超聲耦合加熱制備明膠穩(wěn)定的水包油型乳液的研究

胡恩民,姚秀寧,許鈺琴,方順,李雪晴,嚴(yán)慧敏,樊智豪,葉敏,戚軍*,熊國遠(yuǎn),李超,賈敬敏

1(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部江淮農(nóng)產(chǎn)品精深加工與資源利用重點實驗室,安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實驗室,安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院,安徽 合肥,230036)

2(雨潤集團(tuán)肉品質(zhì)量控制與新資源創(chuàng)制全國重點實驗室,江蘇 南京,210041)

3(宿州市符離集劉老二燒雞有限公司,安徽 宿州,234101)

黃羽肉雞是目前國內(nèi)出欄量最大的肉雞品種,主要分為快速型黃羽肉雞、中速型黃羽肉雞和慢速型黃羽,其中慢速型黃羽肉雞主要用于燉制中國傳統(tǒng)雞湯。雞湯由于味道鮮美,在傳統(tǒng)飲食文化中,既可作為美食直接食用,也可作為烹調(diào)加工中的調(diào)味品。香味是雞湯最主要的特征風(fēng)味品質(zhì)之一,湯中香味活性物質(zhì)包括3-甲硫基丙醛、2-甲基-3-巰基呋喃、甲基吡嗪、2-乙基-4-甲基噻唑、己醛、(E)-2-壬烯醛[1]、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和(E,Z)-2,4-癸二烯醛[2]。研究發(fā)現(xiàn)除了少量含硫含氮的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物外,雞湯中香味活性物質(zhì)主要為脂肪族醛類物質(zhì),這些風(fēng)味物質(zhì)主要通過脂肪氧化產(chǎn)生,且具有較高的疏水性,易溶于脂肪難溶于水。此外,前期研究發(fā)現(xiàn)燉制過程中雞湯中香味物質(zhì)損失80%[3],通過調(diào)控湯中香味物質(zhì)的關(guān)鍵載體-油滴的大小實現(xiàn)了增強(qiáng)雞湯吸附香味物質(zhì)的能力,導(dǎo)致香味物質(zhì)含量增加了200%[4]。油滴是湯中香味活性物質(zhì)的關(guān)鍵載體,已有報道表明當(dāng)油滴體積分?jǐn)?shù)超過1%時,食品中油滴吸附香味物質(zhì)的能力可得到成倍的提升[5],而雞湯中脂肪含量0.2%～0.4%[6-7],因此提高加熱過程中湯中脂肪含量將是解決雞湯燉制過程香味逸失的關(guān)鍵。

高壓均質(zhì)和超聲是調(diào)控水包油乳液中油滴含量的常規(guī)乳化方法。高壓均質(zhì)可通過高速沖擊、強(qiáng)剪切力等改變蛋白質(zhì)吸附量和蛋白質(zhì)在界面上的相互作用,實現(xiàn)乳液的穩(wěn)定[8],但高壓均質(zhì)對硬件設(shè)備要求高且能量轉(zhuǎn)化效率低。超聲波通過空化效應(yīng)及空化效應(yīng)引起的物理效應(yīng)促進(jìn)蛋白質(zhì)吸附在油滴表面。與高壓均質(zhì)相比,超聲設(shè)備便攜性和通用性較高。通常情況,超聲結(jié)合低溫條件來制備乳液,一方面低溫對蛋白質(zhì)構(gòu)象影響較小,另一方面可避免因熱導(dǎo)致乳液絮凝等。熱超聲作為超聲在食品加工中新的應(yīng)用發(fā)展方向之一,可顯著改善肉制品風(fēng)味品質(zhì)。已經(jīng)有研究表明,與非超聲組相比,超聲溫度98 ℃、超聲30 min制備的雞骨湯所需的熬煮時間縮短了1/3,且礦物元素含量顯著增加[9]。超聲水浴加熱顯著提高肉湯中干物質(zhì)和粗蛋白含量,雞湯的風(fēng)味和感官評分顯著提高[10]。這些結(jié)果表明熱超聲技術(shù)可加速燉制過程中肉中蛋白質(zhì)等組分轉(zhuǎn)移到湯中的速率,進(jìn)而縮短熬制時間,但仍未證實是否能夠形成穩(wěn)定的乳液。此外,在比目魚骨湯的研究中發(fā)現(xiàn),熱超聲制作的魚骨湯比常規(guī)制作的魚骨湯更濃稠,質(zhì)地更均均勻,說明超聲輔助燉制可能會有促進(jìn)乳化的作用[11],具體機(jī)制尚不清楚。

明膠是雞湯中主要結(jié)構(gòu)蛋白,超聲后,粒徑降低,表面疏水性增加,導(dǎo)致明膠在水相中的遷移速率增加,降低了乳液界面能壘;且當(dāng)油/水界面層中明膠有序結(jié)構(gòu)(螺旋和折疊)數(shù)量增多時,界面覆蓋率增加,這些界面行為可改善其乳化能力,提高乳液穩(wěn)定性[12],主要因為蛋白質(zhì)的界面行為決定了所形成的界面蛋白膜分子特性,如膜厚度、致密性及黏彈性等。雖然熱超聲對明膠結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚,但已有報道表明加熱過程中,明膠受熱降解,粒徑變小,表面疏水基團(tuán)含量增加,有序結(jié)構(gòu)增加[13]。因此推測超聲輔助加熱具有制備對熱穩(wěn)定的明膠乳液的潛力。

綜上所述,本文利用超聲輔助加熱技術(shù),明膠作為乳化劑,制備明膠大豆油乳液,探究在熱處理條件下,不同超聲時間(0、20、40、60 min)處理制備出的明膠乳液穩(wěn)定性的變化。通過對乳液粒徑、絮凝指數(shù)、乳析指數(shù)、顯微結(jié)構(gòu)、Zeta電位等指標(biāo)的測定,評估熱超聲時間對乳液微觀結(jié)構(gòu)和宏觀穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果可為雞湯的風(fēng)味調(diào)控提供理論依據(jù),進(jìn)一步為拓展乳液在熱加工領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明膠(藥用級),上海阿拉丁生化有限公司;大豆油(食品級),中糧福臨門食品營銷有限公司;無水乙醇(分析純),上海振興化工一廠;牛血清蛋白(分析純),上海伯奧生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2103 N分析天平,上海民橋精密科學(xué)儀器公司;HJ-3控溫磁力攪拌器,江蘇金城國勝實驗儀器廠;Allegra-64R離心機(jī),美國貝科曼庫爾特公司;Mastersizer2000激光粒度儀、Nano ZS 90粒度儀,英國馬爾文公司;JY 92 IIN超聲細(xì)胞破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司;IX51倒置顯微鏡,日本奧林巴斯公司;PE-Lambda35紫外分光光度計,美國珀金埃爾默公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 明膠溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.5 g明膠,用80 mL蒸餾水溶解,在60 ℃條件下,用HJ-3磁力攪拌器攪拌30 min,使明膠充分水化溶解。溶解后定容到100 mL容量瓶里,得到濃度為5 g/L的明膠溶液。

1.3.1.2 乳液的制備

將5 mL大豆油緩慢加入95 mL制備的明膠溶液中,制得油相體積比為5%(體積分?jǐn)?shù))的溶液。利用超聲細(xì)胞破碎儀對配制的乳液進(jìn)行超聲處理,利用水浴保持乳液溫度在90～95 ℃,總加熱時間為2 h。從加熱開始計時是,分別超聲0、20、40、60 min。為了保持加熱溫度和超聲參數(shù)保持穩(wěn)定,在實際操作過程中,先加熱10 min,再保溫超聲10 min為1個循環(huán);超聲20 min即為循環(huán)2次。超聲細(xì)胞破碎儀具體測量參數(shù)為:超聲工作0.5 s/次、間隙0.2 s、超聲功率500 W、振幅桿直徑為6 mm。

1.3.2 乳液離心穩(wěn)定性的測定

1.3.2.1 乳析指數(shù)(chromatography index,CI)的測定

參考趙秋菊[14]的測定方法。取4 mL乳液置于離心管中,使用Allegra-64R離心機(jī)(10 000 r/min),在15 ℃下離心30 min。離心后,用注射器準(zhǔn)確量取水析層的體積V1。計算如公式(1)所示:

(1)

式中:CI為乳析指數(shù);V1為離心后水析層體積,mL;V2為離心管中乳液總體積,mL。

1.3.2.2 乳液穩(wěn)定系數(shù)(emulsion stability index,ESI)的測定

參考李慧娜等[15]的測定方法。用注射器吸取1.3.2.1節(jié)制備的離心后的乳液1 mL。將離心前乳液和離心后水析層底部乳液各稀釋10倍,再用PE-Lambda35紫外分光光度計測定吸光度,波長540 nm。計算如公式(2)所示:

(2)

式中:ESI為乳液穩(wěn)定系數(shù);A0為離心前乳狀液的吸光度;A1為離心后乳狀液的吸光度。

1.3.3 界面蛋白負(fù)載量測定

1.3.3.1 蛋白含量的測定

用雙縮脲法測定乳液蛋白的含量。取1 mL樣品于10 mL離心管中,加入0.5 mL CCl4和5 mL的0.05 mol/L KOH,室溫振蕩10 min,4 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,加入4 mL雙縮脲試劑,混勻,室溫放置30 min。再取一個離心管加入1 mL蒸餾水和4 mL雙縮脲作為空白對照,于540 nm處進(jìn)行比色測定,以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定乳液蛋白質(zhì)含量為C0。

1.3.3.2 界面蛋白負(fù)載量的測定

取3 mL乳液于培養(yǎng)皿中凍干3 d,記錄凍干前后質(zhì)量差M0,由公式(3)得到乳液油相體積分?jǐn)?shù)。由公式(4)得到界面蛋白表面負(fù)載量。

(3)

(4)

式中:M0為乳液凍干前后質(zhì)量差,mg;Ci為總蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;C0為乳液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;φ為乳液中油相體積分?jǐn)?shù),%;d[3,2]為乳液平均粒徑,μm;ρ為大豆油密度,mg/mL;Γ為界面蛋白負(fù)載量,mg/m2。

1.3.4 乳液粒徑的測定

采用Mastersizer 2000激光粒度儀,研究超聲20、40、60 min乳液粒徑分布。參考王麗娟[16]的研究方法,具體測量參數(shù)設(shè)定為:測定溫度25 ℃、顆粒折射率1.470、攪拌槳轉(zhuǎn)速2 000 r/min、分散劑折射率1.330、顆粒吸收率0.001。每個樣品測定3次,取平均值。

1.3.5 乳液Zeta電位的測定

取1 mL新制乳液,將其稀釋200倍,備用。用Nano ZS 90粒度儀在25 ℃的測定條件下,對乳滴液滴表面的Zeta電位進(jìn)行測定。具體測定參數(shù)方法同1.3.4節(jié)。每個樣品測定3次,取平均值。

1.3.6 乳液液滴顯微結(jié)構(gòu)觀察

取5 μL乳液于載玻片上,將22 mm×22 mm蓋玻片置于乳液上方,使用倒置顯微鏡確定超聲0、20、40、60 min的明膠乳液的液滴尺寸分布。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗獨立重復(fù)3次。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,運(yùn)用SPSS Statistics 24(IBM,SPSS 24.0,California,USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,使用單因素方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,隨后采用Duncan法對未超聲組(對照組)與熱超聲組的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳液油相體積分?jǐn)?shù)

圖1為不同熱超聲時間對乳液油相體積分?jǐn)?shù)的影響。隨著熱超聲時間的延長,油相體積分?jǐn)?shù)從0.42%增加到4.88%,這一結(jié)果與QI等[13]報道超聲增加雞湯中油相體積分?jǐn)?shù)的結(jié)果類似,可見熱超聲也可顯著提高乳液中油相體積分?jǐn)?shù)。且由于油滴是湯中香味物質(zhì)的關(guān)鍵載體,當(dāng)油滴體積分?jǐn)?shù)超過1%時,湯中油滴吸附香味物質(zhì)的能力遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)的作用,因此該結(jié)果也表明熱超聲具有增強(qiáng)雞湯吸附香味物質(zhì)的潛力。

TU-0-熱超聲時間0 min;TU-20-熱超聲時間20 min;TU-40-熱超聲時間40 min;TU-60-熱超聲時間60 min

2.2 乳液離心穩(wěn)定性

圖2為不同熱超聲時間對明膠乳液乳析指數(shù)和乳液穩(wěn)定系數(shù)的影響。CI可提供乳液中油滴與水相聚集和分離程度的信息,乳液穩(wěn)定系數(shù)與乳液抵抗油滴聚集和絮凝的能力有關(guān)。觀察離心30 min后不同處理組的乳液,發(fā)現(xiàn)未超聲的溶液離心后沒有明顯變化。而熱超聲20、40、60 min的乳液均發(fā)生乳析,頂部為乳析層,底部為水析層。熱超聲40 min處理制備的明膠乳液的乳析指數(shù)最小,表明此時乳液穩(wěn)定性最高,這與趙秋菊等[14]報道超聲對反相乳液穩(wěn)定性的影響相類似。熱超聲20、40、60 min后,ESI分別為7.2%、62.6%、57.7%,熱超聲40 min穩(wěn)定系數(shù)最高,這與乳析指數(shù)的結(jié)果相一致。熱超聲40 min后穩(wěn)定系數(shù)顯著提高,可能是由于熱超聲促進(jìn)了乳液中蛋白質(zhì)的吸附,提高了乳液的穩(wěn)定性[17]。熱超聲60 min后穩(wěn)定系數(shù)下降,可能由于熱超聲時間過長,導(dǎo)致明膠乳化油滴穩(wěn)定性能力下降,雖然雞湯中脂肪含量顯著增加[18]。

圖2 熱超聲時間對明膠乳液CI和ESI的影響

2.3 明膠乳液物理穩(wěn)定性分析

2.3.1 乳液粒徑

表1為熱超聲時間對明膠乳液粒徑的影響。熱超聲時間延長,比表面積值顯著增加,D[3,2]、D[4,3]、D[v,0.1]、D[v,0.5]、D[v,0.9]的值顯著降低,這與ZHU等[11]報道的超聲時間乳液粒徑影響的結(jié)果相類似。結(jié)合乳液油相體積分?jǐn)?shù)和乳液穩(wěn)定系數(shù)的結(jié)果,暗示熱超聲對乳液的乳液形成的影響可能與常規(guī)超聲的影響是相類似的,適度熱超聲可增強(qiáng)乳液穩(wěn)定性。隨著熱超聲時間延長,超聲波空化作用可以將油滴破碎成細(xì)小顆粒,然后蛋白質(zhì)圍繞在小油滴周圍以保持小顆粒,同時減少了粒子間相互碰撞,因為可以較好地保持在粒徑較小的狀態(tài)[19]。

表1 不同熱超聲時間的明膠乳液平均粒徑變化

此外,超聲改變明膠蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),隨著時間延長,三螺旋結(jié)構(gòu)減少,無規(guī)螺旋/三螺旋的比率降低,明膠表面疏水性和α-螺旋增加[20],這可能促進(jìn)明膠在油滴表面吸附,這也有助于減小油滴粒徑,當(dāng)兩者結(jié)合時,說明熱超聲處理對明膠粒徑也有積極影響。

熱超聲60 min后,乳析指數(shù)和穩(wěn)定性結(jié)果表明此時乳液穩(wěn)定性顯著下降,這是由于脂肪含量顯著增加了10%所致。一般來說,穩(wěn)定性下降表明乳液粒徑增加[17],但此時乳液比表面積、D[3,2]、D[4,3]、D[v,0.1]、D[v,0.5]、D[v,0.9]沒有顯著差異。前期研究表明,乳液穩(wěn)定性主要與靜電作用和空間位阻有關(guān),因此這個結(jié)果表明熱超聲60 min后,乳液粒徑雖然沒有顯著差異,但靜電作用和空間位阻可能有顯著變化。

2.3.2 乳液微觀結(jié)構(gòu)

圖3為熱超聲時間對乳液顯微結(jié)構(gòu)的影響。與未超聲乳液相比,熱超聲后乳液中油滴顆粒明顯變小。隨著熱超聲時間延長,乳滴分布更加均勻,這與高壓均質(zhì)制備的明膠乳液的結(jié)果相似[12]。這與粒徑和乳析指數(shù)的結(jié)果相一致?？偟膩碚f,熱超聲可形成穩(wěn)定的水包油乳液,油滴體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到4.88%,形成的粒徑與ZHU等[21]報道的高壓均質(zhì)制備相同油滴體積分?jǐn)?shù)的明膠乳液粒徑結(jié)果相類似和LI等[17]報道超聲制備相同油滴體積分?jǐn)?shù)的明膠乳液粒徑結(jié)果相類似。熱超聲40 min,制備的乳液粒徑更小,穩(wěn)定性更高。

a-熱超聲0 min處理乳液微觀結(jié)構(gòu);b-熱超聲20 min處理乳液微觀結(jié)構(gòu);c-熱超聲40 min處理乳液微觀結(jié)構(gòu);d-熱超聲60 min處理乳液微觀結(jié)構(gòu)

2.3.3 乳液Zeta電位

圖4為熱超聲時間對乳液Zeta電位的影響。隨著超聲時間延長,明膠乳液的Zeta電位絕對值顯著下降。與未超聲乳液相比,熱超聲處理制備的乳液Zeta電位絕對值下降超過40%。這是因為未超聲溶液中油脂含量較少(0.42%),蛋白質(zhì)主要分散在連續(xù)相中,因此Zeta電位主要反映的是蛋白質(zhì)的電荷密度。熱超聲處理后,分散在連續(xù)相吸附在油滴表面,導(dǎo)致油滴體積分?jǐn)?shù)增加到4.88%,此時吸附在油滴表面的明膠中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基,如天冬氨酸和谷氨酸,參與界面蛋白膜的形成,導(dǎo)致負(fù)電荷基團(tuán)被埋藏,進(jìn)而導(dǎo)致熱超聲后乳液Zeta電位下降40%以上。

圖4 熱超聲時間對明膠乳液的Zeta電位的影響

隨著熱超聲時間延長,Zeta電位絕對值先下降再增加,熱超聲40 min組Zeta電位絕對值最低。通常來說,Zeta電位絕對值下降,表明此時乳液中靜電斥力下降,這是乳液穩(wěn)定性降低的重要因素,但熱超聲40 min制備的乳液穩(wěn)定性最高,這可能與維持乳液穩(wěn)定的另一個重要因素-空間位阻有關(guān)。熱超聲40 min制備的乳液Zeta電位絕對值下降可能是因為更多的明膠負(fù)電基團(tuán)參與界面膜的形成,導(dǎo)致此時乳液穩(wěn)定性增加。熱超聲60 min后,乳液Zeta電位絕對值顯著增加,但此時乳液穩(wěn)定性顯著降低,這可能因為參與界面膜形成的明膠含量降低,導(dǎo)致穩(wěn)定性下降和明膠帶負(fù)電荷基團(tuán)的增加。

2.4 界面蛋白負(fù)載量

界面蛋白負(fù)載量Γ是影響油滴凝結(jié)穩(wěn)定性的重要參數(shù)。一般地,Γ越高,乳液抗凝結(jié)的穩(wěn)定性就越好[22],因此其提供了更好的空間位阻。乳液界面蛋白負(fù)載量隨熱超聲時間的變化情況如圖5所示。結(jié)果表明,當(dāng)熱超聲處理時間由20 min延長到40 min時,乳液界面蛋白負(fù)載量由5.34 mg/m2顯著增加到7.35 mg/m2,當(dāng)熱超聲處理時間延長到60 min后,乳液界面蛋白負(fù)載量顯著降低到5.82 mg/m2,這與邵云[22]加熱對大豆蛋白界面蛋白負(fù)載量的研究結(jié)果類似。這個結(jié)果也解釋了,熱超聲40 min制備的乳液穩(wěn)定性最高,因其提供了更強(qiáng)的空間位阻作用。界面蛋白負(fù)載量的增加可歸因于超聲波誘導(dǎo)的明膠改性[23],包括明膠疏水基團(tuán)的解聚和暴露和有序結(jié)構(gòu)含量的增加,這有利于加速明膠向油水界面的遷移[24],從而增加明膠吸附到油水界面的吸附量,并降低了界面張力,進(jìn)而增加乳液穩(wěn)定性。

圖5 熱超聲時間對乳液界面蛋白負(fù)載量影響

綜上所述,熱超聲可以促進(jìn)肉湯在熱加工過程中的乳化,但過多的熱超聲波會導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低。這些結(jié)果與常規(guī)超聲處理的乳劑的結(jié)果相似,表明適度熱超聲可增強(qiáng)乳液穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)低溫超聲相比,熱超聲也可形成穩(wěn)定的水包油乳液。熱超聲處理40 min后,雞湯中油滴的體積分?jǐn)?shù)從0.42%增加到4.88%,此時穩(wěn)定性最高。這是因為熱超聲導(dǎo)致更多的蛋白吸附在油滴表面,提供了更強(qiáng)的空間位阻。油滴是雞湯中香味物質(zhì)的關(guān)鍵載體,因此研究結(jié)果暗示,熱超聲技術(shù)可能為雞湯的風(fēng)味調(diào)控提供理論依據(jù),進(jìn)一步為拓展乳液在熱加工領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒。