基于網(wǎng)絡藥理學探討川續(xù)斷治療類風濕關節(jié)炎的作用機制

喻 楊，何 吉，岑村紅，支太發(fā)，黃 聰，鄧 穎，羅進芳

（1.貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550002）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關節(jié)炎為特征的全身性慢性自身免疫性疾病，其病理改變以炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳、軟骨組織損傷為特征，臨床表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、僵硬、腫脹，疾病進展將會導致關節(jié)畸形和正常關節(jié)功能喪失[1]。目前，本病的確切病因以及病理機制仍未明確，臨床治療主要以糖皮質(zhì)激素、改善病情抗風濕藥、非甾體抗炎藥及生物制劑等藥物對癥治療，但這些藥物有許多不良反應，并且費用高昂。因此，探索RA 的有效治療方法至關重要。中醫(yī)認為RA 屬于“痹癥”的范疇，最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，治療以祛風散寒除濕，通絡止痛為主。川續(xù)斷，又名“接骨草”，因其能“續(xù)折接骨”而得名，具有補肝腎、強筋骨、安胎、止崩漏等功效，可用于治療腰膝酸軟、風濕痹痛、崩漏、胎漏、跌撲損傷等癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示[3]，川續(xù)斷具有保護心肌、抗骨質(zhì)疏松、抗骨折、抗衰老及保護生殖系統(tǒng)的功能。網(wǎng)絡藥理學將系統(tǒng)生物學、生物信息學、化學信息學等現(xiàn)代醫(yī)學技術結合起來，通過對中藥化學成分的收集，預測潛在的作用靶點，分析與疾病相關通路，建立“中藥-成分-靶點-疾病-通路”的網(wǎng)絡，在此基礎上闡明中藥的作用機制。近年來，由于能夠對藥物、靶點、疾病的相互關系進行系統(tǒng)分析，使得網(wǎng)絡藥理學成為中醫(yī)藥研究領域一個熱門課題。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法和分析手段探討川續(xù)斷抗類風濕關節(jié)炎的分子機制，為進一步開展川續(xù)斷治療類風濕關節(jié)炎的臨床和實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 川續(xù)斷活性成分及其作用靶點的篩選 從BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）、Herb 數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）中檢索川續(xù)斷的化學成分，并結合文獻報道補充喜樹堿、熊果酸[4，5]等有效成分，將所獲得的化合物在通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/index.php）進一步篩選，以類藥性指數(shù)（drug-likeness，DL）≥0.18 為條件篩選潛在的化合物。將成分導入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）去掉非人類靶點，進行藥物成分靶點預測。

1.2 RA 相關靶點的篩選 為了獲取RA 相關的治療靶點，以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞，在OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https://db.idrblab.net/ttd/）及GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中檢索并下載整理好與RA 相關治療靶點。

1.3 藥物活性成分-RA 共同靶點的篩選 為進一步研究川續(xù)斷與RA 潛在靶點之間的相互作用，將川續(xù)斷主要活性成分靶點與疾病靶點輸入Venn 在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/），取其交集，并以Venn 圖的形式展示藥物靶點與疾病靶點間存在的交集靶點。

1.4 構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡 將獲取的交集靶點上傳至String 在線平臺數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），以構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡模型。選擇Mutiple Protein，輸入共同交集基因，蛋白種屬選人類，最低相互作用閾值選定為中等，將游離節(jié)點隱藏，其他參數(shù)均保持默認設置，獲得PPI 網(wǎng)絡圖數(shù)據(jù)。下載PPI 網(wǎng)絡的TSV 文件，將其導入Cytoscape 3.9.1 軟件，并構建PPI 網(wǎng)絡圖。

1.5 藥物活性成分-RA 靶點生物功能與通路的富集分析 為了分析關鍵靶點參與的生物學過程以及信號通路，將得到的交集靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行進行基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義，并對篩選的結果進行可視化處理。

1.6 疾病-通路-靶點-藥物網(wǎng)絡圖的構建 應用Cytoscape3.9.1 軟件構建RA-通路-靶點-川續(xù)斷-川續(xù)斷成分網(wǎng)絡圖，并利用Cytoscape3.7.1 內(nèi)置的工具對有效成分及靶點進行分析，其中包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（closeness）等，并基于這些參數(shù)來確定核心靶點以及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結果

2.1 川續(xù)斷活性成分及其作用靶點的篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中根據(jù)DL≥0.18 篩選后共獲得11 個活性成分（表1）。將所得成分輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫進行藥物成分靶點預測，經(jīng)過篩選去重處理后共得到靶點178 個。將川續(xù)斷有效成分、有效成分基因導入Cytoscape3.9.1 軟件中，構建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖，見圖1。

圖1 川續(xù)斷活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

表1 川續(xù)斷的主要活性成分

2.2 RA 相關靶點的篩選 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中檢索出5319 個基因，選?。? 分的基因961 個；在OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索出42 個基因；在TTD 數(shù)據(jù)庫中檢索出128 個基因，共獲取1131 個基因靶點，復篩去除重復值后獲得1032 個基因靶點。

2.3 藥物活性成分-RA 共同靶點的篩選 將川續(xù)斷的活性成分和類風濕關節(jié)炎相關靶點導入Venn 在線軟件，取其交集并繪制Venn 圖（圖2），確定了交集靶點52 個，即川續(xù)斷活性成分抗類風濕關節(jié)炎作用的潛在靶點。

圖2 川續(xù)斷活性成分-類風濕關節(jié)炎靶點Venn 圖

2.4 構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡 為了更好地展示核心蛋白在PPI 中的調(diào)控作用，將下載的TSV格式文件導入Cytoscape3.9.1 進行可視化分析，并使用內(nèi)置的Cyto NCA 分析得到最終的PPI 網(wǎng)絡（圖3）。該網(wǎng)絡由49 個節(jié)點和263 條邊組成，其中節(jié)點的大小和顏色與靶點間連線有關，連線數(shù)目多，節(jié)點越大，度值越大；節(jié)點的顏色由淺色到深色轉變，對應的度值也逐漸變大。結果提示，川續(xù)斷對抗RA 的靶標中介度值最高的靶點分別為VEGFA、EGFR、IL2、MMP9、STAT3、HIF1A、CYP19A1、ESR1、CYP3A4、CYP2C19，度值分別為470、222、212、199、130、114、111、104、102、101，這可能是川續(xù)斷治療RA 的關鍵靶點。

圖3 川續(xù)斷-類風濕關節(jié)炎靶點PPI 網(wǎng)絡圖

2.5 藥物活性成分-RA 靶點生物功能與通路的富集分析 在GO 功能分析中，包括生物過程（biological processes，BP）、細胞組分（cellular components，CC）、分子功能（molecular functions，MF）。以P＜0.05 為依據(jù)，分別選取BP、CC、MF 中前10 的條目通過微生信平臺進行數(shù)據(jù)可視化處理，結果顯示川續(xù)斷對RA 的治療作用主要與平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、細胞遷移的正調(diào)節(jié)、基因表達的負調(diào)控、細胞外間隙、細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜、內(nèi)肽酶活性、酶結合、鋅離子結合等相關，見圖4。對54 個靶點進行KEGG 通路富集分析，篩選P＜0.05，選擇富集前17 的通路為候選通路，主要涉及到癌癥通路、鈣離子信號通路、血脂和動脈粥樣硬化通路、Ras 信號通路、Rap1 信號通路、化學致癌-受體激活通路等信號通路，見圖5。

圖4 GO 功能分析

圖5 KEGG 通路富集分析

2.6 疾病-通路-靶點-藥物網(wǎng)絡圖的構建 應用Cytoscape3.9.1 構建類風濕關節(jié)炎-通路-靶點-川續(xù)斷-川續(xù)斷成分網(wǎng)絡圖（圖6）。使用Cytoscape3.7.1 內(nèi)置的Network Analyzer 分析川續(xù)斷治療類風濕關節(jié)炎網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。川續(xù)斷治療類風濕關節(jié)炎的核心成分為Camptothecin、hederagenin、Ursolicacid 和beta-sitosterol 等（表2），最主要靶點為EGFR、VEGFA、STAT3、FGF2、MMP9、CASP3、MMP2、MET、ESR1 等（表3）。

圖6 類風濕關節(jié)炎-通路-靶點-川續(xù)斷-川續(xù)斷成分網(wǎng)絡圖

表2 川續(xù)斷主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

表3 川續(xù)斷主要活性成分靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

3 討論

RA 是一種以高發(fā)病率、高復發(fā)率、高傷殘率為特點的慢性炎癥性疾病。據(jù)報道[6]，RA 在全球的發(fā)病率為0.5%～1.0%，是成人最常見的慢性炎癥性疾病之一。近年來，傳統(tǒng)中草藥對RA 的治療效果越來越明顯，越來越受到廣大臨床及科研工作者的關注。但是中草藥的成分和作用機制還未明確，其應用受到限制。因此，探索川續(xù)斷對RA 的治療機制是十分必要的。本研究旨在運用網(wǎng)絡藥理學方法分析和研究川續(xù)斷緩解RA 的作用機制，為今后的應用提供依據(jù)。

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出了11 種川續(xù)斷有效活性成分，其中喜樹堿（Camptothecin）、常春藤皂苷元（Hederagenin）、熊果酸（Ursolicacid）以及β-谷甾醇（Beta-sitosterol）等7 種成分符合本篩選條件的靶點富集，可能是川續(xù)斷中最為重要的藥效成分。Ndjateu FST 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，從Barteriafistulosa中分離出來的的常春藤皂苷元對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。Choi J 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，常春藤皂苷元的鎮(zhèn)痛特性對RA 具有明顯的抑制作用。熊果酸是川續(xù)斷中研究比較多的一個活性成分，有研究表明[9]，熊果酸可通過核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路阻斷mptp 誘導的多巴胺能神經(jīng)元變性而發(fā)揮其抗炎活性。此外，熊果酸還可抑制TNF-α 誘導的p65 核轉位和IκBα 和AKT的磷酸化，逆轉TNF-α 誘導的P20、ACS 和NLRP3的上調(diào)，即通過NF-κB/NLRP3 炎癥小體途徑激活軟骨細胞，起到骨保護作用[10]。另外，熊果酸還能通過誘導轉錄因子特異性蛋白1（Sp1）介導的Noxa 表達升高和Mcl-1 的蛋白酶體降解增強，從而促進RA 滑膜成纖維細胞凋亡[11]?，F(xiàn)代藥理學研究證實[12]，β-谷甾醇具有治療類風濕性關節(jié)炎、免疫抑制、前列腺增生、高脂血癥等多種疾病的功效。β-谷甾醇通過抑制LPS 誘導的ROS 增加來抑制炎癥小體NLRP3 的激活，進而下調(diào)細胞中的IL-6、IL-8、IL-1β 和TNF-α 的表達，從而發(fā)揮抗炎作用[13]。Liu R 等[14]研究表明，β-谷甾醇通過增加γ-干擾素（interferon-γ，INF-γ）和減少白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）發(fā)揮其抗炎作用。由此推斷，川續(xù)斷的主要活性成分具有一定的抗炎作用，可能因此來改善RA 的癥狀，并為以后的研究提供了理論基礎。

本研究中川續(xù)斷與類風濕關節(jié)炎共同的52 個靶點，對PPI 網(wǎng)絡進行分析，篩選出5 個關鍵靶點，分別是VEGFA、EGFR、MMP9、STAT3、IL-2。VEGFA與RA 中血管翳的血管生成有關，在RA 的發(fā)病機制、病理變化和治療中發(fā)揮著重要作用。VEGFA 在滑膜巨噬細胞、微血管周圍的成纖維細胞和血管平滑肌細胞中顯著表達[15]。研究表明[16]，通過下調(diào)VEGFA 的表達抑制血管新生，可起到治療RA 的作用。EGFR 是一種細胞表面蛋白，與表皮生長因子結合，從而誘導受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，導致細胞增殖[17]。VEGFA 可與EGF、TGF-α、雙向調(diào)節(jié)素（amphiregulin，AREG）、上皮細胞有絲分裂蛋白（epithelialmitogen，EPGN）等多種配體相結合并發(fā)揮多種生物學功能，促進RA 的進展[18]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopmteinases，MMPs）是一種能夠降解細胞外基質(zhì)的鋅蛋白酶，會導致關節(jié)疼痛、腫脹、骨侵蝕和軟骨破壞等加重，其中MMP9 主要與骨侵蝕有關。研究表明[19]，MMP9 能夠降解細胞外基質(zhì)，導致肌纖維被破壞，并會釋放出炎癥因子進入關節(jié)液中，從而導致關節(jié)炎的發(fā)生。STAT3 是類風濕關節(jié)炎的關鍵致病因子，研究顯示[20]，通過抑制JNK1和STAT3 的磷酸化，可抑制JNK/STAT3 信號通路活化，從而對RA 模型大鼠的炎性損傷及骨組織病變起到保護作用。IL-2 屬于一種具有代表性的炎性趨化因子，Orozco Valencia A 等[21]研究顯示，IL-2 可以通過對T 輔助性細胞的分化產(chǎn)生影響，進而直接影響免疫反應過程。由此可見，川續(xù)斷可能通過調(diào)控RA 患者的VEGFA、EGFR、MMP9、STAT3、IL-2等關鍵潛在靶點對免疫系統(tǒng)、全身炎癥情況及骨侵蝕進行調(diào)節(jié)，以緩解RA 病情。

KEGG 通路富集分析顯示，川續(xù)斷治療RA 涉及到Pathways in cancer、IL-17、HIF-1 及AGERAGE 等信號通路。有研究表明[22]，RA 成纖維樣細胞異常增生，并展現(xiàn)出了類癌細胞特點，提示RA 成纖維樣滑膜細胞異常增生可能與癌癥相關通路有關，川續(xù)斷可通過癌癥相關通路對RA 發(fā)揮其治療作用。IL-17 參與RA 患者滑膜炎的正反饋調(diào)控，高表達可導致RA 患者滑膜組織處于缺氧狀態(tài)，促進血管形成，參與關節(jié)的炎癥、損傷[23]。IL-17 通路具有促進炎癥、血管生成和破骨細胞生成等生物學功能[24]，影響著RA 疾病的發(fā)展。HIF-1 由HIF-1α和HIF-1β 組成，HIF-1α 是低氧反應的關鍵調(diào)節(jié)因子之一，在骨建模、骨重塑和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。研究表明[25]，通過激活JAK2/STAT3 通路可促進破骨細胞分化。另有研究表明[26]，AGE-RAGE 信號通路在糖尿病及其并發(fā)癥的形成與發(fā)展中有著重要作用，AGEs 可以激活RAGE，會導致輕度全身性炎癥反應和氧化作用。由此推斷，川續(xù)斷可能是通過以上信號通路調(diào)節(jié)RA，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，川續(xù)斷可能通過喜樹堿、常春藤皂苷元、熊果酸以及β-谷甾醇等主要活性成分，作用于VEGFA、EGFR、MMP9、STAT3、IL-2 等核心靶點，通過Pathways in cancer、HIF-1、AGE-RAGE、IL-17 等信號通路，協(xié)同發(fā)揮對RA 的治療作用。這些結果可為川續(xù)斷治療RA 的作用機制研究提供新的思路，為今后的應用和發(fā)展奠定了理論基礎。