白果肽的二肽基肽酶-Ⅳ抑制活性及其抑制機理研究

王翔,張彩虹,蔣建新,謝普軍*,黃立新*

1(中國林業科學研究院林產化學工業研究所,江蘇 南京,210042)

2(北京林業大學 材料科學與技術學院,北京,100083)

Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種由胰島素抵抗或胰島素相對缺乏引起的慢性疾病,嚴重威脅著人們的生命安全[1]。據統計,全球目前約有4.15億人患有Ⅱ型糖尿病,如不加控制,預計到2040年,其患者人數將達到6.42億[2]。研究表明,抑制二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ)活性可有效治療T2DM。目前,臨床上常用的DPP-Ⅳ抑制劑,如沙格列汀、西他列汀和維格列汀等人工合成類藥物雖療效顯著,但長期服用可能會引起頭痛、尿道和上呼吸道感染等不良反應[3]。因此,尋找高效、低毒副作用的新型DPP-Ⅳ抑制劑成為當下研究熱點。近年來,食源性DPP-Ⅳ抑制肽因其天然、安全和高效等優點在治療T2DM中備受關注。

白果,作為我國傳統食品,富含蛋白質和多種活性成分[4],但由于加工技術的限制,目前對于白果的利用,僅停留在食品加工的初級階段,經濟效益較低,導致每年大量的白果被丟棄,造成嚴重資源浪費和環境污染。為實現白果的高值化利用,課題組前期采用酶解法將白果中提取得到的蛋白質水解為高附加值的多肽[5-6],并對其DPP-Ⅳ抑制活性進行了初步的探索,發現白果肽具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性,其中,以白果肽(phenylalanine-alanine-proline-serine-tryptophan,FAPSW和methionine-proline-glycine-proline-proline,MPGPP)表現最優。為進一步量化其抑制活性,研究其構效關系,本實驗以FAPSW和MPGPP為原料,通過體外抑制試驗評估其DPP-Ⅳ抑制活性,并采用分子對接和分子動力學模擬技術,從分子和原子水平上闡明其抑制機理。該研究結果可為白果肽在功能食品領域的開發和利用提供一定的理論基礎,同時為白果的高值化利用提供了有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FAPSW和MPGPP多肽由課題組前期鑒定所得[5],并通過Fmoc固相合成制備,其一級質譜和二級質譜如圖1所示。

a-FAPSW的一級質譜圖;b-FAPSW的二級質譜圖;c-MPGPP的一級質譜圖;d-MPGPP的二級質譜圖

西他列汀(純度≥97%),阿拉丁試劑有限公司;DPP-Ⅳ篩選試劑盒(MAK203),Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

SpectraMax?i3x熒光多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司;CPA225D分析天平,北京賽多利斯儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 白果肽DPP-Ⅳ體外抑制實驗

使用DPP-Ⅳ抑制劑篩選試劑盒測定FAPSW和MPGPP對DPP-Ⅳ的抑制活性。將50 μL DPP-Ⅳ溶液與25 μL不同質量濃度的多肽(FAPSW和MPGPP)溶液加入到96孔板中,37 ℃孵育10 min。其中,MPGPP的質量濃度為0.066、0.132、0.265、0.530、1.060 g/L,FAPSW的質量濃度為1.0、2.0、2.50、3.0、4.0 g/L。待孵育完成后,體系中加入25 μL DPP-Ⅳ反應底物,于λ=360 nm激發波長和λ=460 nm發射波長下連續測定其熒光強度,檢測時長為30 min,時間間隔為1 min。西他列汀為陽性對照。多肽對DPP-Ⅳ的抑制活性計算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:F30和F0分別為樣品或空白(緩沖液代替樣品)在30 min時和0 min時的熒光強度;A0和A1分別為空白和樣品的斜率;k為斜率。

1.3.2 分子對接

根據ASHOK等[7]描述的方法,采用分子對接研究多肽(FAPSW和MPGPP)與DPP-Ⅳ之間的相互作用。從RCSB數據庫下載DPP-Ⅳ晶體結構(PDB ID:1wcy)(https://www.rcsb.org/structure/1wcy),通過Protein Preparation Wizard模塊對1wcy進行去水加氫,補全缺失氨基酸殘基等處理,并利用OPLS4力場對其進行能量最小化。FAPSW和MPGPP的三維結構由pymol(Education version)生成,并通過LigPrep模塊對其進行結構優化和能量最小化處理,力場選擇為OPLS4。以1wcy自身配體附近的氨基酸殘基作為活性位點,盒子中心坐標為center_x=55.62,center_y=62.20,center_z=36.88,大小設置為size_x=10,size_y=10,size_z=10。采用SP-peptide模式(Glide application,Schrodinger)進行對接。Docking score用于評估配體和受體之間的相互作用強弱。Docking score越低,表示受體與配體結合得越緊密。

1.3.3 分子動力學模擬

基于SONG等[8]報道的方法,使用GROMACS 2022.2對上述多肽-DPP-Ⅳ復合物進行非約束分子動力學模擬以評估其穩定性。采用Amber99sb-ildn力場和TIP3P水模型分別對復合物進行分子力學優化和溶劑化。模擬體系采用周期性立方體盒子。體系中添加適量的Na+以平衡電荷,并采用最陡下降法對體系進行能量最小化。進行正式模擬前,在正則系綜和等溫等壓系綜下對體系進行100 ps的預平衡。模擬溫度和壓力分別設置為310 K和1 bar。正式模擬的時長設置為90 ns。

采用分子力學/泊松-玻爾茲曼表面積(molecular mechanics/Poisson-Boltzmann surface area,MM/PBSA)法計算多肽與1wcy之間的結合自由能(ΔGbind),計算如公式(3)所示:

ΔGbind=ΔEVDW+ΔEelec+ΔGPB+ΔGSA-TΔSS

(3)

式中:ΔEVDW,ΔEelec,ΔGPB,ΔGSA和ΔSS分別為范德華能、靜電能、極性溶劑化能、非極性溶劑化能和構象熵;T為溫度,K。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 FAPSW和MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性

機體正常代謝過程中,食物攝入會引起胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)的釋放,刺激胰腺β細胞釋放胰島素,從而維持機體內正常血糖水平。DPP-Ⅳ作為一種多功能跨膜糖蛋白和絲氨酸蛋白酶,可迅速降解GLP-1,使機體血糖升高。抑制DPP-Ⅳ活性可提高GLP-1的水平,從而達到降血糖的功效[9]。如表1所示,FAPSW和MPGPP具有較好的DPP-Ⅳ抑制活性,其IC50分別為(2.540±0.126)、(0.158±0.009) g/L,雖弱于陽性對照[西他列汀,IC50=(0.037±0.009) g/L],但強于一些已報道的DPP-Ⅳ抑制肽,如QGQELLPSDFK (IC50=3.89 g/L)[10]、SGVSLAALKKALAAAGYDVEK(IC50=84.19 g/L)和SAPRHGSLGFLPRK(IC50=23.44 g/L)[11]。另外,MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性要強于FAPSW,這可能與MPGPP中N端2號位上的氨基酸殘基P有關[12-13]。JIN等[14]研究表明,N端2號位上存在P的多肽,如LPQ(IC50=82.0 μmol/L)、LPVP(IC50=87.0 μmol/L)和LPY(IC50=87.15 μmol/L),其DPP-Ⅳ抑制活性要強于N端2號位上不存在P的多肽,如LDKVFR(IC50=128.71 μmol/L),這與本研究結果一致。

表1 FAPSW、MPGPP和西他列汀的DPP-Ⅳ抑制活性

2.2 分子對接結果分析

為進一步闡明FAPSW和MPGPP的抑制機理,采用分子對接從分子水平上揭示其與DPP-Ⅳ之間的相互作用。MPGPP與DPP-Ⅳ的Docking score為-8.168 kcal/mol,要小于FAPSW(-7.737 kcal/mol),表明MPGPP與DPP-Ⅳ之間的相互作用要強于FAPSW[15]。這與上述多肽的DPP-Ⅳ抑制活性結果是一致的。JIN等[16]研究表明,Docking score越低的多肽,其DPP-Ⅳ抑制活性更強,如YLNF的(Docking score為-3.58 kcal/mol,IC50=146.90 μmol/L)DPP-Ⅳ抑制活性要強于TKLPAVF(Docking score為-2.27 kcal/mol,IC50=242.10 μmol/L),這與本研究結果一致。

DPP-Ⅳ中存在3個主要的活性口袋[16]:由催化三聯體Ser 630-Asp 708/Asn 710-His 740和疏水殘基(Tyr 547、Tyr 631、Trp 659、Tyr 662、Tyr 666、Val 711和Val 656)組成的疏水位點S1、由Glu 205、Glu 206和Arg 125構成的電荷口袋S2以及由Val 207、Ser 209、Arg 358和Phe 357組成的活性位點S2′。另外,SAGAR等[17]和WU等[18]發現Tyr 547和Trp 629對DPP-Ⅳ活性也有重要影響。如圖2所示,FAPSW和MPGPP與DPP-Ⅳ相互作用主要為靜電相互作用、氫鍵、疏水作用和范德華力。YANG等[19]研究表明,靜電相互作用和氫鍵在抑制DPP-Ⅳ活性中起重要作用。如圖2-b和圖2-d所示,FAPSW與Lys 554形成1個靜電相互作用(Pi-陽離子),與S2中的Glu 205和Glu 206共形成2個靜電相互作用(鹽橋);而MPGPP與S2中的Glu 205和Glu 206分別形成1個靜電相互作用(鹽橋)。此外,FAPSW和MPGPP與DPP-Ⅳ分別形成3個氫鍵和7個氫鍵。其中,FAPSW與Glu 205形成一個碳氫鍵,與Glu 206和Tyr 547共形成2個傳統氫鍵;MPGPP與S1中的Tyr 547、Tyr 631、Tyr 662、Asn 710和S2中的Arg 125共形成6個傳統氫鍵,與S1中的His 740形成1個碳氫鍵。HE等[20]研究發現,傳統氫鍵個數與多肽的DPP-Ⅳ抑制活性呈正相關,這可以解釋為什么MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性強于FAPSW。WANG等[15]發現疏水相互作用也能影響DPP-Ⅳ活性。如圖2-b和圖2-d所示,FAPSW與Lys 554和S2′中的Phe 357分別形成1個疏水作用力,MPGPP與Lys 554和S1中的Tyr 662、Tyr 666和Tyr 547共形成5個疏水作用。

a-FAPSW與1wcy的對接模型;b-FAPSW與1wcy的二維相互作用示意圖;c-MPGPP與1wcy的對接模型;d-MPGPP與1wcy的二維相互作用示意圖

YANG等[19]研究表明DPP-Ⅳ與抑制劑之間的范德華力可影響DPP-Ⅳ的空間構型,從而影響其活性。如圖2-b所示,FAPSW與DPP-Ⅳ中的Arg 560、Arg 358、Ser 209、Trp 201、Asp 663、Tyr 662、Tyr 631、Trp 659、Val 656、Ser 630、Val 711、His 740、Asn 710、Tyr 666、Arg 125、Arg 669、Cys 551、Tyr 585、Ser 552和Gln 553存在范德華力作用;而MPGPP與DPP-Ⅳ中的Gln 553、Ser 552、Trp 629、Ser 630、Val 711、Val 656、Trp 659、Asp 663和Trp 201存在范德華力作用(圖2-d)。因此,FAPSW和MPGPP可通過范德華力改變DPP-Ⅳ的空間構型,從而發揮其抑制作用。

2.3 分子動力學模擬結果分析

為進一步評估FAPSW和MPGPP與DPP-Ⅳ結合后形成復合物的穩定性,通過分子動力學模擬分析其復合物的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波動(root mean square fluctuation,RMSF)、回旋半徑(radius of gyration,Rg)、溶劑可及表面積(solvent accessible surface area,SASA)和結合自由能。

2.3.1 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的RMSD分析

游離1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的RMSD值如圖3所示。通常復合物的RMSD值越小,體系越穩定,配體與受體結合的越緊密[21]。如圖3-a所示,1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的RMSD值在40 ns后趨于穩定,表明后續40～90 ns軌跡可用于下一步分析。FAPSW-1wcy與MPGPP-1wcy復合物的RMSD值(40～90 ns)分別為(0.243±0.021) nm和(0.221±0.001) nm,小于游離1wcy的RMSD值[(0.253±0.012) nm](圖3-b),表明FAPSW和MPGPP與1wcy結合后,其復合物結構更穩定。SONG等[22]研究表明,YYLVR、YLLVR和YYLLVR結合血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)后,其復合物結構的RMSD值要小于游離ACE的RMSD值,表明其復合物結構更穩定。這與本研究結果一致。另外,MPGPP-1wcy復合物的RMSD值低于FAPSW-1wcy,表明MPGPP-1wcy的穩定性要強于FAPSW-1wcy復合物。這可能是由于MPGPP與1wcy結合地更緊密。LIU等[23]報道了相似的結果,其研究發現,相比于2,6-二羥基苯乙酮-黃嘌呤氧化酶和4-羥基苯乙醇-黃嘌呤氧化酶復合物,結合更緊密的4-羥基苯甲醛-黃嘌呤氧化酶復合物具有更小的RMSD值。

a-0～90 ns;b-40～90 ns

2.3.2 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的RMSF分析

復合物中蛋白的RMSF能夠反映配體對受體空間結構的影響。RMSF值越大,說明配體對蛋白的擾動越大,復合物結構越不穩定。如圖4所示,復合物FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy的RMSF值分別為(0.121±0.006)和(0.116±0.006) nm,略低于游離1wcy的RMSF值[(0.130±0.008) nm],表明FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物空間結構的穩定性要優于游離1wcy。AMIRI等[24]研究發現四環素結合α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶后,四環素-α-淀粉酶和四環素-α-葡萄糖苷酶復合物的RMSF值要小于游離α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶,表明其復合物的穩定性要優于游離α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶,這與本研究結果是一致的。此外,MPGPP-1wcy復合物的RMSF值要低于FAPSW-1wcy,表明MPGPP-1wcy復合物的穩定性要強于FAPSW-1wcy。

圖4 游離1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的RMSF值

2.3.3 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的Rg分析

Rg常被用來描述蛋白質結構的緊密程度。在復合物體系中,其值越小,表明配體與蛋白結合得越緊密,復合物結構越穩定[25]。如圖5所示,復合物FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy的Rg值分別為(2.708±0.008)、(2.693±0.001) nm,小于游離1wcy的Rg值[(2.723±0.009) nm],表明FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物結構穩定強于游離1wcy。這可能是由于FAPSW和MPGPP結合1wcy后,其復合物結構更緊密。XU等[26]研究發現,5-咖啡酰奎尼酸和4-咖啡酰奎尼酸結合脂肪酶后,其復合物的Rg值低于游離脂肪酶的Rg值。這與本研究結果是一致的。另外,MPGPP-1wcy復合物的Rg值小于FAPSW-1wcy,表明復合物MPGPP-1wcy的穩定性要強于FAPSW-1wcy,這可以解釋為什么MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性強于FAPSW。

圖5 游離1wcy、FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的Rg值

2.3.4 FAPSW與MPGPP結合1wcy的結合自由能分析

為進一步從能量的角度分析FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的穩定性,采用MM/PBSA計算FAPSW和MPGPP與1wcy之間的結合自由能。結合自由能越低,復合物結構越穩定。如表2所示,MPGPP的結合自由能(ΔGbind=-76.795 kJ/mol)小于FAPSW的結合自由能(ΔGbind=-54.015 kJ/mol),表明MPGPP-1wcy復合物結構的穩定性強于FAPSW-1wcy,這與上述多肽體外DPP-Ⅳ抑制活性的實驗結果是一致的。FAPSW-1wcy復合物中ΔEelec、ΔEVDW、ΔGPB、ΔGSA和TΔSS分別為-419.180、-216.139、598.872、-35.120、-17.552 kJ/mol,表明靜電相互作用在FAPSW與1wcy的結合中起主導作用;另外,在MPGPP-1wcy復合物中,ΔEelec、ΔEVDW、ΔGPB、ΔGSA和TΔSS分別為-241.819、-145.758、305.541、-23.902、-29.142 kJ/mol,同樣表明靜電相互作用在MPGPP與1wcy的結合中起主導作用。

表2 FAPSW-1wcy和MPGPP-1wcy復合物的結合自由能組成 單位:kJ/mol

2.3.5 結合自由能分解分析

為深入了解1wcy中各個氨基酸殘基與多肽(FAPSW和MPGPP)之間的相互作用機制,通過自由能分解分析其對結合自由能的貢獻,結果如圖6所示。在FAPSW結合1wcy中(圖6-a),1wcy對結合自由能貢獻較大的氨基酸殘基(結合自由能貢獻<-4 kJ/mol)分別為Arg 560(-11.054 kJ/mol)、Arg 429(-8.273 kJ/mol)、Phe 357(-8.117 kJ/mol)、Tyr 666(-7.999 kJ/mol)和Arg 471(-5.873 kJ/mol)。而對于MPGPP結合1wcy(如圖6-b所示),1wcy對結合自由能貢獻較大的氨基酸殘基為(結合自由能<-4 kJ/mol)為Phe 357(-11.930 kJ/mol)、Tyr 547(-7.531 kJ/mol)、Arg 560(-6.517 kJ/mol)、Lys 554(-5.997 kJ/mol)、Arg 429 (-5.343 kJ/mol)、Trp 629(-4.954 kJ/mol)和Arg 471(-4.270 kJ/mol)。

a-FAPSW-1wcy;b-MPGPP-1wcy

3 結論與討論

本研究結果表明,FAPSW和MPGPP均表現出良好的DPP-Ⅳ抑制活性,且MPGPP的DPP-Ⅳ抑制活性IC50=(0.158±0.009) g/L強于FAPSW IC50=(2.540±0.126) g/L。分子對接結果表明,FAPSW和MPGPP通過靜電相互作用、氫鍵、疏水作用和范德華力與DPP-Ⅳ活性位點相結合,且傳統氫鍵在抑制DPP-Ⅳ活性中起重要作用。分子動力學結果表明,MPGPP-1wcy復合物的穩定性要強于FAPSW-1wcy復合物,其結合自由能分別為-76.795、-54.015 kJ/mol。靜電相互作用在FAPSW和MPGPP與1wcy的結合中起主導作用。本研究結果不僅豐富了降糖肽庫,同時為銀杏白果源多肽(FAPSW和MPGPP)在功能食品領域的開發和利用提供科學參考。