基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討甘草瀉心湯治療白塞病的作用機(jī)制

宋書珍，王旭光，宋世娜，孫萬晶，胡國冰*

德州市人民醫(yī)院，1 藥劑科，2 中醫(yī)科，德州 253000

白塞病（Behcet's disease，BD）是一種系統(tǒng)性炎癥疾病，以非特異性血管炎為主要病理損害［1］。臨床以復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、生殖器潰瘍、皮膚損害及眼部虹膜炎為主要特征，也可累及血管、神經(jīng)、心、肺、腎等全身多個組織/器官［2］。由于BD 臨床表現(xiàn)多樣，極易造成漏診和誤診。當(dāng)BD 累及血管、神經(jīng)、眼部等時，不僅診斷和治療的難度較大，其致殘率和致死率也較高。然而，目前臨床尚無有效的治療方法。西醫(yī)多依賴于生物制劑、免疫抑制劑和激素等控制患者的病情，但不良反應(yīng)較大，且停藥后患者易復(fù)發(fā)［3］。近年來，中醫(yī)藥在治療BD 方面發(fā)揮了較好的優(yōu)勢。研究表明［4］，中藥或中西醫(yī)結(jié)合治療BD 可提高治療總有效率、降低復(fù)發(fā)率。

甘草瀉心湯源于《傷寒論》，由炙甘草四兩、黃芩三兩、干姜三兩、半夏（洗）半升、大棗（擘）十二枚和黃連一兩組成［5］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，BD 屬于“狐惑病”范疇。“狐惑”作為中醫(yī)病名，首見于《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病脈證治第三》：“狐惑之為病，狀如傷寒，默默欲眠，目不得閉，臥起不安，蝕于喉為惑，蝕于陰為狐，不欲飲食，惡聞食臭，其面乍赤、乍黑、乍白，蝕于上部則聲喝，甘草瀉心湯主之”［6］。《金匱要略》中甘草采用生甘草，其清熱解毒力盛［7］。濕熱毒瘀互結(jié)為BD 發(fā)病的病理基礎(chǔ)，并貫穿該病始終［8］。因此，本研究中甘草采用生甘草。研究證實(shí)甘草瀉心湯治療BD療效確切［9-10］。然而，甘草瀉心湯的活性成分復(fù)雜。因此，甘草瀉心湯的作用機(jī)制研究具有較大的難度，且目前尚無甘草瀉心湯治療BD 的機(jī)制研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，通過系統(tǒng)藥理學(xué)、分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)等方式從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析藥物與疾病之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律，為中藥復(fù)雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的科技支撐［11］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索甘草瀉心湯的有效活性成分和BD 的潛在治療靶點(diǎn)，以期為甘草瀉心湯治療BD 的后續(xù)深入研究提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 甘草瀉心湯活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“半夏”“干姜”“黃芩”“甘草”“大棗”“黃連”為關(guān)鍵詞，檢索甘草瀉心湯中所有活性成分，根據(jù)各成分的代謝、吸收、分布、排泄等藥動學(xué)參數(shù)以及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選并獲取每味中藥的活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)。

1.2 BD 相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以“Behcet's disease”為檢索詞，通過人類基因綜合分析數(shù)據(jù)庫（ GeneCards，http：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org）、遺傳藥理學(xué)和藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫 （PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org）、生物信息學(xué)和化學(xué)信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（DrugBank，https：//go.drugbank.com/） 收 集BD 相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用R 4.1.0 軟件提取GeneCard、OMIM、PharmGkb 及DrugBank 數(shù)據(jù)庫中的所有靶點(diǎn)，所得并集即為BD 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 甘草瀉心湯治療BD 的網(wǎng)絡(luò)可視化分析

將篩選的甘草瀉心湯活性成分靶點(diǎn)與BD 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中，構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過基因/蛋白質(zhì)相互作用檢索工具（ STRING 11.5，https：//stringdb.org）數(shù)據(jù)庫（最低要求交互得分＞0.40，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.2 軟件中，運(yùn)用CytoNCA插件，以度中心性（degree centrality，DC）、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（local average connectivity-based method，LAC）為篩選條件，選擇大于中位值的數(shù)據(jù)，經(jīng)2 次篩選后得到甘草瀉心湯治療BD 的核心靶點(diǎn)。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

分別通過R 4.1.0 軟件和OmicShare 平臺（https：//www.omicshare.com/tools/）對甘草瀉心湯活性成分-BD 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，并將結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 甘草瀉心湯中活性成分和對應(yīng)靶點(diǎn)篩選

截至2021 年11 月，在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出甘草活性成分92 個，半夏活性成分13 個，干姜活性成分5 個，黃芩活性成分36 個，大棗活性成分29 個，黃連活性成分14 個，共189 個活性成分，去掉重復(fù)活性成分后共174 個。此外，174 個活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)共3225 個，去掉重復(fù)靶點(diǎn)，得到甘草瀉心湯靶點(diǎn)共247 個。

2.2 甘草瀉心湯活性成分靶點(diǎn)與BD 相關(guān)靶點(diǎn)交集

應(yīng)用Genecard、OMIM、PharmGkb、DrugBank 4 個數(shù)據(jù)庫檢索并取交集，共得到1006 個BD 相關(guān)靶點(diǎn)（圖1）。對藥物有效成分靶點(diǎn)與BD 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共得到60 個交集靶點(diǎn)（圖2）。

圖1 BD 靶點(diǎn)整合

圖2 甘草瀉心湯活性成分與BD 交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 甘草瀉心湯活性成分-BD 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將所得的甘草瀉心湯活性成分靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.2 軟件中，構(gòu)建甘草瀉心湯活性成分-BD 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖3）。通過CytoNCA 插件分析網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中DC≥10 的活性成分，發(fā)現(xiàn)甘草瀉心湯中與BD 關(guān)系最為密切的活性成分為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、刺槐素（表1）。

表1 甘草瀉心湯的主要活性成分

圖3 甘草瀉心湯活性成分-BD 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

設(shè)置交互得分＞0.40，得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖4）。包含57 個節(jié)點(diǎn)，726 條邊，平均DC 為25.5。將互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中，篩選得到甘草瀉心湯治療BD 核心靶點(diǎn)20 個，包括HMOX1、IFNG、CAT、EGF、VEGFA、PTGS2、CXCL8、TP53、IL1B、STAT3、SERPINE1、MPO、CCL2、SELE、ICAM1、VCAM1、MMP9、CASP3、NFKBIA、IL1A（圖5 和表2）。提示這些蛋白可能是甘草瀉心湯治療BD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 甘草瀉心湯治療BD 的核心靶點(diǎn)

圖4 甘草瀉心湯治療BD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 甘草瀉心湯治療BD 的核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 富集分析及 KEGG 通路分析

應(yīng)用R 4.1.0 軟件進(jìn)行GO 富集分析，得到條目共1697 個，其中生物過程（biological process，BP）1561 個， 細(xì)胞組分（cellular component，CC）26 個，分子功能（molecular function，MF）110 個，并對Q值排序后前 10 名進(jìn)行分析（圖6）。甘草瀉心湯活性成分治療BD 的相關(guān)靶點(diǎn)主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源的分子反應(yīng)、外源性凋亡信號通路、負(fù)向調(diào)節(jié)凋亡信號通路、負(fù)向調(diào)節(jié)外源性凋亡信號通路、活性氧的代謝過程、對藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)等生物過程；細(xì)胞組分分析表明，靶點(diǎn)主要與膜筏、膜微域、陷窩、囊腔、細(xì)胞質(zhì)膜筏、細(xì)胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒內(nèi)腔、細(xì)胞器外膜等組分有關(guān)；分子功能分析表明，靶點(diǎn)主要涉及血紅素結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、氧化還原酶活性、受體配體活性、信號受體激活因子活性、單加氧酶活性等，提示甘草瀉心湯可通過參與這些過程來發(fā)揮治療作用。

圖6 GO 富集分析柱狀圖（排名前10 位）

2.6 KEGG 信號通路富集分析結(jié)果

應(yīng)用OmicShare 平臺對共同靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG信號通路富集，Q值≤0.05 的富集結(jié)果共114 個，主要涉及血液流變學(xué)、病毒感染、炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)等。對Q值排序后前20 名進(jìn)行分析（圖7）。KEGG 富集最顯著的10 條通路分別為糖尿病并發(fā)癥AGE-RAG 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、 腫瘤通路（pathways in cancer）、白介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、麻疹通路（measles）、甲型流感通路（influenza A）、丙肝通路（hepatitis C）、恰加斯病通路（chagas disease）、弓形體病通路（toxoplasmosis）。這些結(jié)果提示甘草瀉心湯可能通過抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌水平、抗病毒及調(diào)控惡性腫瘤中蛋白多糖信號通路等方面發(fā)揮治療作用。

圖7 KEGG 信號通路富集結(jié)果（排名前20 位）

3 討論

甘草瀉心湯具有益氣和胃、消痞止痢、調(diào)和寒熱的功效，對治療BD 具有較好的臨床療效。國明俊等［12］運(yùn)用甘草瀉心湯治療27 名BD 患者，3 個療程后共治愈26 例，治愈率達(dá)96.3%。此外，未治愈1 例，經(jīng)中西醫(yī)結(jié)合治療后痊愈。半年內(nèi)未復(fù)發(fā)，半年后復(fù)發(fā)5 例，且經(jīng)治療后痊愈。本研究通過數(shù)據(jù)庫共檢索到甘草瀉心湯中主要活性成分174 個，其中槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、β-胡蘿卜素、刺槐素可能是治療BD 的主要活性成分。藥理研究發(fā)現(xiàn)［13-15］，槲皮素屬于黃酮類化合物，大量存在于蔬菜、水果以及中草藥中，具有抗炎、抗氧化等作用，可有效減輕葡萄膜炎［16］。此外，山柰酚［17］、漢黃芩素［18］、黃芩素［19］、β-胡蘿卜素［20］、刺槐素［21］也具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等藥理活性，對于BD 所致的器官損害具有治療潛力。

本研究中，甘草瀉心湯治療BD 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到HMOX1、IFNG、CAT、EGF、VEGFA、PTGS2、CXCL8、TP53、IL1B、STAT3、SERPINE1、MPO、CCL2、SELE、ICAM1、VCAM1、MMP9、CASP3、NFKBIA、IL1A 等核心靶點(diǎn)，蛋白類型涉及趨化因子、血管生成因子、過氧化氫酶等。IFNG基因編碼一種可溶性細(xì)胞因子，為 Ⅱ型干擾素類的成員，其突變與病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染以及幾種自身免疫性疾病的易感性增加有關(guān)［22-23］。STAT3基因可在調(diào)節(jié)宿主對病毒和細(xì)菌感染的反應(yīng)中發(fā)揮作用，該基因的突變與多系統(tǒng)自身免疫疾病有關(guān)［24］。研究表明［25］，CAT基因可在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，對維持氧化-抗氧化平衡至關(guān)重要。VEGFA 是一種具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞因子，其可激活胞外信號調(diào)節(jié)激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，促進(jìn)血管細(xì)胞的生長、增殖［26］。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）具有促進(jìn)表皮生長、增加細(xì)胞再生能力的作用［27］。劉洋等［28］通過建立大鼠胃潰瘍模型，發(fā)現(xiàn)甘草瀉心湯可減輕乙酸型胃潰瘍大鼠的胃黏膜損傷，這可能是通過升高EGF 和前列腺素E2，降低胃蛋白酶活性、抑制胃泌素分泌而發(fā)揮作用。以上結(jié)果在一定程度上證實(shí)了PPI 網(wǎng)絡(luò)分析核心靶點(diǎn)的可靠性，提示其可為進(jìn)一步研究甘草瀉心湯治療BD 的機(jī)制研究提供思路。

GO 富集分析結(jié)果表明甘草瀉心湯主要通過活性氧代謝、藥物代謝、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、免疫炎癥反應(yīng)等生物過程影響疾病病理過程。KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，甘草瀉心湯治療BD可能通過參與糖尿病并發(fā)癥 AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17 信號通路、丙肝病毒信號通路以及TNF 信號通路等。王國慶等［29］研究發(fā)現(xiàn)甘草瀉心湯可使?jié)冃越Y(jié)腸炎患者的IL-17、IL-23 表達(dá)水平下調(diào)。陳浩等［30］研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，與單純美沙拉嗪治療相比，美沙拉嗪聯(lián)合甘草瀉心湯進(jìn)一步降低了患者TNF-α、IL-8、IL-17、IL-23 的表達(dá)水平。這些研究結(jié)果在一定程度上與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度系統(tǒng)分析了甘草瀉心湯治療BD 的分子機(jī)制，共獲得174 個活性成分，60 個靶點(diǎn)，表明甘草瀉心湯可通過多靶點(diǎn)、多通路治療BD，為深入揭示其作用機(jī)制提供了生物信息學(xué)基礎(chǔ)。