging of blood flow at multiple time points in C57BL/6 and BALB/c mice圖2 C57BL/6與BALB/c小鼠雙光子活體成像多時間點血流對比 A，顱窗位置示意圖，黑色圓圈示意顱窗位置，覆蓋了右側感覺運動皮質。B，顱窗的顯微鏡圖，標尺為500 μm。C、D，雙光子活體成像代表圖。C和D分別展示了C57BL/6 和BALB/c小鼠大腦中動脈阻塞時大腦中動脈遠端分支及大腦中動脈流域毛細血管的雙光子活體圖像，及再通2 h和24 h大腦中動脈流域毛細血管的雙光子活體圖像。白色大箭頭表示大腦中動脈血流反向，白色小箭頭示意毛細血管阻塞部位，標尺為100 μm。

2.1.3 BALB/c sham 組、BALB/c tMCAO 1 h 組和BALB/c tMCAO 1.5 h 組多時間點皮質灌注對比 激光散斑血流儀監測BALB/c 小鼠缺血再通期間血流情況，腦血流數據采用兩因素重復測量方差分析，發現組間（F=57.601，P＜0.001）、時間（F=96.178，校正P＜0.001）、時間與組間（F=15.960，校正P＜0.001）存在交互效應，故進行成對比較。分析結果顯示大腦中動脈阻塞時，BALB/c tMCAO 1 h 組與BALB/c tMCAO 1.5 h組皮質腦血流量下降無統計學差異（P＞0.999）。在再通后2 h，BALB/c tMCAO 1 h 組（P＜0.001）和BALB/c tMCAO 1.5 h 組（P＜0.001）與BALB/c sham 組的差異有統計學意義。再通后24h，BALB/c tMCAO 1 h 組與BALB/c sham 組無明顯差異（P=0.299），而BALB/c tMCAO 1.5 h 組與BALB/c sham組間的差異有統計學意義（P= 0.046）。見表1、圖3。

Fig.3 Scattered representative images of the BALB/c sham group，tMCAO 1 h and tMCAO 1.5 h groups at multiple time points showing cortical perfusion圖3 BALB/c sham組、tMCAO 1 h 和 tMCAO 1.5 h 組多時間點的散斑代表圖，顯示皮質灌注情況

2.1.4 C57BL/6 tMCAO 1 h組和BALB/c tMCAO 1.5 h組多時間點皮質灌注對比 表1 可見C57BL/6 tMCAO 1 h 組與BALB/c tMCAO 1.5 h 組腦血流量對比，腦血流實驗數據采用兩因素重復測量方差分析，發現組間（F=138.900，P＜0.001）、時間（F=88.026，校正P＜0.001）、時間與組間（F=49.680，校正P＜0.001）存在交互效應，故進行成對比較。結果顯示大腦中動脈阻塞時，C57BL/6 tMCAO 1 h 組與BALB/c tMCAO 1.5 h 組皮質血流下降無統計學差異（P＞0.999）；再通2 h 后，兩組血流比較仍無統計學差異（P=0.129）。而再通24 h 時，兩組間的差異有統計學意義（P=0.008）。BALB/c tMCAO 1.5 h 組較C57BL/6 tMCAO 1 h組在大腦中動脈再通24 h后皮質腦血流量多降低20.2%。

2.2 BALB/c 小鼠短暫性大腦中動脈閉塞1.5 h 導致腦無復流的多維度評價

2.2.1 全腦切片灌注評估 再通24 h 后，用全腦切片梗死側/對側羅丹明B 異硫氰酸酯-葡聚糖平均熒光強度表示腦灌注，結果顯示與BALB/c sham 組相比，BALB/c tMCAO 1.5 h 組再通后出現無復流。BALB/c tMCAO 1.5 h 組腦灌注量減少至75.1%，而BALB/c sham 組腦灌注量為100%，兩組間差異有統計學意義（t=9.221，P＜0.001，圖4A、B）。

Fig.4 Decreased cerebral blood flow due to transient middle cerebral artery occlusion in BALB/c mice for 1.5 h圖4 BALB/c 小鼠短暫性大腦中動脈閉塞1.5 h 導致腦血流量下降 A，活體灌注羅丹明B 異硫氰酸酯-葡聚糖后全腦切片示意圖（偽彩），切片時間點為再通24 h。B，定量A 圖中假手術組及tMCAO 1.5 h組再灌24 h的切片羅丹明B 異硫氰酸酯-葡聚糖的平均熒光強度，計算為梗死側/對側平均熒光強度比值，顯示全腦灌注情況。每組數量n=5，數據用平均值±標準差表示，*** P＜0.001，雙側t檢驗。C，激光散斑血流監測定量BALB/c 小鼠假手術組和tMCAO 1.5 h 組感興趣區（圖1A 中的方框所示意大腦中動脈流域）多時間點的腦血流灌注值，計算為與基線的比值。每組數量n=5，數據用平均值±標準差表示。* P＜0.05，*** P＜0.001，兩因素重復測量方差分析。D，雙光子圖方位的示意圖顯示顱骨窗的位置。E，雙光子拍攝血管的Z-堆3D 重建圖（425μm × 425μm×120 μm），血流用靜脈注射的羅丹明B 異硫氰酸酯-葡聚糖標記（紅色）。 F，E 圖中Z-堆血管圖的Z軸最大密度投影（比例尺100 μm）。G，缺血前基線、大腦中動脈閉塞術中、大腦中動脈再通2 h和大腦中動脈再通24 h血管圖的Z 軸最大密度投影，白色小箭頭示意阻塞部位（比例尺100 μm）。H、I，雙光子線性掃描代表圖。（H 為沿著毛細血管長軸掃描，I 為垂直于毛細血管長軸掃描）。J、K，定量大腦中動脈閉塞術中、大腦中動脈再通2 h和大腦中動脈再通24 h紅細胞流速（J）和流量（K）與缺血前基線的比值（占基線水平的百分比）。每組數量n=5，數據用平均值±標準差表示。** P＜0.01，*** P＜0.001，兩因素重復測量方差分析。

2.2.2 激光散斑血流監測 激光散斑血流監測腦血流數據采用兩因素重復測量方差分析，發現組間（F=102.52，P＜0.001）、時間（F=50.081，校正P＜0.001）、時間與組間（F=28.862，校正P＜0.001）存在交互效應，故進行成對比較。分析結果顯示再通2 h 后，BALB/c tMCAO 1.5 h組皮質血流與BALB/c sham 組的差異有統計學意義（P＜0.001，圖3C）。在再通后24 h 時，兩組間差異仍有統計學意義（P=0.026，圖4C）。

2.2.3 雙光子顯微鏡獲得的毛細血管Z-堆視頻和紅細胞流速流量 雙光子成像位置及方位見圖4D～F，顱骨窗位置位于右側感覺運動皮質區，成像范圍425 μm × 425 μm × 120 μm。雙光子成像顯示再通2 h 后，仍有部分毛細血管血流阻滯（圖4G 小白箭頭）；紅細胞流速數據采用兩因素重復測量方差分析，發現組間（F=28.221，P＜0.001）、時間（F=10.685，校正P＜0.001）、時間與組間（F=5.973，校正P=0.010）存在交互效應，故進行成對比較。紅細胞流量數據采用兩因素重復測量方差分析，發現組間（F=79.743，P＜0.001）、時間（F=5.501，校正P=0.010）、時間與組間（F=6.883，校正P=0.040）存在交互效應，故進行成對比較。分析發現BALB/c tMCAO 1.5 h 組紅細胞流速恢復到基線水平的97.7%，而BALB/c sham 組為基線水平的111.9%，兩組無統計學差異（圖4J，P＞0.999）。tMCAO 1.5 h 組紅細胞流量恢復到基線水平的79.0%，BALB/c sham 組為基線水平的119.6%，兩組無統計學差異（圖4K，P=0.050）。當再通后24 h 時，仍有部分毛細血管血流阻滯（圖4G 小白箭頭），tMCAO 1.5 h 組紅細胞流速降至基線水平的50.3%，BALB/c sham 組為基線水平的110.7%，兩組間差異有統計學意義（圖4J，P=0.010）。而tMCAO 1.5 h 組紅細胞流量降至基線水平的38.9%，BALB/c sham 為基線水平的119.2%，兩組間差異有統計學意義（圖4K，P＜0.001）。

2.2.4 高放大倍數的免疫熒光染色切片灌注評估更高放大倍率的切片免疫熒光染色顯示，毛細血管大量阻塞（圖5C）。50 μm 厚的共聚焦顯微鏡成像Z-堆圖（212.45μm × 212.45 μm）顯示，每個圖像區域內BALB/c tMCAO 1.5 h 組總的有灌注的毛細血管長度減少了約76%（BALB/c sham 組 997 μm ±103 μm ，BALB/c tMCAO 1.5 h組 241 μm ± 33 μm，t=7.016，P＜0.001），有灌注的毛細血管占據的總體積分數也減少了約76%（BALB/c sham 組0.0539 ±0.0055，BALB/c tMCAO 1.5 h 組0.0128 ± 0.0018，t=7.122，P＜0.001，圖5D和E）。

Fig.5 Transient middle cerebral artery occlusion in BALB/c mice for 1.5 h results in no cerebral microvascular re-flow圖5 BALB/c小鼠短暫性大腦中動脈閉塞1.5 h導致腦微血管無復流 A，MAP2染色顯示梗死區域（MAP2陰性區域），示意共聚焦成像所選感興趣區位置。B、C， A中位置梗死區毛細血管代表圖。B為假手術組，C為tMCAO 1.5 h組，切片時間點為再通24 h。圖示分別為羅丹明B異硫氰酸酯-葡聚糖（紅色）標記的有灌注的血管、抗膠原-IV抗體（綠色）標記所有的血管、羅丹明B異硫氰酸酯-葡聚糖和抗膠原-IV抗體的疊加，以及有灌注的血管的分析骨架（黃色）。比例尺50 μm。D、E，假手術組、tMCAO 1.5 h組再通24 h的切片總的有灌注的毛細血管長度（D）和有灌注毛細血管體積占比（E）的比較。切片為共聚焦拍攝的50 μm厚的Z-堆。每組小鼠數n=5，假手術組Z-堆圖數量為19，tMCAO 1.5 h組Z-堆圖數量為27。數據用平均值±標準差表示， *** P＜0.01，雙側t檢驗。

2.2.5 梗死面積和行為學評估 用微管蛋白2 染色來評估缺血再通24 h 后的梗死面積，結果顯示BALB/c tMCAO 1.5 h 組再通24 h 時梗死面積占全腦面積約36%（圖6A、B），用mNSS評分評估血再通24 h后的行為學評分，結果顯示BALB/c tMCAO 1.5 h組再通24 h時表現為中度行為學缺損，評分平均為9分（圖6C）。

Fig.6 Transient middle cerebral artery occlusion in BALB/c mice for 1.5 h results in cerebral infarction and behavioural deficits圖6 BALB/c 小鼠短暫性大腦中動脈閉塞1.5 h 導致腦梗死及行為學缺損 A，MAP2染色顯示假手術組、tMCAO 1.5 h 組梗死區域的代表圖（MAP2 陰性區域，黃線勾畫）。B，柱狀圖顯示假手術組、tMCAO 1.5 h組再通24h時的梗死面積占比。每組數量n=5，數據用均值±標準差表示，***P＜0.001，雙側t 檢驗。C，柱狀圖顯示假手術組、tMCAO 1.5 h 組再通24 h 的mNSS 評分。每組數量n=5，數據用平均值±標準差表示，***P＜0.001，雙側t檢驗。

3 討論

本研究發現BALB/c tMCAO 1.5 h 與既往研究中常用的C57BL/6 tMCAO 1 h相比更適合用于無復流模型的建立，它所導致的腦灌注量下降更為明顯，無論皮質還是全腦灌注量均明顯下降。結合切片全腦灌注評估、激光散斑血流監測活體評估皮質腦血流量、雙光子活體成像評估大腦中動脈流域皮質表面毛細血管血流，以及高倍率切片成像評估毛細血管灌注對BALB/c 小鼠短暫性大腦中動脈閉塞1.5 h 導致的腦灌注下降以及毛細血管無復流進行多維度評估。本研究的數據提供了建立和評估腦無復流模型的合適條件，為后續腦無復流的動物研究提供了參考。

既往研究中，短暫性遠端或近端大腦中動脈閉塞用于建立腦無復流模型。在短暫性遠端大腦中動脈閉塞中，用血栓阻塞大腦中動脈遠端主干或外力阻斷大腦中動脈[8,15]，然后靜脈注射阿替普酶溶栓[7]或松解外力實現再通。在短暫性近端大腦中動脈閉塞中，用線栓阻塞大腦中動脈。近年，急性缺血性卒中機械取栓術后出現無復流一直是熱點話題，而近端大腦中動脈閉塞更接近臨床情況。因此，我們選擇了血管內線栓阻塞大腦中動脈來建立腦無復流模型。至于缺血時間，既往研究中從30 min到2 h不等，所用實驗動物品種也多樣，包括C57BL/6、BALB/c、CB-17、SV129 和瑞士白化病小鼠等[6-7,16-18]。在血管內線栓阻塞大腦中動脈模型中，缺血少于1 h 會導致梗死體積不穩定[19]。同時，無復流與較長的缺血時間有關[20]，但較長的缺血時間會導致高死亡率。不同品系小鼠對缺血的敏感性也不同[21-24]。既往研究最常用C57BL/6 小鼠缺血1h[6,8,10]，因此我們首先嘗試了此條件。然而，我們發現再通24 h 時，激光散斑血流監測顯示C57BL/6 sham 組和C57BL/6 tMCAO 1 h 組之間大腦中動脈流域皮質腦血流量無顯著差異（圖1和表1）。

雙光子成像進一步評估顯示大腦中動脈阻塞期間，C57BL/6 小鼠大腦中動脈遠端主干血流反向，大腦中動脈區域內大多數毛細血管中仍有血液流動。上述結果表明，C57BL/6 不是評估腦無復流的理想品系。考慮到側支循環差可能與無復流有關，臨床患者大多側支代償較差，并且與C57BL/6相比，BALB/c 小鼠側支代償較差[25]，可能更貼合臨床患者情況，因而我們轉向BALB/c 小鼠。雙光子成像顯示BALB/c 小鼠大腦中動脈阻塞期間，大腦中動脈遠端主干流動幾乎停滯，同時大腦中動脈區域內大多數毛細血管也是阻滯狀態，再通2 h和24 h時仍有部分毛細血管阻滯（圖2C、D）。所以BALB/c小鼠可能是更合適的選擇。

關于缺血時間，2 h 缺血意味著極高的死亡率，因此我們將缺血1 h和1.5 h組與BALB/c sham 組進行比較。結果顯示，再通后2 h 缺血1 h 和1.5 h 組均導致大腦中動脈流域皮質腦血流量降低。然而，到再通后24 h時，雖然BALB/c tMCAO 1 h組腦血流量較BALB/c sham 組下降，但差異無統計學意義。而BALB/c tMCAO 1.5 h 組的腦血流量與BALB/c sham 組相比兩組間的差異有統計學意義（圖2B）。同時與前期常用的C57BL/6 tMCAO 1 h 相比，BALB/c tMCAO 1.5 h 在再通24 h 時，皮質腦血流量下降20.2%（表1）。因此，BALB/c 小鼠大腦中動脈閉塞持續1.5 h 可能更適用于評價腦無復流現象。這與前期研究一致，該研究表明，當近端大腦中動脈閉塞時間超過1h，血管再通后存在毛細血管的持續阻塞[17,26]。

無復流的評估包括激光散斑血流監測、激光多普勒、相位分辨光學相干斷層掃描、雙光子活體成像評估毛細血管停滯和流動狀態、低倍全腦切片量化組織灌注、高放大倍數的圖像評估毛細血管阻滯和熒光圖像量化紅細胞阻塞[7-8,15-16,27]。激光多普勒只能評估一個較小區域，激光散斑血流監測可以監測整個表面血流量，并計算感興趣區的血流量。然而，檢測范圍僅限于表面，無法到達深層組織。相位分辨光學相干斷層掃描可以測量深度為幾百微米的皮質表面紅細胞流速，雙光子激光掃描顯微鏡的Z-stacks + 時間序列可以獲取3D 血管網絡圖和血流視頻。此外，線性掃描還可以獲得所選血管的紅細胞流速和流量。相位分辨光學相干斷層掃描和雙光子激光掃描顯微鏡的缺點是測量范圍限制在小區域內。灌注后切片的低倍視圖可以評估全腦灌注。我們使用同側/對側羅丹明B 異硫氰酸酯-葡聚糖平均熒光強度比值來評估梗死側灌注減少的情況，類似于臨床使用計算機斷層掃描灌注或磁共振灌注的評估。切片的缺點在于它不是活體的評估。高放大倍數的圖像可以觀察到單根毛細血管阻滯，以及可以用熒光圖像量化紅細胞阻塞，反應微觀情況下毛細血管的灌注情況。

我們結合激光散斑血流監測、灌注后切片的低倍視圖、雙光子顯微鏡獲得的毛細血管Z-堆視頻和紅細胞流速流量，以及高放大倍數切片免疫熒光染色圖像來評估短暫性大腦中動脈缺血再通后腦灌注的變化。活體評估了表面皮質大腦中動脈流域腦灌注量及毛細血管血流情況，同時用腦切片評估了全腦灌注情況和微觀毛細血管的阻塞，從多維度較全面地評估了BALB/c 小鼠大腦中動脈缺血1.5 h后再通所致的毛細血管無復流和腦灌注下降，以支持此模型的可行性，并為腦無復流的動物研究評估提供了參考。

當然，我們研究也有一定局限性，只比較了常用的C57BL/6 和BALB/c 小鼠，可能有其他更適合的小鼠品系或轉基因鼠，將來可增加品系或設計轉基因鼠進一步研究；另外BALB/c 小鼠短暫性缺血1.5 h死亡率較高，使得實驗成本稍有增加。

總的來說， BALB/c 小鼠與C57BL/6 小鼠相比更適合用于無復流模型的建立。另外，在BALB/c小鼠中，與缺血1 h 相比，短暫性缺血1.5 h 所導致的腦灌注量下降更為明顯，無論皮質還是全腦灌注量均有明顯下降，更適合用于無復流模型的建立。我們建立和多維度評估腦無復流模型的合適方法，為后續腦無復流的動物研究提供了支持。