于氏解郁調肝散微生物限度檢測方法考察*

梁林輝，章 斌**，蘆 珂，姚永秀，何 露

(1.雅安職業技術學院，藥學與檢驗學院，雅安市食品藥品應用開發工程技術研究中心，四川 雅安 625000； 2.華潤三九(雅安)藥業有限公司，四川 雅安 625000)

于氏解郁調肝散是由木香、大黃、陳皮、郁金、熊膽粉等中藥組成，按照一定的工藝制成的散劑。其來源于名老中醫于榮光的經驗處方，在經過祖傳驗方的基礎上，經多年臨床研究及中藥應用并明確病因病機后篩選出《萬病回春》木香調氣散，又經過多年臨床應用演變固定成于氏解郁調肝散處方[1-2]。該藥物主要用于肝郁、痰飲、瘀血所致的氣滯作痛、食入作脹、胃納不香、吐酸噯氣、便秘、腸風下血、癰疽惡瘡等及癥瘕積聚、痛風、糖尿病等患者見上述證候者[3]。

于氏解郁調肝散是成都高新伍德堂中醫診所的特色制劑，已臨床應用多年，療效顯著，安全性好。前期，本研究小組已經建立該制劑的含量檢測及定性鑒別方法，為該制劑的生產及質量控制提供了科學依據。考慮到微生物限度是保障口服制劑的安全的一項重要指標，且對含有抑菌作用的藥物進行微生物限度檢查時需考察抑菌性對檢查結果的影響[4]。本文依據2020版中國藥典[5]及參考文獻對該制劑微生物檢測方法適用性進行考察[6-7]，為一步加強制劑的質量控制，保證用藥安全，完善于氏解郁調肝散質量控制提供了參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

電熱恒溫培養箱DNP-9272(上海精宏) ；霉菌培養箱SHP-150 (北京中興偉業)；電子分析天平FA1004(上海力辰邦西儀器)；生物安全柜BSC-1600ⅡA2(蘇凈安泰)；超凈工作臺SW-CJ-2FD(蘇凈安泰)；立式蒸汽滅菌器DGLS-100B(登冠醫療)。

1.2 藥品與試劑

于氏解郁調肝散(成都黃在軍醫院，批號：20220601、20220602、20220603)；培養基及稀釋液：pH=7無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(廣東環凱，批號：220304A10)；胰酪大豆胨瓊脂培養基TSA(廣東環凱，批號：220302A10)；胰酪大豆胨液體培養基TSB(廣東環凱，批號：220202A10)；沙門葡萄糖瓊脂培養基SDA(廣東環凱，批號：220210A20)；麥康凱液體培養基(北京陸橋，批號：22022613)；麥康凱瓊脂培養基(北京陸橋，批號：22021810)；RV沙門菌增菌液體培養基(北京陸橋，批號：22030401)；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基(北京陸橋，批號：22020401)；腸道菌增菌液體培養基(北京陸橋，批號：22031601)；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(北京陸橋，批號：22021610)。其他試劑均為市售常規試劑。

菌種：所有菌種均來源中國醫學菌種保藏中心，購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 菌液制備

1)需氧菌菌液制備：取大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種至 10 mL TSB培養基內，依據藥典方法進行培養，然后用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每 1 mL 含菌量小于 100 cfu 的菌懸液。

2)酵母菌菌液制備：取新鮮白色念珠菌菌種接種至 10 mL 沙氏葡萄糖液體培養基中，依據藥典方法進行培養，然后同“2.1中1)”方法稀釋成每 1 mL 含菌量小于 100 cfu 的菌懸液。

3)霉菌菌液制備：取新鮮黑曲霉孢子培養物接種至SDA培養基中，依據藥典方法進行培養并收集孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%(體積分數)聚山梨酯80的pH=7.0無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液[3]。

2.2 供試液制備

稱取供試品 10 g，加入 100 mL 溫度低于 45 ℃、pH=7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，充分振搖混勻，制成10-1的供試液。取10-1供試液 10 mL，加入 90 mL 上述稀釋液中，得10-2供試液。同法制成10-3供試液。

2.3 需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法適用性試驗

A試驗組：將10-1供試液分裝至試管，10 mL/支，共5支；將 “2.1中1)”制成的5種菌懸液各 0.1 mL 依次加入對應的5支試管，混勻，使5種供試液中含菌量均低于 100 cfu/mL；取供試液 1 mL，注入 90 mm 的無菌平皿中，平行制備2個平皿，依據需氧菌的種類傾注適宜的TSA或SDA培養基，混勻，凝固，并逐日觀察計數。

B供試品對照組：取10-1供試液 10 mL 于試管中，加入 0.1 mL pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，后續同試驗組操作。

C陽性對照組：取5支裝有 10 mL 的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管，對應加入5種菌懸液各 0.1 mL，后續同試驗組操作。

D陰性對照組：取pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1 mL，注入直徑 90 mm 的無菌平皿中，后續同試驗組操作。

2.4 控制菌檢驗方法適用性試驗

因該制劑為含藥材原粉口服固體給藥劑，依據2020版《中國藥典》確認控制菌為大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌。

2.4.1 大腸埃希菌檢查

A試驗組：取10-1供試液 10 mL，加入 100 mL TSB中，加入大腸埃希菌菌液使含菌量不大于 100 cfu，混勻，依據2020版《中國藥典》進行接種、劃線培養。

B供試品對照組：取10-1供試液 10 mL，加入 100 mL TSB中，后續不加菌液。同試驗組操作。

C陽性對照組：取大腸埃希菌菌液加入 100 mL TSB中，含菌量不大于 100 cfu，后續培養同試驗組操作。

D陰性對照組：用pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，后續不加菌。同試驗組操作。

2.4.2 沙門菌檢查

A試驗組：稱取 10 g 供試品加入 100 mL TSB中，加入沙門菌使含菌量不大于 100 cfu，混勻，后續依據2020版《中國藥典》進行接種、選擇和分離培養。

B供試品對照組：取 10 g 供試品加入 100 mL TSB中，后續不加菌同試驗組操作。

C陽性對照組：取含菌量不大于 100 cfu 的沙門菌加入 100 mL TSB中，后續培養同試驗組操作。

D陰性對照組：取 100 mL TSB，后續不加菌。同試驗組操作。

2.4.3 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查

A試驗組：稱取 10 g 供試品加入 100 mL TSB中，混勻，于室溫培養 2 h。再用TSB培養基作為稀釋劑制成得10-2供試液，同法制成10-3供試液。取三種稀釋度供試液分別接種于 10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，依據2020版《中國藥典》進行接種、選擇和分離培養。

B供試品對照組：取上述實驗組中10-1培養物 1 mL 分別接種至2支 10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，分別加入含菌量均小于 100 cfu 的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌液，后續同實驗組操作。

C陽性對照組：取含菌量小于 100 cfu 的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌液分別加入 10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，后續培養同試驗組操作。

D陰性對照組：取 1 mL TSB，加入 10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，后續培養同試驗組操作。

3 結果

3.1 需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法適用性試驗結果

取于氏解郁調肝散(批號：20220601)，按照“2.3項”下分組及檢測方法，常規及稀釋檢測，供試品各實驗菌株結果如表1。需氧菌中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌回收率均不符合藥典要求，隨進行稀釋檢測；10-2供試液及10-3供試液需氧菌稀釋檢測結果如表2、表3。由表2、表3可知，需氧菌檢測需將樣品稀釋至1∶1000才能使所有實驗菌回收率滿足藥典要求。

表1 10-1供試液需氧菌、霉菌及酵母總數及回收率結果

表2 10-2供試液需氧菌總數及回收率結果

表3 10-3供試液需氧菌總數及回收率結果

3.2 需氧菌、霉菌及酵母菌計數方法適用性驗證

取于氏解郁調肝散2批(批號：20220602、20220603)，按照“3.1項”下所得稀釋倍數結果和“2.3項”下分組及檢測方法，驗證待測菌株并計算回收率，結果如表4。

表4 需氧菌、霉菌及酵母菌驗證回收率

3.3 控制菌檢驗方法適用性試驗結果

取三批于氏解郁調肝散，按照2.4項下分組及檢測方法進行檢測，供試品各控制菌檢測結果如表5。由表5可知，大腸埃希菌、沙門菌和耐膽鹽革蘭陰性菌在3個批次的實驗組和陽性對照組均檢出，供試品對照組和陰性對照組未檢出。可用常規方法進行控制菌檢查。

表5 控制菌檢測結果

4 討論

于氏解郁調肝散是含有藥材原粉的散劑，由于藥材來源、加工工藝、保存條件等影響，導致中藥飲片微生物污染嚴重，進而對含有藥材原粉成品制劑的微生物限度有較大的影響[8-9]。因此，需要完善中藥飲片的微生物限度標準，控制飲片的加工生產過程，保障藥品安全。2020版藥典增加了中藥飲片的微生物限度檢查法，從源頭加強制劑原料的質量控制，對中藥安全性、國際化有重要的意義。

于氏解郁調肝散中含木香、大黃、陳皮、郁金、熊膽粉等中藥，有文獻表明，藥典要求口服散劑需要檢測的項目有需氧菌、霉菌及酵母菌、大腸埃希菌、沙門菌和銅綠假單胞菌。木香提取物及揮發油對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌和糞腸球菌有較強的抑菌性[10-11]。大黃中蒽醌類化合物，特別是大黃素、大黃酸同樣有較強的抑菌作用，大黃素對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度只有 0.025 mg/mL[12-13]。陳皮和郁金含有大量揮發油，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌等也有明顯的抑制作用[14-15]，具有抗氧化、抗菌、保鮮等活性，可用做水果保鮮添加劑[16]；熊膽粉由黑熊膽汁干燥而來，主要成分為去氧膽酸、膽酸，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌有抑菌作用[17-18]。考慮到配方原料及制備方法可能造成的微生物限準確性差異，有必要建立并驗證于氏解郁調肝散微生物限度檢查方法。

制劑中含有藥材原粉，所以，本實驗排除了薄膜過濾法。首先考慮采用常規法及稀釋法，如果供試菌回收率不滿足要求，再考慮中和劑法。結果表明，于氏解郁調肝散對金黃色葡萄球菌、銅綠假單飽菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用，檢測金黃色葡萄球菌和銅綠假單飽菌需將樣品按1∶100稀釋，檢測枯草芽孢桿菌需將樣品按1∶1000稀釋。藥典規定，含有藥材原粉的口服制劑中需氧菌落總數不超過104，因此，可選擇制劑1∶1000稀釋度進行檢測[5]。可采用1∶10供試液進行霉菌及酵母菌檢測，滿足回收率在0.5～2范圍。控制菌采用常規方法進行檢驗即可滿足要求。

綜上所述，本研究所建立于氏解郁調肝散微生物限度檢測方法簡便易行、準確、重復性好，對于完善該制劑的質量控制和質量標準的建立提供了科學依據，為進一步制劑工業化生產和臨床應用奠定了藥學基礎。