鐵觀音中降解β-胡蘿卜素菌株的篩選及其陳香提升應用

楊小雪,彭政,蔣心怡,陳成聰,蔡宗敏,陳曉蘭,張娟*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

2(江南大學,未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)

3(福建安溪鐵觀音集團股份有限公司,福建 泉州,362441)

近年來隨著人們對老茶風味的追求,獨具陳香、口感醇厚、兼具一定健康功效的陳香型鐵觀音[1]逐漸受到更多的關注。但陳香型鐵觀音的自然陳化周期漫長,這不僅增加工廠的生產成本,也不利于陳香型鐵觀音的推廣和文化傳承,因此縮短鐵觀音的陳化周期具有重要的經濟和文化價值。茶葉中的香氣化合物由多種前體降解生成,來源于類胡蘿卜素的降解產物是最重要的香氣化合物之一[2-3],其對貯存的茶葉中木香等陳香有關香韻的形成有利,如貯存5年內祁門紅茶中類胡蘿卜素降解產物含量顯著增加,尤其是二氫獼猴桃內酯濃度較高且與茶葉的木香得分具有一致趨勢,被推斷在祁門紅茶獨特木香的形成中起到重要作用[4];貯存的綠茶[5]和茯磚茶[6]中酮類化合物是主要的揮發性化合物,其被認為可能通過類胡蘿卜素降解途徑生成,并能為茯磚茶提供特殊的花香和木香風味;在貯存的普洱茶中[7]α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯等類胡蘿卜素降解產物也是特征陳香物質之一。因此,推測增加鐵觀音茶中類胡蘿卜素降解產物是加速鐵觀音陳化和獲取陳香的潛在方式。

類胡蘿卜素結構高度不飽和、易發生降解,與物理和化學降解方式相比,生物降解具有條件溫和、綠色友好、產率高等特點[8],利用生物降解類胡蘿卜素增加香氣物質含量的研究也逐漸增多。如蔡程晨[9]從土壤中篩選到一株降解類胡蘿卜素的枯草芽孢桿菌,并將其應用于芒果汁發酵,結果顯示類胡蘿卜素降解產物含量有所增加;田爭福等[10]使用具有類胡蘿卜素降解能力的庫特氏菌發酵液輔助枸杞酒發酵,發酵結束后其香氣成分改善。這些研究也表明通過生物降解類胡蘿卜素改良產品風味特征是可行的策略。

茶葉中的類胡蘿卜素主要是β-胡蘿卜素和葉黃素[11],目前對β-胡蘿卜素的研究頗多。因此本研究以β-胡蘿卜素為底物,在鐵觀音中篩選出具有β-胡蘿卜素降解能力的菌株,并將菌株應用于鐵觀音的發酵以增加類胡蘿卜素降解產物含量,實現鐵觀音陳香風味和品質的提升。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2022年生產的鐵觀音新茶,鐵觀音陳茶(陳化時間為3、7、11、15、19、23年),來自福建安溪鐵觀音集團股份有限公司;β-胡蘿卜素(97%),上海源葉生物科技有限公司;酵母粉、蛋白胨、麥芽粉,Oxoid公司;其他未列出試劑均為國產分析純。

LB固體培養基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,瓊脂20,121 ℃滅菌15 min。

ISP2固體培養基(g/L):酵母粉4,葡萄糖4,麥芽粉10,瓊脂20,121 ℃滅菌15 min。

PDA培養基(g/L):馬鈴薯浸粉6,葡萄糖20,瓊脂20,121 ℃滅菌15 min。

富集培養基(g/L):K2HPO41,MgSO4·7H2O 0.5,NaNO33,FeSO4·7H2O 0.01,KCl 0.5,蔗糖30,酵母粉3,121 ℃滅菌15 min。

分離培養基:在富集培養基配方的基礎上添加1 g/L β-胡蘿卜素和20 g/L瓊脂。

發酵培養基:在富集培養基配方的基礎上添加1 g/L β-胡蘿卜素。

1.2 儀器與設備

HDPF-256恒溫培養箱,上海躍進醫療器械有限公司;GI80T高壓蒸汽滅菌鍋,致微(廈門)儀器有限公司;C1000 TouchTMPCR儀,美國Bio-Rad公司;DYY-6D核酸電泳儀,北京六一電泳儀廠;UVmini-1280紫外分光光度計,島津儀器(蘇州)有限公司;BXS-400S恒溫恒濕培養箱,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)纖維頭,美國Supelco公司;SCIONSQ-456-GCGC-MS儀器,美國Burker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 降解β-胡蘿卜素菌株的篩選

初篩:稱量2 g鐵觀音陳茶混合樣在100 mL無菌生理鹽水中,在4 ℃、220 r/min條件下洗滌24 h;吸取2 mL洗滌液和稱取2 g陳茶混合樣于50 mL富集培養基中,在30 ℃、220 r/min條件下培養48 h。吸取上清液用生理鹽水稀釋至10-1～10-5濃度并涂布于分離培養基中,置于30 ℃培養箱避光培養72 h,挑選出生長周圍透明圈明顯的菌株進行復篩。

復篩:劃線純化初篩菌株,挑取單一菌落至發酵培養基中,在30 ℃、220 r/min條件下避光發酵48 h,測定β-胡蘿卜素的降解率。

β-胡蘿卜素母液的配制,參考段焰青等[12]的方法:稱量0.5 g的β-胡蘿卜素于10 mL二氯甲烷中,徹底溶解后加入1 g吐溫-80攪拌乳化。放置于避光條件下過夜徹底揮發二氯甲烷,再加入100 mL無菌水復溶,過濾后得到β-胡蘿卜素母液。

β-胡蘿卜素含量的測定:測定β-胡蘿卜素溶液在454 nm波長處的標準曲線為y=1.700 8x+0.002 3,R2=0.999 2。測定發酵上清液在454 nm波長的吸光度,根據β-胡蘿卜素的標準曲線計算質量濃度(g/L)。

β-胡蘿卜素降解率的計算方法在龍章德等[13]的方法上略作修改:在發酵培養基中接種菌株培養48 h作為實驗組,同樣培養條件但未接種的發酵培養基作為對照組。為了排除培養基與菌株發酵液的顏色干擾,在發酵48 h后,以接種的富集培養基作為空白測定實驗組的吸光度,以未接種的富集培養基作為空白測定對照組的吸光度,并分別計算出β-胡蘿卜素的濃度,降解率(R)計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.2 降解β-胡蘿卜素菌株的鑒定

將復篩得到的菌株在真菌培養基和細菌培養基上劃線分離出單菌落,進行菌落形態觀察與鑒定。

真菌使用ITS1和ITS4通用引物進行PCR擴增,擴增體系為:15 μL Rapid Taq Mater Mix,1 μL ITS1(10 μmol/L),1 μL ITS4(10 μmol/L),1 μL 菌液,12 μL ddH2O,擴增程序為:94 ℃ 5 min(預變性),94 ℃ 30 s(變性),55 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 15 s(延伸),變性-退火-延伸步驟重復35個循環,然后72 ℃延伸10 min結束擴增。細菌使用27F和1492R通用引物進行PCR擴增,擴增體系同真菌擴增體系,擴增程序為:94 ℃ 5 min(預變性),94 ℃ 30 s(變性),55 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 30 s(延伸),變性-退火-延伸步驟重復35個循環,然后72 ℃延伸10 min結束擴增。

PCR擴增產物使用2%的瓊脂糖凝膠驗證條帶,將條帶大小正確的擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序引物同擴增引物。測序結果經過雙向拼接后,在NCBI上進行BLAST比對,并利用MEGA11軟件構建系統發育樹。

1.3.3 茶葉強化發酵實驗

菌液的制備:細菌使用LB液體培養基中在30 ℃,220 r/min培養24 h,離心得到菌體沉淀,使用生理鹽水重懸菌體沉淀并調節濃度至OD600=1。真菌使用PDA培養基30 ℃培養5～7 d,然后使用生理鹽水沖洗收集孢子,并將孢子液通過4層紗布過濾除去菌絲體,經平板計數后調整孢子液濃度為1×107CFU/mL。

茶葉強化發酵工藝:稱量200 g鐵觀音新茶,按照2%接種量接入濃度適宜的菌液,施加無菌水使茶葉潮水量達到20%,在恒溫恒濕培養箱中,控制溫度為30 ℃,濕度為40%,發酵21 d。以相同處理條件下只施加無菌水達到潮水量20%的茶葉作為對照(CK)。發酵結束后80 ℃烘干茶葉至易脆折的程度。

1.3.4 茶葉揮發性化合物的分析

揮發性化合物的提取和分離,參考ZHANG等[14]的方法:稱量2 g茶葉于萃取瓶,加入5 mL沸水沖泡并放置在60 ℃水浴中,使用SPME纖維頭頂空吸附30 min,每個樣品萃取3次。采用GC-MS儀器分析揮發性化合物,并使用DB-Wax柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)分離化合物。在分流模式下,進樣口的溫度為250 ℃。以1 mL/min的恒定流速使用高純氦氣作為載氣,使用程序升溫模式,烘箱初始溫度為40 ℃保持3 min,以8 ℃/min升溫至120 ℃,然后以10 ℃/min 升溫至230 ℃,并保持10 min。質譜儀是在電子碰撞模式下運行的,轟擊能為70 eV,質量掃描范圍是33～450原子質量單位。傳輸線溫度為250 ℃,離子源溫度為200 ℃。

揮發性化合物的鑒定和含量分析:將質譜結果與NIST庫中的標準質譜比對,保留匹配度高于800的化合物,并使用質譜檢測的峰面積比較不同化合物的相對含量。本課題組曾使用癸酸乙酯作為內標計算化合物濃度,但檢測到其峰面積總是不穩定,在之前的研究中也報道過這種情況,可能是由于茶葉顆粒本身吸附內標[15]會導致誤差較大,因此本研究使用峰面積進行化合物的含量變化研究,并使用R 4.0.0軟件“pheatmap”和“RColorBrewer”包來完成揮發性化合物含量熱圖的繪制,便于分析化合物在樣品間的變化情況。

1.3.5 感官品評

邀請3位具有陳香型鐵觀音品評資格的品評員,按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》烏龍茶的蓋碗審評法對茶葉進行感官品評。品評員經過討論和分析后確定以下6個指標對茶葉的香韻特征進行定量描述,分別為:花香、果香、甜香、酸香、陳香、總體評價,并采用5分制進行打分。

2 結果與分析

2.1 降解β-胡蘿卜素菌株的篩選結果

將富集的茶葉微生物群落在分離培養基上培養,共獲得300余株生長良好的菌株。經過比較平板透明圈大小和對菌落多次純化,獲得3株生長周圍有明顯透明圈的菌株,分別命名為HA,Hb,Hc。如圖1所示,將菌株接入發酵培養基,觀察到菌株對β-胡蘿卜素具有良好的降解能力,溶液顏色明顯減輕。經測定HA、Hb、Hc菌株對β-胡蘿卜素的降解率具有顯著差異且分別達到94.54%、72.97%、61.26%。

a-未接種的發酵培養基(對照組);b-接種HA的發酵培養基;c-接種Hb的發酵培養基;d-接種Hc的發酵培養基

2.2 降解β-胡蘿卜素菌株的鑒定結果

菌株的形態如圖2所示,HA菌株在PDA培養基上生長良好,呈厚絨狀,培養初期菌落為白色,中心有淡黃色區域,后期孢子大量繁殖,菌落表面覆蓋黑色顆粒,菌落背面為白色中心帶有黃色,符合典型的黑曲霉菌落特征,初步判定為一株黑曲霉。Hb菌株在LB固體培養基上生長形成淺黃色、圓形、不透明的菌落,菌落表面有褶皺、中心凹陷呈現火山口狀,黏液少,符合典型的芽孢桿菌屬的菌落特征,初步判定為一株芽孢桿菌屬細菌。Hc菌株在ISP2固體培養基上生成廣泛的淺橙色的基質菌絲體,表面覆蓋白色、彎曲呈鉤狀的氣生菌絲,中心存在空菌絲間隔,有球形孢子鏈,菌落沒有擴散的色素產生,與培養基結合緊密難以挑起,符合典型的糖多孢菌屬菌落特征[16],初步判定為一株糖多孢菌屬細菌。

將HA、Hb、Hc菌株雙向測序序列在NCBI庫中進行BLAST比對,分別選擇相似度前10的序列構建系統發育樹。結果如圖3所示,HA菌株與黑曲霉(Aspergillusniger)具有很高的相似性,其中與Aspergillusniger(MT597434.1)和Aspergillusniger(MK886749.1)具有最高的同源性,相似性分別為99.01%和99.5%,因此判定HA菌株為一株黑曲霉(Aspergillusniger)。Hb菌株與芽孢桿菌屬細菌具有很高的相似性,其中與Bacillusmethylotrophicus(JN700125.1)具有最高同源性,與Bacillusvelezensis(OK605053.1)具有第二高度的同源性,相似性分別達到了99.79%和99.86%,這2株菌都是貝萊斯芽孢桿菌種的微生物[17],因此判定Hb菌株為一株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。Hc菌株與糖多孢菌屬細菌具有很高的相似性,其中與Saccharopolysporagregorii(KT720280.1)具有最高的同源性,且相似形達到了99.64%,結合形態學結果判定Hc菌株為一株Saccharopolysporagregorii。

2.3 茶樣的揮發性化合物分析

本研究采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術對茶樣進行揮發性成分的鑒定和分析,共檢測出36種揮發性化合物,它們的香氣特征及含量如表1所示。揮發性化合物可以分為七類,包括醇類10種、碳氫化合物8種、含氮化合物6種、酮類6種、酯類3種、酸類2種、醛類1種,醇類化合物是種類最多的揮發性化合物,而碳氫化合物是含量最多的揮發性化合物,占總化合物含量的38.65%。將所有的揮發性化合物含量以熱圖展示(圖4),其中紅色表示揮發性化合物含量高,藍色表示含量低。與添加水的對照茶樣相比(CK),添加菌株的發酵茶樣中揮發性化合物總量都有增加,且發酵茶樣中的揮發性化合物含量變化各不相同,說明本實驗篩選的3株微生物都能促進茶葉香氣生成,并且3株菌的效果不重疊。

表1 茶樣中揮發性化合物的香氣特征及含量

圖4 茶樣中揮發性化合物的熱圖展示

茶樣中不同種類揮發性化合物含量如圖5所示,與對照相比,HA發酵茶樣中碳氫化合物、醇類化合物和酮類化合物含量有顯著提升(P<0.05),且酯類化合物和醛類化合物含量也有增加,其中提升幅度最大的是酮類化合物,相對于對照提升了128.12%;Hb發酵茶樣中碳氫化合物、酯類化合物和酮類化合物含量較對照有顯著的提升(P<0.05),醇類化合物和醛類化合物含量也有增加,其中酮類化合物幅度提升最大為109.38%;Hc發酵茶樣中不同種類揮發性化合物含量沒有顯著提升,但Hc發酵茶樣中的碳氫化合物、醇類化合物、酯類化合物和醛類化合物含量均較對照有一定程度的提升,其中醛類化合物提升幅度最大,相對于對照提升了61.11%。酮類和醛類化合物是氧化型化合物,被認為是鐵觀音陳茶區別于新茶的重要風味物質[18],因此施加菌株強化發酵茶葉能夠一定程度上加速鐵觀音的陳化。在發酵茶樣中酸類化合物和含氮化合物含量下降,酸類化合物可能是發生酯化反應生成酯類化合物[19],如己酸含量下降,而衍生物順式-3-己烯基己酸酯含量增加;投入菌株的發酵茶樣中微生物數量增加,消耗更多的還原糖,會導致部分美拉德反應產物減少,如1-甲基-2-吡咯甲醛在3個發酵茶樣中含量均下降。吲哚是一種信號分子可以調節微生物的生理狀態[20],微生物數量的增加可能會利用更多的吲哚使其含量下降。

圖5 茶樣中不同種類揮發性化合物含量

為考察3株菌株在發酵過程中對β-胡蘿卜素類物質的降解情況,本研究重點關注了茶樣中類胡蘿卜素降解產物的含量變化。如表2所示,4個茶樣中共檢測到13種類胡蘿卜素降解產物,有12種物質在施加菌株的發酵茶葉中含量提升,說明投入的微生物生長良好、能夠發揮其降解類胡蘿卜素的能力。唯一下降的產物是反式-β-法呢烯,推測其可能轉化為順式,反式-α-法呢烯、順式-β-法呢烯、α-法呢烯,從而導致含量下降。在HA、Hb、Hc發酵茶樣中含量均提升的類胡蘿卜素降解產物是6-甲基-5-庚烯-2-酮、順式-β-法呢烯、芳樟醇氧化物(Ⅱ)、反式-橙花叔醇、α-法呢烯,原因可能是這些物質在類胡蘿卜素降解途徑中較易生成。HA發酵茶樣中含量增加的有11種類胡蘿卜素降解產物,其獨有含量增加的降解產物為去氫芳樟醇和植酮;Hb發酵茶樣中含量增加的有7種類胡蘿卜素降解產物,沒有獨有增加的降解產物;Hc發酵茶樣中含量增加的有8種類胡蘿卜素降解產物,其獨有增加的降解產物為1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘。出現不同發酵茶樣中獨有的含量增加的降解產物的情況,可能是因為微生物所產降解類胡蘿卜素的酶不完全一致[21],導致底物降解程度不同。與對照相比,HA、Hb、Hc發酵茶樣中的類胡蘿卜素降解產物總量分別提高了1.6、1.4、1.3倍,產物含量高低與菌株降解類胡蘿卜素的能力大小相一致。

表2 茶樣中類胡蘿卜素降解產物含量

2.4 茶樣感官品評分析

茶樣的感官得分如圖6所示,HA、Hb、Hc發酵茶樣均得到了高于對照的總體評價,說明篩選的菌株能夠加速茶葉的發酵、生成更多的風味物質,提高了茶葉的品質。HA菌株投入的發酵茶樣提高了1.7倍的甜香香韻得分,苯甲醛、去氫芳樟醇、反式-β-羅勒烯、植酮、1-戊醇和芳樟醇具有甜香香氣特征,并且大部分在HA發酵茶樣中的含量較對照有較大的提升幅度,推測可能是這些揮發性化合物促進了HA發酵茶樣的甜香香韻增加,如芳樟醇在煙葉中能夠賦予其清甜香韻[22]。

圖6 茶樣的感官得分

Hb菌株投入的發酵茶樣提高了1.4倍的果香香韻得分,在Hb發酵茶樣中檢測到帶有果香特征、含量提高的化合物包括苯甲醛、2-乙酰基吡咯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、順式-β-法呢烯、順式-3-己烯基己酸酯、順式-3-己烯基異戊酸酯、反式-橙花叔醇、α-法呢烯、1-戊醇和β-紫羅蘭酮,推測可能是這些揮發性化合物促進了Hb發酵茶樣的果香香韻增加。尤其是Hb發酵茶樣中酯類化合物含量顯著高于對照(P<0.05),而酯類化合物通常對于果香的形成具有很大貢獻[23]。

Hc發酵茶樣的甜香香韻提高了1.7倍,并首次得到了陳香香韻得分,實現了鐵觀音的陳香品質提升。Hc發酵茶樣中具有甜香特征的苯甲醛、反式-β-羅勒烯和芳樟醇含量增加較多,推測可能是這3種揮發性化合物促進了Hc發酵茶樣的甜香得分增加。木香與藥香通常被與陳香香韻聯系在一起[1,24-25],為探究Hc發酵茶樣陳香提高原因,本研究重點關注Hc發酵茶樣中帶有木香或藥香特征并含量提升的揮發性化合物,得到6種符合要求的化合物:苯甲醛、順式,反式-α-法呢烯、反式-橙花叔醇、芳樟醇、反式-β-羅勒烯和2,3-辛二酮。本研究還觀測到一種僅在Hc發酵茶樣中檢測到的化合物:1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘,其被報道是陳年葡萄酒的典型香氣化合物[26],因此推測上述6種木香或藥香特征的揮發性化合物和1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘對鐵觀音陳香品質提升具有促進作用。雖然HA、Hb菌株降解類胡蘿卜素能力強于Hc菌株,但微生物可以產生多種降解類胡蘿卜素的裂解酶[8,27],Hc菌株可能產生了更復雜但未被檢測到的類胡蘿卜素降解產物,因此其發酵茶樣的香韻提升多樣化。除此以外,Hc菌株可能具有復雜的生理功能,能夠與茶葉本身的微生物協同發揮效用,對陳香相關風味物質有綜合性的提升。

一些揮發性化合物具有多樣化的香氣特征,在多種香韻的提升中都有作用,如苯甲醛對應甜香、果香、陳香香韻,反式-β-羅勒烯和芳樟醇對應甜香、陳香香韻,反式-橙花叔醇對應果香和陳香香韻,1-戊醇對應甜香和果香香韻,這些化合物可能對茶葉發酵茶樣的總體評價提升具有重要作用。所有樣品中僅檢測到2種酸類化合物,且酸類物質總量未有提升,因此樣品沒有酸香香韻或酸香低于感官品評閾值而沒有品評得分。花香是揮發性化合物常見的香氣特征,本研究中共檢測到36種揮發性化合物,其中,8種化合物具有花香香氣特征,這些化合物在對照樣中都被檢測到并具有一定的含量,因此對照樣含有較高的花香得分,微生物本身帶有一些不良的風味,可能會對清新的花香影響較大而致強化發酵茶樣花香得分有所降低。

3 結論

本研究從鐵觀音陳茶中篩選獲得3株具有β-胡蘿卜素降解能力的菌株,它們的降解率分別為94.54% (Aspergillusniger,HA)、72.97% (Bacillusvelezensis,Hb)、61.26% (Saccharopolysporagregorii,Hc)。將菌株接入鐵觀音新茶實施強化發酵,發酵結束后測定茶樣的揮發性化合物成分并進行感官品評。所有茶樣共檢測出36種揮發性化合物,與對照相比,菌株強化發酵的茶樣中碳氫化合物、醇類、酯類和醛類化合物含量均有增加,并且類胡蘿卜素降解產物總量在HA、Hb、Hc發酵茶樣中分別提高了1.6、1.4、1.3倍,提升幅度大小與菌株降解能力呈正相關。強化發酵的茶樣風味豐富,整體感官得分均高于對照,在Hc發酵茶樣中成功獲得陳香香韻,實現了短期內鐵觀音的陳香品質提升。雖然HA與Hb菌株能夠促進茶葉中較多揮發性化合物含量增加,但菌株具有較重的異味,未來HA與Hb菌株在茶葉發酵中的工藝優化將是研究的重點,有望獲得典型的陳香品質。