基于網絡藥理學的金匱腎氣丸治療阿爾茨海默病機制研究

羅燕燕，季文瑩，孫 倩，馬琴國，張柏桃，王婷婷

（1.甘肅省中醫院藥學部，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學第二醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省中醫院心功能檢查科，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是首次被德國精神病學家和神經發病學家Alzheimer Alois發現并命名。AD 又稱老年癡呆，多發于65 歲以上人群，是一種慢性神經退行性疾病，以記憶力逐漸減退、認知功能發生障礙、行為異常和社交障礙為臨床表現[1，2]。據報道[3]，至2050 年，全世界范圍內AD 患者從當前的360 萬將增至3 倍。隨著不斷深入研究，AD 的發病機制逐漸明了，主要包括：膽堿能神經元假說、Aβ（β-淀粉樣蛋白）毒性假說、Tau 蛋白假說、炎癥假說、胰島素假說、氧化不平衡假說和基因突變假說等[4，5]，但其易受自然環境因素，比如：過渡金屬元素、空氣污染，人文環境因素，遺傳等多因素，具有難治愈性。雖然卡巴拉汀、加蘭他敏及多奈哌齊等乙酰膽堿酯酶拮抗劑的出現填補了治療AD 無效的空白，但此類藥物僅可以適度改善患者的癥狀，均達不到治愈病情的效果，且易產生耐藥性及副作用[4]。因此尋找毒副作用較小、能夠發揮多層次、多靶點的藥物也是當務之急，而中醫藥的整體性和多成分性的特點與AD 發病機制復雜性、綜合性的特征相吻合。淫羊藿苷、梔子苷、五味子藤莖提取物、積雪草乙醇提取物、荔枝核皂苷、枸杞子、六味地黃丸、滋養心臟湯、天麻鉤藤飲、還腦益聰方、開心散、六位地黃湯經實驗證實均對AD 有一定療效[6]。因此開展對中藥及其復方的研究治療AD 具有廣闊的研究前景。

金匱腎氣出自漢代醫圣張仲景的《金匱要略》，由桂枝、附子、熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉組成[7]，在1998 年出版的《中華人民共和國衛生部藥品準則·中藥成方制劑》中收錄的中成藥金匱腎氣丸增加了牛膝（去頭）和車前子[8]，其具有“溫補腎陽，化氣行水”之功效，臨床常用于治療肢體浮腫、腎陽不足、生殖功能減退、腰膝酸軟等疾病。現代藥理作用研究表明，其可通過調節AD 患者的神經系統及其機體激素水平[9]來發揮治療AD 的作用，但其物質基礎及作用機制仍不完全清楚。本研究通過構建“活性成分-靶點”多層次網絡，利用網絡分析并闡述金匱腎氣丸對AD 的干預及影響，從而更好地了解對金匱腎氣丸對AD 的治療作用。

1 資料與方法

1.1 金匱腎氣丸中化合物及靶點收集 借助中藥系統藥理分析平臺（TCMSP，http://old.tcmsp-e.com/index.php），分別以金匱腎氣丸全方的“熟地黃”“山藥”“牛膝”“車前子”“桂枝”“附子”“山茱萸”“牡丹皮”“茯苓”“澤瀉”為關鍵詞搜索化合物成分及其靶點，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性指數（DL）≥0.18 為條件篩選活性成分。

1.2 AD 靶點集的獲取及金匱腎氣丸治療AD 的潛在作用靶點預測 通過GeneCards 數據庫（http://www.genecards.org/），以“Alzheimer's Disease”作為關鍵詞，獲得疾病靶點集。利用R 軟件，將疾病靶點集與藥物靶點進行映射，提取二者交集靶點。

1.3 韋恩分析和蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建通過R 軟件中的“VennDiagram packages”分析活性成分靶標和疾病靶標的篩選結果，獲得治療AD 的靶標蛋白基因，將其輸入到String 數據庫（http://cn.string-db.org/）進行蛋白質相互作用分析并構建PPI網絡。

1.4 金匱腎氣丸治療AD 網絡建設與分析 利用Cytoscape 3.7.0 軟件構建“組分-靶標網絡”，以更直觀地分析用于疾病的藥物（化合物）的治療機制。

1.5 GO 分析和KEGG 分析 Gene Ontology（GO）數據庫（http://geneontology.org/）包括分子功能（MF）、生物過程（BP）、細胞成分（CC），可用于識別高通量基因組的生物學機制或轉錄組數據。本研究利用R軟件中的“ClusterProfiler”軟件包進行GO 和KEGG分析。GO 和KEGG 富集分析結果中，Y 軸代表途徑名稱，X 軸代表富集因子（目標基因中屬于該途徑的基因數量/背景基因集中所有途徑基因的數量）。氣泡大小表示屬于目標基因中途徑的基因數量。研究將閾值設置為P＜0.05。最后，再將KEGG 結果利用Cytoscape 構建KEGG 網絡，節點的大小代表富級的數量。

2 結果

2.1 金匱腎氣丸及四逆散活性成分及靶點預測TCMSP 數據庫得到金匱腎氣丸131 個活性化合物，如谷甾醇（sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、玉蘭脂素B（Denudatin B）、海風藤酮（Kadsurenone）、漢辛酚（hancinol）、亞麻酸乙酯（Ethyl linolenate）、丁子香萜（Mairin）、山奈酚（kaempferol）、兒茶素（catechin）、澤瀉醇B（alisol B）、澤瀉醇C（alisol C）、黃連素（berberine）、黃連堿（coptisine）、漢黃芩素（wogonin）、二氫楊梅素（Dihydrotricetin）、羥基蕪花素（Hydroxygenkwanin）、遠華蟾毒精（Telocinobufagin）、四氫雞腳木堿（Tetrahydroalstonine）、惰堿（gnavine）、菊石堿（jesaconitine）等，共得216 個化學成分靶點。

2.2 AD 蛋白基因靶點預測 利用GeneCards 數據庫得到8718 個AD 相關蛋白基因。

2.3 韋恩分析與PPI 網絡構建 將216 個靶點與AD靶點進行韋恩分析，得176 個個共同靶點。其后將176 個共同靶點輸入到String 分析并構建PPI 網絡（圖1）。在PPI 網絡中，以最低要求互動得分（minimum required interaction score）大于0.9 為篩選條件，節點代表由單個蛋白質編碼基因位點產生的所有蛋白質，邊代表蛋白質-蛋白質存在關聯，得到金匱腎氣丸蛋白質相互作用網絡圖涉及175 個節點，567 條邊，該網絡的平均度值為6.48，其后利用Cytoscape 軟件的NetworkAnalyzer 功能分析網絡中的拓撲參數，依據拓撲參數連接度（degree）、介度（betweeness）和緊密度（closeness）對化合物或靶點的重要性進行評估，度值越大表明參與生物功能越多，如HSP90AA1、MAPK1、AKT1、JUN、RELA、FOS、ESR1、MAPK14、MYC 等靶標，見圖2。

圖1 韋恩分析

圖2 PPI 拓撲網絡分析

2.4 金匱腎氣丸活性成分-靶點網絡分析 用Cytoscape 軟件構建活性成分-靶點網絡，見圖3。結果表明，金匱腎氣丸活性成分有谷甾醇、豆甾醇、玉蘭脂素B、海風藤酮、漢辛酚、亞麻酸乙酯、丁子香萜、山奈酚、澤瀉醇C、黃連素、黃連堿、漢黃芩素、二氫楊梅素、羥基蕪花素、遠華蟾毒精、四氫雞腳木堿、惰堿、菊石堿等，化學成分靶點有NOS2、PTGS1、PTGS2、DPP4、HSP90AA1、PRSS1、NCOA2、NCOA1、CALM1、HTR、ACHE、PGR NCOA2、NR3C2、PGR、NCOA2、AR、PPARG、DPP4、RXRA 等，活性化合物可以作用于多個靶點，多個生物活性化合物也可以作用于一個靶點。

圖3 化學成分-靶點網絡分析

2.5 GO 分析和KEGG 分析 對排在前10 的富集條目通過進行展示，見圖4，金匱腎氣丸共富集到176個生物過程，主要參與對藥物的反應（Reactions to drugs）、對氧化應激的反應（response to oxidative stress）、細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、細菌起源分子的反應，膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、膜區（membrane region）、DNA 結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、酰胺結合（amide binding）等。KEGG 通路富集分析到163 個條目，提示靶點主要與脂質與動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（Prostate cancer）等相關，見圖5。上述分析結果表明，金匱腎氣丸的主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝途徑中，“多成分、多靶點、多途徑”的相互調節是治療AD 機制。

圖5 KEGG 分析

3 討論

網絡藥理學是基于大數據融合，利用生物系統結合計算機網絡分析以了解藥物活性成分、靶標蛋白和疾病之間的潛在通路機制，這符合中醫藥治療疾病的整體觀念，為中藥的作用機制和藥效物質基礎研究提供了一個全新的視角和解決對策。研究發現，AD 發病機制與膽堿能神經元假說、Aβ（β-淀粉樣蛋白）毒性假說、Tau 蛋白假說、炎癥假說、胰島素假說、氧化不平衡假說和基因突變假說相關[4，5]，且具有難治愈性。當前，乙酰膽堿酯酶拮抗劑雖填補了治療AD 無效空白，但此類藥物只能適度改善患者癥狀，但均達不到治愈病情的效果，且易產生耐藥性及副作用[4]。成分-靶點網絡顯示，去氧穿心蓮內酯、水黃皮素、小檗堿、黃芩素、菠菜甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、白芥子苷等活性成分均可作用于HSP90AA1、MAPK1、AKT1、JUN、RELA、FOS、ESR1、MAPK14、MYC、EGFR、RXRA、IL6 等多個靶標，涉及脂質與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGERAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化等。研究也表明小檗堿可降低人神經膠質瘤H4 細胞及AD 兔模型中的β 淀粉樣蛋白含量，逆轉AD 轉基因小鼠模型中神經元突觸中的Aβ 淀粉樣的病理狀態、神經膠質增生及海馬神經變性[10]。也有研究發現[11]，小檗堿可有效降低誘癌素A 誘導的Tau 蛋白的過磷酸化，而磷酸化的過度表達會導致細胞內神經原纖維纏結（NFTs）破壞其調節軸突運輸的正常功能，并導致可溶性Tau 蛋白和有毒物質的形成。黃芩苷可影響抑郁癥病理生理學中腦結構中神經元活力和腦源性神經營養因子（BDNF）的表達水平，通過調節Bax，Bcl-2 和裂解的caspase-3 的表達，激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas 軸來保護內皮細胞免受AngⅡ誘導的內皮功能紊亂和氧化應激[12]。β-谷甾醇還可增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，在抗氧化酶合成時不產生急性、亞慢性毒性或異常，還可通過GABA/BDZR 機制降低過氧化氫酶活性表現出明顯的抗焦慮和抗驚厥作用[13]。

金匱腎氣丸作為溫補腎陽的經典方劑之一，中醫認為腎為先天之本，五臟陽氣之根，中醫學中所論述的“腎藏精”“主骨生髓”“腎主水”“腎主納氣”等功能、而腎陽虛的動物會出現一些未老先衰的癥狀如體質量下降、耐力低下、精神萎靡不振、反應遲鈍等一系列癥狀。近年來研究發現該方對AD 有一定療效，即“從腎論治”[14，15]。該方可通過調節下丘腦-垂體-性腺軸調節由氫化可的松建立腎陽虛模型大鼠血清中雌二醇（estrogen，E2）及T 的激素水平、干預期間神萎靡不振及反應遲鈍等癥狀改善。與之類似，該方還可通過下丘腦-垂體-腎上腺軸，逆轉“勞倦過度、房室不節”腎陽虛小鼠的促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質激素（ACTH）含量的降低，促使皮質類固醇激素激素水平正常化[16]。還可逆轉Aβ25～35 建立老年性癡呆大鼠模型皮質內支持感覺和運動神經元的存活等功能的NT-3 陽性神經元數目減少，起到防治老年性癡呆作用[17-20]。

綜上所述，金匱腎氣丸治療AD 的機制可能與脂質與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGERAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化等相關信號通路相關。目前在治療AD 表現出一定的療效，但是通過具體哪些通路尚未完全明確，而且對AD 致病機制目前還不明確，后續將結合藥效及臨床研究對化合物、靶點和通路，進行進一步驗證。