三種藥用植物來源的蜂蜜抗氧化和抗菌活性研究

張國志,韓凌云,李珊珊,鄭火青,胡福良

(浙江大學 動物科學學院,浙江 杭州,310058)

蜂蜜含有豐富的營養物質和生物活性成分,具有抗氧化、抑菌、抗炎等多種作用[1-2],是天然的抗氧化劑和抑菌劑。目前研究表明蜂蜜中約含有200種物質[3],其中80%的物質是大多數蜂蜜共有的,其他物質則取決于蜜源植物、蜂種、環境氣候、地理來源和貯存條件等[4]。蜜源植物種類豐富,因此形成了豐富的蜂蜜品種。

近幾十年來,不同植物和地理來源蜂蜜的抗氧化能力以及對臨床和食源性病菌的抑菌活性受到廣泛關注[5-11],而且抑菌活性被認為是決定蜂蜜品質的重要評價指標[12]。麥盧卡蜜被譽為新西蘭“國寶級”蜂蜜,是蜜蜂采集麥盧卡樹(Leptospermumscoparium)釀造而成。其中,甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)被認為是麥盧卡蜜中主要的抑菌成分。獨麥素(unique manuka factor,UMF)等級用來評估麥盧卡蜜的抑菌活性,該等級是以麥盧卡蜜殺菌活性的苯酚當量表示,等級越高,表明抑菌活性越強。麥盧卡蜜因其含有的獨特抑菌物質和強大的抗氧化能力成為國內外學者研究的熱點對象[13],并且目前其已被開發成醫療級蜂蜜,作為治療傷口感染的局部藥物制劑。DENG等[14]比較了蕎麥蜜和麥盧卡蜜的抗菌和細胞抗氧化能力,結果表明,蕎麥蜜對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性與麥盧卡蜜相當,而且蕎麥蜜的細胞抗氧化能力強于麥盧卡蜜。有研究比較了麥盧卡蜜、蕎麥蜜、石楠蜜、蜜露蜜和多花蜜的抗氧化能力,結果表明麥盧卡蜜的總酚含量和抗氧化能力顯著高于其他蜂蜜[6]。ZHANG等[15]研究指出茴香蜜、藿香蜜和石榴蜜對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌活性高于麥盧卡蜜(UMF 20+),但是其抗氧化能力低于麥盧卡蜜。GKOUTZOUVELIDOU等[6]比較了利姆諾斯島蜂蜜和麥盧卡蜂蜜對10種臨床相關細菌的抑菌活性,結果發現所有的利姆諾斯島蜂蜜均有抑菌活性,甚至一些蜂蜜樣品的抑菌活性與麥盧卡蜜(UMF 30+)相當。目前研究逐漸發現細菌對蜂蜜的敏感性與細菌的種類及蜂蜜的來源有關[16],所以對不同來源蜂蜜抑制多種細菌的研究很有必要,可以充分表征蜂蜜的抑菌活性。

植物的藥用特性可以通過蜂蜜傳遞[17-18],所以也有人將來源于藥用植物的蜂蜜作為研究目標[19-21]。基于本實驗室前期的中國蜂蜜的抑菌實驗篩查并結合蜜源植物的藥用特性,本研究最后選擇了3種抑菌活性較好的藥用植物來源的蜂蜜(茴香蜜、枸杞蜜和玄參蜜)進行抗氧化和抑菌能力的深入分析,以期發掘和開發具有抗氧化和抑菌活性較好的蜂蜜,并為蜂蜜在醫學方面研究和應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品的來源信息見表1,其中茴香蜜、枸杞蜜、玄參蜜由當地蜂農提供,麥盧卡蜜(UMF 20+)購自新西蘭海恩斯蜂業有限公司。所有蜂蜜樣品避光保存在-20 ℃冰箱直至分析。

表1 蜂蜜樣品的來源信息

實驗中使用的所有菌株:金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC 29213)、表皮葡萄球菌(StaphylococcusepidermidisATCC 12228)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC 19606)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)和白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 90028),上海北諾生物科技有限公司;福林酚,上海麥克林生化科技有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒[FRAP(ferric ion reducing/antioxidant power)法],上海碧云天生物技術有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

EL20 pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2550島津分光光度計,日本島津有限公司;Synergy HTX多功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜂蜜孢粉學鑒定

蜂蜜的植物來源鑒定參考BELAY等[22]的孢粉學分析方法并稍作修改。取10 g蜂蜜充分溶解在20 mL蒸餾水中,4 000 r/min離心10 min后去掉上清液,沉淀部分加20 mL蒸餾水再次離心,去掉上清液,最后底部留約0.5 mL 溶液,振蕩混勻。取20 μL樣液滴在載玻片上,蓋上蓋玻片,用濾紙吸去多余樣液。先在低倍鏡下找到花粉,然后換到高倍鏡下觀察花粉形態,隨機選取10個視野,且花粉總數不少于200個,統計計算花粉比例。計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.2 基本理化指標

蜂蜜的含水量用手持式折射儀測定。將10 g蜂蜜樣品溶解在75 mL蒸餾水中,用pH計在25 ℃測定樣品的pH值[23]。電導率參照GB/T 18932.15—2003蜂蜜電導率測定方法。配制500 g/L蜂蜜水溶液,在635 nm處測定吸光度(absorbance,Abs)。利用公式mm Pfund=38.70+371.39×Abs將吸光度轉化為Pfund單位(mm)[24]。參考ZHANG等[25]的方法測定蜂蜜中蛋白質含量。淀粉酶活性參照GB/T 183932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的測定方法 分光光度法》。

1.3.3 總酚含量

采用福林酚(Folin-Ciocalteu)比色法測定總酚含量[26]。以沒食子酸含量(0.04～0.24 mg/mL)繪制標準曲線,回歸方程為y=3.045x+0.022(R2=0.999 6)。結果表示為100 g蜂蜜中沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE),單位為mg GAE/100 g。

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

參考BUENO-COSTA等[12]方法,并作適當修改。取100 μL蜂蜜溶液(0.2 g/mL)與100 μL DPPH乙醇溶液(0.08 mg/mL,現配現用)混合,并在室溫下避光反應 30 min,在517 nm 波長下測定吸光度。以維生素C含量(5～50 μg/mL)繪制標準曲線,回歸方程為y=-28.539x+1.601(R2=0.998 8)。結果表示為每100 g蜂蜜中毫克維生素C當量(ascorbic acid equivalent,AAE),單位為mg AAE/100 g。

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考BICUDO DE ALMEIDA-MURADIAN等[27]的方法,并稍作修改。制備ABTS母液:將7.5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和132 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合并在室溫下避光反應16 h。在使用前,把ABTS母液稀釋為在734 nm處吸光度值為0.7～0.8。在96孔板中加入5 μL蜂蜜溶液(0.2 g/mL)和200 μL ABTS工作液,混勻后室溫避光孵育6 min,測定734 nm處的吸光度。Trolox溶液標準曲線為0.1～1.3 mmol/L,回歸方程為y=-0.369x+0.669(R2=0.999 8)。結果用mmol TE/kg表示(TE:Trolox equivalent)。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力(ferric ion reducing/antioxidant power,FRAP)測定

采用總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)檢測蜂蜜抗氧化能力。將5 μL 0.2 g/mL蜂蜜溶液和180 μL FRAP工作液混合均勻,然后在37 ℃孵育5 min,于593 nm處測定吸光度。以Trolox溶液(0.05～1.3 mmol/L)為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程為y=0.673x+0.008(R2=0.999 6)。結果表示為mmol TE/kg。

1.3.5 過氧化氫含量測定

參考ZHANG等[15]的方法,并稍作修改。稱量1 g蜂蜜樣品用蒸餾水定容至30 mL,然后用過氧化氫定量分析試劑盒(水兼容性)測定蜂蜜溶液中過氧化氫的含量。

1.3.6 抑菌能力測定

1.3.6.1 瓊脂擴散法

參考GUO等[28]的方法,并稍作修改。用無菌蒸餾水配制500 g/L蜂蜜溶液。取25 mL滅菌營養瓊脂培養基平鋪于75 mm的培養皿中使其冷卻凝固。在培養皿上涂布100 μL菌懸液(1×106CFU/mL),然后用打孔器在培養基上打直徑為8 mm的孔。向孔中加入100 μL待測蜂蜜溶液,以無菌水和10%(體積分數)苯酚溶液分別作為陰性對照和陽性對照。將培養皿置于恒溫培養箱中37 ℃培養18 h,最后使用游標卡尺測量抑菌圈的直徑(mm)。

1.3.6.2 微量肉湯稀釋法

參考GKOUTZOUVELIDOU等[6]和DENG等[14]的方法,并稍作修改。采用微量肉湯稀釋法測定蜂蜜樣品對微生物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。

采用兩倍稀釋法用LB肉湯培養基制備500.00、250.00、200.00、125.00、100.00、62.50、50.00、31.25、25.00、12.50 g/L 10個不同濃度的蜂蜜樣品溶液并將菌懸液稀釋至1×107CFU/mL。將180 μL被測蜂蜜溶液和20 μL菌懸液混合,加入96孔細菌培養板(未添加細菌的孔和未添加蜂蜜的孔分別作為陰性生長對照和陽性生長對照)。用酶標儀在600 nm處測量培養前和37 ℃培養18 h后的吸光度。蜂蜜抑制微生物生長的最低濃度為MIC。

取微量肉湯稀釋試驗中無明顯微生物生長的各孔10 μL懸液在營養瓊脂平板上培養,37 ℃孵育24 h,平板上無菌落出現的最低濃度為MBC。

1.4 數據處理

所有蜂蜜樣品均測定3個平行,結果以平均值(mean)±標準差(SD)表示。蜂蜜樣品之間的統計學差異(P<0.05)采用Tukey檢驗的方差分析。研究參數之間的相關性通過Pearson檢驗得到,在顯著性P<0.05的水平上用雙尾檢驗評估顯著性。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜理化性質分析

4種蜂蜜的孢粉學結果及基本理化參數見表2。單花蜂蜜要求主要花粉粒所占比例超過45%[29]。孢粉學結果表明麥盧卡蜜、茴香蜜、枸杞蜜和玄參蜜的相應蜜源花粉率為70.85%～82.65%,所以4種蜂蜜都為純度較高的單花蜂蜜。蜂蜜的含水量與天氣、季節、釀造時間等有關[30]。4種蜂蜜的含水量為16.50%～17.97%,都低于規定的蜂蜜最大含水量20%[31-32]。本研究中所有蜂蜜樣品的pH值均在ALJOHAR等[33]研究所指出的范圍內,即3.24～6.10。蜂蜜的電導率取決于蜂蜜的灰分(礦物質含量)和酸度[27],而且這一參數還被用作鑒定單花蜂蜜以及評價蜂蜜質量的一個重要指標[34]。本文中4種蜂蜜的電導率為247.67～453.67 μS/cm,均符合相關標準規定的最大值800 μS/cm[31-32]。蜂蜜的顏色受蜜源植物影響,此外其可能在貯存過程中發生變化(可能受貯存溫度以及蜂蜜成分的影響)[35]。淺色蜂蜜的味道清淡,深色蜂蜜的味道較濃郁[36]。本研究中4種蜂蜜的色值具有顯著差異(P<0.05),其中枸杞蜜的顏色最淺[(53.78±0.37) mm],麥盧卡蜜的顏色最深[(193.67±0.77) mm]。蜂蜜的蛋白質含量最低的是枸杞蜜[(4.63±0.26) mg/g],最高的則為茴香蜜[(9.49±0.12) mg/g],這與先前研究的意大利蜜蜂蜂蜜的蛋白質含量(2～16 mg/g)一致[37]。研究表明淀粉酶活性可以表征蜂蜜的新鮮度和加工程度[35]。麥盧卡蜜的淀粉酶值顯著低于其他3種蜂蜜。過氧化氫通常被認為是許多蜂蜜發揮抗菌作用的主要物質[38-39]。本研究中茴香蜜的過氧化氫含量最高,而麥盧卡蜜的過氧化氫含量最低,這可能是由于麥盧卡蜜中的MGO通過抑制葡萄糖氧化酶的活性,從而影響麥盧卡蜜中過氧化氫的含量[40-41]。蜂蜜中過氧化氫水平受多種因素的影響,如葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖和多酚自氧化過程可以產生過氧化氫,而過氧化氫酶、金屬酶、維生素C和芬頓反應可以降解過氧化氫[42]。

表2 蜂蜜樣品的理化參數

2.2 總酚含量和抗氧化能力分析

蜂蜜中的酚類物質來自于花蜜,是蜂蜜發揮抗氧化能力的主要成分[26]。總酚含量測定結果表明,麥盧卡蜜和茴香蜜的總酚含量相當(P>0.05),但顯著高于玄參蜜和枸杞蜜(表2)。本研究中麥盧卡蜜的總酚含量(862.28±27.01) mg GAE/kg高于DENG等[14]的結果(561.00±2.82) mg GAE/kg,與LIN等[20]和ALZAHRANI等[43]測定結果相似。何亮亮等[44]測定枸杞蜜的總酚含量為401～532 mg GAE/kg,高于本研究測定結果。蜂蜜的總酚含量受蜂蜜的地理來源、植物來源和氣候條件的影響[45]。由于蜂蜜氧化反應的復雜性,采用單一的抗氧化能力測定法評價蜂蜜抗氧化能力可能不準確[46],所以本研究采用清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和總抗氧化能力(FRAP)來表征4種蜂蜜的抗氧化能力(表2)。結果顯示,麥盧卡蜜的DPPH自由基清除能力[(24.20±0.30) mg AAE/100 g]和總抗氧化能力[(2.37±0.25) mmol TE/kg]顯著高于其他3種蜂蜜(P<0.05),但是其ABTS陽離子自由基清除能力[(5.23±0.42) mmol TE/kg]和茴香蜜[(6.01±0.64) mmol TE/kg]及玄參蜜[(4.87±0.28) mmol TE/kg]沒有顯著差異。玄參蜜的DPPH自由基清除能力[(21.93±0.29)mg AAE/100 g]顯著高于茴香蜜[(19.62±0.36) mg AAE/100 g],茴香蜜[(1.40±0.11) mmol TE/kg]的總抗氧化能力高于玄參蜜[(1.17±0.03) mmol TE/kg],但是無顯著差異(P>0.05)。

2.3 理化參數相關性分析

本研究采用Pearson檢驗分析了蜂蜜樣品理化參數之間的相關性,結果見表3。蜂蜜的含水量與色值和FRAP呈顯著正相關,與蛋白質含量、淀粉酶活性和過氧化氫含量呈顯著負相關。蜂蜜的含水量是表征蜂蜜成熟度的重要指標,在釀造過程中,蜂蜜的含水量下降,蛋白質含量和相關酶活(淀粉酶和葡萄糖氧化酶)升高[47]。TSAVEA等[48]研究也表明含水量與過氧化氫含量呈顯著負相關。pH值與淀粉酶活性呈極顯著相關(r=0.712,P<0.01)。電導率與多項參數之間具有顯著相關性,如蛋白質含量(r=0.685,P<0.05)、總酚含量(r=0.918,P<0.01)和抗氧化能力(r>0.757,P<0.01)等。蜂蜜的電導率與色值相關[49]。本研究中色值與電導率呈極顯著正相關(r=0.810,P<0.01),這是因為蜂蜜的顏色受礦物質含量的影響[35,50]。此外,色值與淀粉酶活性(r=-0.844,P<0.01)和過氧化氫含量(r=-0.730,P<0.01)呈極顯著負相關,與總酚含量(r=0.822,P<0.01)和抗氧化能力(r>0.727,P<0.01)呈極顯著正相關。總酚含量與DPPH自由基清除能力(r=0.932)、ABTS陽離子自由基清除能力(r=0.957)和FRAP(r=0.879),以及3種抗氧化方法之間(r>0.740)都存在很強的(P<0.01)線性相關關系。多項研究報道了蜂蜜的顏色與總酚含量和抗氧化能力有很強的相關性[51-53],并且總酚含量與抗氧化能力也密切相關[54-55]。蛋白質含量與ABTS陽離子自由基清除能力呈顯著正相關(r=0.679,P<0.05),說明蜂蜜中一些蛋白質具有抗氧化活性[56-57]。淀粉酶活性與DPPH自由基清除能力(r=-0.691,P<0.05)、FRAP(r=-0.665,P<0.05)和過氧化氫含量(r=0.821,P<0.01),FRAP和過氧化氫含量(r=-0.669,P<0.05)也明顯相關。

表3 蜂蜜理化參數之間的相關性分析

2.4 抗菌活性分析

蜂蜜樣品對微生物的抑菌圈直徑見表4。所有蜂蜜樣品均未對P.aeruginosa和C.albicans產生抑菌圈(圖1)。茴香蜜對S.aureus和A.baumannii產生的抑菌圈直徑分別為(20.32±0.32) mm和(11.53±0.17) mm,顯著高于其他3種蜂蜜(P<0.05)。ZHANG等[15]研究同樣表明茴香蜜對S.aureus的抑菌圈明顯超過麥盧卡蜜。枸杞蜜對S.aureus的抑菌圈與麥盧卡蜜相當(P>0.05)。麥盧卡蜜與茴香蜜對S.epidermidis產生的抑菌圈無顯著差異,但都顯著高于枸杞蜜和玄參蜜。此外,麥盧卡蜜對E.coli的抑菌圈顯著大于其他3種蜂蜜。

A-S.aureus;B-S.epidermidis;C-E.coli;D-A.baumannii;E-P.aeruginosa;F-C.albicans

表4 蜂蜜樣品對微生物的抑菌圈直徑(瓊脂擴散法)

雖然瓊脂擴散法具有簡單和快速等優點,但是該方法依靠的是擴散作用,蜂蜜中的大分子質量物質的擴散(如蜜蜂防御素-1等)可能會受到阻礙。微量肉湯稀釋法是抗菌劑與微生物直接接觸,還可實現對抗菌劑的定量分析[58]。4種蜂蜜對微生物的MIC和MBC值見表5。所有蜂蜜樣品對本研究中的微生物都有不同程度的抑菌活性。茴香蜜和枸杞蜜對S.aureus和A.baumannii的抑菌能力最好,MIC和MBC分別為50.00 g/L和100.00 g/L(對單一菌種的MIC和MBC相同),均低于麥盧卡蜜和玄參蜜。茴香蜜對S.epidermidis和P.aeruginosa的MIC和MBC均低于其他3種蜂蜜,表明茴香蜜對這3種細菌的抑菌能力最好。麥盧卡蜜對E.coli的抑菌能力最強,其在100.00 g/L濃度下就可抑制并殺死E.coli。4種蜂蜜對C.albicans的MIC均為500.00 g/L,但只有茴香蜜對C.albicans的MBC為500.00 g/L,其他3種均超過500.00 g/L。王晶波等[59]研究表明茴香蜂蜜對S.aureus的抑菌能力(MIC為75.00 g/L,MBC為15.00 g/L)比麥盧卡蜂蜜(UMF 15+)高,這與本研究結果相似。玄參蜜對S.aureus和P.aeruginosa的抑菌活性低于LIN等[20]報道的。ANTHIMIDOU等[60]研究發現麥盧卡蜜(UMF 25+)對S.aureus和P.aeruginosa的MIC分別為6.25%和12.5%(體積分數),這與本研究測定的結果基本相同。研究還發現S.aureus是對蜂蜜最敏感的菌,而C.albicans對包括麥盧卡蜜在內的蜂蜜敏感性較差,這一結果得到瓊脂擴散試驗的驗證,并且與前人得出的結論一致[15,54,61]。

表5 蜂蜜樣品對微生物的MIC和MBC

為了探究3種藥用植物來源蜂蜜(茴香蜜、枸杞蜜和玄參蜜)的抑菌成分,本研究分析了總體抗菌活性(以MIC表示)與理化參數、抗氧化能力之間的相關性。由表6可知,蜂蜜的含水量、電導率、蛋白質含量、總酚含量、抗氧化能力與蜂蜜的抗菌活性無顯著相關性。研究表明蜂蜜的高酚酸含量有助于蜂蜜發揮抗菌活性[62-63],且部分蜂蜜的酚類或黃酮類化合物與抗菌活性之間存在顯著相關性[64]。但是TRUCHADO等[65]發現蜂蜜的抗菌活性與總酚和單個酚類化合物不呈線性相關。ULUSOY等[66]也表明總酚含量與蜂蜜的抗菌活性不相關。蜂蜜的pH為酸性,不適合大部分細菌生長,相關性分析顯示pH值與蜂蜜的抗菌能力顯著負相關(P<0.05),表明在一定pH值范圍內,pH值越高,反而對蜂蜜抗菌能力有正向影響,這可能是由于pH值的升高促進了蜂蜜中其他化學反應的發生。色值與蜂蜜的抗菌能力呈顯著正相關(r≥0.673,P<0.05)。值得注意的是淀粉酶活性與細菌的MIC極顯著負相關(P<0.01),表明較高的酶活性與蜂蜜較高的抗菌能力相關。TSAVEA等[48]研究同樣發現淀粉酶活性與蜂蜜對S.aureus的抗菌能力呈顯著負相關。過氧化氫含量與5種細菌的MIC呈顯著負相關,表明蜂蜜中過氧化氫含量越高,蜂蜜的抗菌活性越強。FARKASOVSKA等[67]研究同樣表明蜂蜜的總體抗菌活性(MIC)與H2O2水平密切相關。目前研究表明,蜂蜜的抗菌活性是pH(酸度)、高糖、低水活度、蛋白質(蜜蜂防御素-1、王漿主蛋白、外泌體囊泡等)、過氧化氫、酚類化合物、膠體結構、MGO等共同作用下的結果[13,58,68]。

表6 抗菌活性與理化參數之間的相關性

3 結論

在這項研究中,除麥盧卡蜜(UMF 20+)的淀粉酶活性外,4種蜂蜜樣品的基本理化指標均符合相關標準規定。茴香蜜與麥盧卡蜜的總酚含量無顯著差異,但總抗氧化能力低于麥盧卡蜜。茴香蜜和玄參蜜的蛋白質含量相當,均高于麥盧卡蜜。3種藥蜜的過氧化氫含量顯著高于麥盧卡蜜。此外,研究還發現了這些參數之間的各種相關性。抗菌試驗表明蜂蜜對不同菌株的抗菌能力不同。茴香蜜對S.aureus和S.epidermidis的抗菌能力高于麥盧卡蜜,枸杞蜜對這2種細菌的抗菌能力總體與麥盧卡蜜相當。茴香蜜和枸杞蜜對A.baumannii和P.aeruginosa的抗菌活性也高于麥盧卡蜜。麥盧卡蜜對E.coli的抗菌能力高于其他3種蜂蜜(MIC和MBC為100.00 g/L),所有蜂蜜對C.albicans的抗菌能力都較差。3種藥蜜的抗菌活性與pH、淀粉酶活性和過氧化氫含量顯著相關。結果表明茴香蜜和枸杞蜜具有與麥盧卡蜜相當或者更高的抗菌活性,值得進一步開發和研究。