次氯酸鈉與酶聯合對不銹鋼表面細菌生物被膜的清除作用

黃陽陽,凍梓杰,王淑莉,抄玉超,劉昶,黃忠民,2,3*,索標,2,3*,范濤

1(河南農業大學 食品科學技術學院,河南 鄭州,450002)

2(國家速凍米面制品加工技術研發專業中心,河南 鄭州,450002)

3(農業農村部大宗糧食加工重點實驗室,河南 鄭州,450002)

4(河南省糧食科學研究所有限公司,河南 鄭州,450000)

微生物污染是食品加工業面臨的一個持續挑戰[1]。部分致病性細菌常見于食品加工表面及內部,導致食品基料受微生物污染的風險增加[2],進而引起交叉污染以及食品感官特征的變化[3]。生物被膜是黏附在生物或非生物表面的微生物聚集體[4],由多糖,蛋白質和由封閉微生物分泌的細胞外DNA(eDNA,Environment DNA)組成[5],并對抗菌劑(消毒劑)呈現一定抗性[3]。成熟生物被膜中的細菌細胞可以不斷分散并附著在另一個表面上,導致細菌污染物的傳播以及微生物存活的可能性[6],并增強隨后的食品交叉污染。

酶試劑最近因其對生物被膜細胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)基質的降解作用而受到越來越多的關注。酶可以通過破壞生物被膜基質的完整性導致細胞從生物被膜中釋放來潛在地靶向和松弛生物被膜EPS基質[7]。根據生物被膜基質的主要組成,可以使用不同的酶,包括碳水化合物酶、脂肪酶、核酸酶和蛋白酶[6]。DNase I和蛋白酶K處理可減少蠟樣芽孢桿菌和單核細胞增生李斯特菌的生物被膜[8-9],CRAIGEN等[10]證明了α-淀粉酶處理對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制和去除作用。

然而,由于EPS的復雜結構,單獨酶處理可能無法完全清除生物被膜[11]。因此,建議使用酶混合物和其他補充方法,例如氯處理。次氯酸鈉具有良好的廣譜殺菌活性,能夠穿透細菌的細胞膜進入細胞內部,從而使細菌缺乏生存必需的酶而失去活性[12]。盡管以前的研究已經證明了單一使用酶或者消毒劑對生物被膜清除功效,但使用二者相結合對細菌生物被膜的清除研究仍然較少[10]。

本研究旨在探究含氯消毒劑與酶聯合對幾種常見致病菌生物被膜的殺滅作用,通過微孔板分光光度計進行不同細菌生物被膜能力的篩選,平板計數法和流式細胞儀比較2種處理方式對生物被膜的清除效果,以期獲得不同處理方式對生物被膜清除的差異性。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

本實驗所使用的菌株BacilluspumilusCICC 10900來自于中國工業微生物菌種保藏管理中心;StaphylococcusaureusATCC 6538、BacillussubtilisATCC 9372、StaphylococcusaureusATCC 8095、Salmonella.typhimuriumATCC 14028、ListeriamonocytogenesATCC 27708、ListeriamonocytogenesATCC 13932來自美國典型菌種保藏中心;BacilluscereusCMCC 63303、SalmonellaenteritidisCMCC 50035來自于中國醫學細菌菌種保藏管理中心。所有受試菌株在實驗之前被貯存在30%的甘油中,溫度為-80 ℃。實驗使用304級不銹鋼試樣(面積2 cm2,厚1 mm)。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(tryptonesoyagar,TSA),胰蛋白胨大豆肉湯培養基(trypticasesoy broth,TSB),Baird-Parker瓊脂、亞碲酸鉀卵黃增菌液,陸橋科技有限公司;肉膏蛋白胨肉湯(luriaber tani,LB),陸橋科技有限公司;酵母浸粉(yeastextract,YE),上海生工生物工程股份有限公司;PBS、Armadillo 96-WellPCR Plates,賽默飛世爾科技有限公司;70%異丙醇,天津渤化化學試劑有限公司;表面清潔劑(JYM-302),惠州市佳一美金屬表面處理材料有限公司;α-amylase、proteinase K,上海Sigma-Aldrich;DNase I,南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

5430R型冷凍離心機,德國Eppendorf有限公司;BPMJ-150F型恒溫恒濕培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋,日本Tomy有限公司;DHG-9240AS層流柜,嘉興市中新醫療儀器有限公司;BioTeK/epoc微孔板分光光度計、NovoCyte2060R流式細胞儀,安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同細菌菌株生物被膜形成能力

參考KIM等[13]通過結晶紫染色測定法測定細菌菌株的生物被膜形成能力,并在此基礎上進行了輕微的修改。簡而言之,每種細菌懸浮液10 μL(初始濃度106CFU/mL),加入至聚苯乙烯96孔微量滴定板中的3個孔中。每個孔補充200 μL TSB+YE或LB+YE(分別對應枯草芽孢桿菌CICC 10900、金黃色葡萄球菌ATCC 6538)培養液,另外3個僅含有培養液(非接種培養基)的孔用作每個微量滴定板的陰性對照。37 ℃孵育24 h,棄去液體部分,并用250 μL PBS輕輕沖洗每個孔,并在層流柜中風干20 min。將每個孔用200 μL 0.25%(體積分數)結晶紫溶液處理30 min,250 μL PBS輕輕洗滌3次以除去未吸收的結晶紫。洗滌后,將每個孔中剩余的結晶紫溶解在200 μL 95%乙醇中,然后在室溫下孵育10 min。取每個孔中的100 μL試樣轉移到新的96孔微量滴定板中,并使用微孔板分光光度計在595 nm處測量吸光度。

1.3.2 不同酶對生物被膜形成以及成熟生物被膜的影響

測試所選酶(α-amylase、proteinase K、DNase I)對生物被膜形成的抑制作用(作為預酶處理),200 μL混合液(10 μL濃度為106CFU/mL細菌懸浮液+190 μL TSB+YE或LB+YE培養液)將和2種受試菌株中的每一種被添加到96微孔板中,不含酶處理溶液的組作為陰性對照,37 ℃孵育48 h,孵育后,如1.3.1節所述進行結晶紫染色測定。最終使用的酶濃度如下:0.1%(體積分數) DNaseⅠ,1%(體積分數) proteinase K和20 mg/mL α-amylase。處理后,用移液器除去含有酶的培養基,用250 μL PBS洗滌1次,準備進行定量或進一步處理[14]。評估酶對成熟生物被膜的清除效果(作為酶后處理),在37 ℃孵育48 h后,用200 μL新鮮培養液替換細菌懸浮液。加入每種酶,然后在37 ℃下孵育1 h。孵育后,如1.3.1節所述進行結晶紫染色測定及計算吸光度值。

1.3.3 蛋白酶與次氯酸鈉聯合對不銹鋼上細菌生物被膜的清除

1.3.3.1 菌懸液的制備及試樣預處理

將供試的枯草芽孢桿菌CICC 10900、金黃色葡萄球菌ATCC 6538分別于TSA+YE、BP培養基劃線37 ℃培養48 h,挑取單菌落分別置于TSB+YE、LB+YE(10 mL)液體培養基中,經37 ℃、12 h振蕩培養至指數后期,4 ℃,7 000 r/min離心5 min,PBS清洗3次,懸浮于等體積0.85% NaCl溶液中,梯度稀釋制得106CFU/mL菌懸液,4 ℃存放。

1.3.3.2 生物被膜制備

不銹鋼試樣預處理:表面清潔劑和異丙醇(70%)分別浸泡30 min并用清水充分洗滌,干燥后置于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃,15 min。生物被膜制備的方法按照MAZAHERI等[15]和RIPOLLES-AVILA等[16]的方法并做了修改,將50 μL菌株的懸浮液無菌接種于不銹鋼試樣的表面,將接種過菌液的不銹鋼片放置在無菌培養皿中,加入3 mL TSB+YE或LB+YE、37 ℃孵育72 h,每隔36 h棄去原先的液體培養基,并用3 mL無菌水輕輕洗滌不銹鋼試樣,以清除松散或未附著的細胞,并補充3 mL TSB+YE或LB+YE至表面,再次將試樣放置在濕度室中以完成孵育期。

1.3.3.3 生物被膜分離

用3 mL無菌蒸餾水沖洗接種的樣品表面2次,以去除任何未附著的細胞。將試樣放入新的無菌培養器皿中,其中處理溶液(酶、4.5% NaClO及聯合處理)覆蓋表面,施用15 min[16]。用3 mL無菌蒸餾水一式兩份洗滌表面,目的是消除未附著的細胞,處理后,立即將不銹鋼試樣沉積在含有30 g無菌玻璃珠的50 mL Dey-Engley中和肉湯中,并用臺式渦旋混合器以最大速度攪拌1 min。對照組:用3 mL無菌蒸餾水洗滌不銹鋼表面2次,并直接置于無菌燒瓶中,用玻璃珠和10 mL中和劑溶液渦旋,無需消毒處理。

1.3.4 生物被膜細菌計數

取處理過的樣品混合液1份和9份NaCl制得1∶10稀釋液,并吸取100 μL適宜濃度稀釋液分別涂布于TSA+YE、BP培養基。一式三份測量每個樣品和每個稀釋度。

1.3.5 流式細胞術(flow cytometry,FCM)分析

將未經處理和處理過的生物被膜細胞懸浮到0.85% NaCl溶液中,渦旋3～5 s,棄上清液,加入同體積的PBS緩沖液,5 000 r/min、4 ℃、離心5 min,使用PBS緩沖液再次洗滌。染色。對于上步驟的獲得的細胞沉淀,加入1 mL CalceinAM/PI檢測工作液。37 ℃避光孵育30 min準備兩管額外的細胞樣品,每管只加入1種染料(CalceinAM或PI),用于流式單染的補償調節,染色后,將樣品置于冰上,1 h內進行FCM分析。

1.4 數據處理與統計分析

測試樣本一式三份,應用Microsoft Excel 2019軟件數據統計和計算均值,采用One-Way ANOVA比較在P<0.05水平的差異顯著性,使用Graphpad Prism 8.5軟件(GraphPad軟件公司,美國)作圖。

2 結果與分析

2.1 不同細菌微生物在聚苯乙烯96微孔板上的生物被膜形成能力

由于細菌菌株間特異性的存在,導致不同細菌形成生物被膜能力有所差異[17]。根據它們的吸光度將生物被膜形成的能力分為4組:高度黏附(OD595>3.0),強烈黏附(3.0>OD595>2.0),中度黏附(2.0>OD595>1.0),弱黏附力(OD595<1.0)[13]。在本研究中,枯草芽孢桿菌CICC 10900、金黃色葡萄球菌ATCC 6538是強黏附性的菌株;蠟樣芽孢桿菌CMCC 63303、枯草芽孢桿菌ATCC 9372、金黃色葡萄球菌ATCC 8095、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、單增李斯特菌ATCC 27708中度黏附,腸炎沙門氏菌CMCC 50035和單增李斯特菌ATCC 13932是本研究中黏附性最弱的菌株(圖1)。選擇黏附性較強的枯草芽孢桿菌 CICC 10900、金黃色葡萄球菌ATCC 6538菌株進行下一步的實驗,以評估酶對不同菌株生物被膜的清除功效。

圖1 不同菌株在聚苯乙烯96板上的生物被膜形成能力

2.2 作用于細菌生物被膜次氯酸鈉使用濃度的確定

圖2顯示生物被膜的清除效率與NaCIO濃度提升呈正相關,造成枯草芽孢桿菌CICC10900和金黃色葡萄球菌ATCC 6538下降了約0.45 lg CFU/cm2～2.09 lg CFU/cm2和0.39 lg CFU/cm2～2.61 lg CFU/cm2。由于生物被膜與含氯類消毒劑都帶有相同的負電荷,使得含氯類分子更容易滲透進生物被膜內部,改變細胞膜的通透性,以及氧化蛋白質或者破壞磷酸脫氫酶,使糖代謝失調,最終導致菌體死亡[18]。次氯酸鈉中的次氯酸根會水解生成次氯酸,具有一定的氧化性。程曦[19]采用不同濃度次氯酸鈉應用于供水管網時發現余氯濃度越高,鑄鐵管壁腐蝕越嚴重;當鋼鐵受到腐蝕會導致其腐蝕物脫落,其不利影響包括:a)促進生物膜生長;b)在以后的消毒程序中需要更多的氯清除;c)腐蝕物可能會混入物料中[20];張雅君等[21]研究表明在紫外線劑量相同的條件下,碳鋼的腐蝕速率會隨著次氯酸鈉投放量的增加而加大,過高濃度的次氯酸鈉會對食品基料以及后期的清理帶來負面影響[22]。

圖2 不同梯度次氯酸鈉對細菌生物被膜的清除能力

2.3 酶在生物被膜形成過程中以及對成熟生物被膜的抗性研究

結果顯示,這些酶能夠抑制生物被膜的形成或降解預先形成的生物被膜基質(圖3、圖4),與對照組相比,proteinase K和α-amylase在應用于生物被膜形成過程中的抑制作用分別是最有效的和最低效的。酶抑制或降解生物被膜基質的能力依賴于物種和菌株類型[13],這體現在分別使吸光度下降了0.575 OD值～1.047 OD值和-0.006 OD值～0.261 OD值。在本研究中,施加α-amylase作用于枯草芽孢桿菌CICC 10900基本沒有抑制效果,這一結果和GILAN等[23]相似,部分酶的參與會促進紅球菌C208菌株生物被膜的發育,體現在吸光度比沒有酶參與時高出2倍,并且導致黏液,多層和穩健性增加;在有蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶K)參與的情況下,兩株梭桿菌的生物膜形成能力得到加強[13]。這些結果的原因涉及到酶對介導細胞外DNA分泌的蛋白酶的積極調節,部分酶可以通過調節活躍的細胞自溶和DNA釋放來促進生物被膜的形成[10]。

圖3 聚苯乙烯96孔板上生物被膜形成過程中預酶處理

圖4 聚苯乙烯96孔板上酶對成熟生物被膜的清除

圖3顯示,與生物被膜形成期間相比,這些酶對預先存在的生物被膜的效果較差。例如,α-amylase對受試菌株的成熟生物被膜基本沒有抑制效果;proteinase K在預酶處理實驗中的能夠很好地對生物被膜的形成產生制約,但應用到成熟生物被膜時其功能性也被減弱;與對照組(無酶參與)相比,枯草芽孢桿菌CICC 10900在α-amylase的參與下產生了更多的生物被膜基質;DAKHEEL等[24]研究表明經蛋白酶K(100 μg/mL)處理后金黃色葡萄球菌的生物被膜減少,而高質量濃度的蛋白酶K(1 mg/mL)促進了大多數測試分離物的生物被膜形成。這些觀察結果可以解釋為酶會降解細胞分泌的細胞外蛋白酶,而這些蛋白酶負責生物被膜的分散。另一種解釋可能是高濃度酶的自溶和eDNA釋放,導致生物被膜的形成能力增強[23]。

這些結果表明,酶的抗生物被膜功效因生物被膜形成階段的不同而體現出差異,在生物被膜形成期間,酶處理往往比對成熟生物被膜更有效。這一發現的原因可能是酶在EPS早期階段中比在成熟的生物被膜中更容易減少或抑制細胞間和細胞與表面的聯系[10]。在成熟的生物被膜中,酶能使附著在表面的細胞從一個部位移到另一個部位[5]。總的來說,與α-amylase和DNase I相比,蛋白酶K處理可是更有效的抑制生物被膜發展和降解成熟生物被膜的酶。

2.4 酶和次氯酸鈉聯合處理對成熟生物被膜的清除

由于多糖的復雜結構以及生物膜基質的異質成分,很難單獨用酶或者消毒劑來徹底清除[11]。此外,酶的活性會受到pH值、溫度、底物等因素的影響,與其他蛋白酶相比,蛋白酶K在一系列環境條件下的具有更好的穩定性[9];因此選用proteinase K和次氯酸鈉處理不銹鋼試樣上的兩種細菌生物被膜以評估協同清除效應。如圖5所示,proteinase K,次氯酸鈉和聯合處理分別導致枯草芽孢桿菌CICC 10900、金黃色葡萄球菌ATCC 6538濃度降低了0.64～3.08 lg CFU/cm2、0.81～2.19 lg CFU/cm2、0.66～1.9 lg CFU/cm2。與單一處理(proteinase K和次氯酸鈉)相比,proteinase K可以幫助次氯酸鈉等二級制劑更有效地滲透生物被膜,增強對細菌細胞的清除功效。另一項研究指出[25],相較于單獨處理,纖維素酶(20 mg/mL)與十六烷基三甲基溴化銨聯合對沙門氏菌生物被膜具有協同作用;HOGAN等[26]使用α-amylase,V8 protease以及serrapeptase的單酶處理對金黃色葡萄球菌生物被膜沒有降解作用,而使用每種酶與抗生素結合24 h可實現2～6個對數位的減少。這些結果表明,聯合處理可以使氯等消毒劑更容易穿透生物被膜基質并清除掉酶分散的細胞。

圖5 proteinase K和次氯酸鈉聯合處理對成熟生物被膜的清除

2.5 FCM測定不同處理后細菌生物被膜的細胞活力

對樣品進行的Calcein-AM和PI雙染結果如圖6所示。圖中表示有不同染色特性的4種亞群:第一個位于左下象限,對應未染上色的細胞或裂解細胞碎片;第二個位于左上象限,對應PI標記的死細胞;第三個位于右下象限,代表Calcein-AM標記的活細胞;第四個位于右上象限,表示PI/Calcein-AM雙染的損傷細胞,仍然具有酯酶活性,但是細胞膜受到損傷,PI可穿過細胞膜,可以認定是亞致死細胞破壞。

A-金黃色葡萄球菌ATCC 6538;B-枯草芽孢桿菌CICC 10900

空白組的生物被膜細胞如圖6-A、圖6-B所示,超過35.83%、38.57%的的新鮮細胞都集中在右下限。而經過不同處理溶液方式處理的細胞,其左上象限里的細胞明顯增加,可以看出這3種處理方式對2種細菌生物被膜細胞均能夠起到一定的損傷作用。在使用單一proteinase K、次氯酸鈉或者proteinase K+次氯酸鈉進行處理時,金黃色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢桿菌CICC 10900死細胞數主要其中在左上象限,數目分別為7.09%、22.43%、31.33%和12.04%、23.45%、37.78%,代表了生物被膜細胞經不同處理溶液處理后成為失去細胞活性的凋亡細胞。經酶處理后細胞膜的完整性會受到損傷,導致細胞內容物流出,細胞裂解死亡[27],這會幫助次氯酸鈉等消毒劑更好地滲透,從而起到協同效應;YU等[28]使用流式細胞儀表征超聲和二氧化氯對清除金黃色葡萄球菌生物膜的協同作用,結果表明流式細胞儀表征超聲處理的清除率僅為18.72%,而聯合處理后的金黃色葡萄球菌細胞的滅活率為99.03%。該結果與本研究相似,相比單一處理,proteinase K+次氯酸鈉的組合造成了更多的細胞死亡,因此,在應對細菌生物被膜時,聯合處理是更有效的清除方式。

3 結論

細菌菌種間生物被膜有著一定的EPS特異性,導致不同細菌菌株形成生物被膜的能力存在差異,枯草芽孢桿菌CICC 10900、金黃色葡萄球菌ATCC 6538是受試菌株中形成生物被膜能力較強的2株(3.0>OD595值>2.0)。在生物被膜形成期間,酶處理往往比對成熟生物被膜更有效,大多數測試的酶都能對受試菌種產生一定的清除效果,但部分酶的參與會導致細菌產生更多的生物被膜基質,酶抑制或降解生物被膜基質的能力會可能依賴于物種和菌株類型。經酶處理后細胞膜的完整性會受到損傷,這會幫助次氯酸鈉等消毒劑更好地滲透,從而起到協同效應。相較于單一處理,NaCIO和酶聯合的方式是不銹鋼表面細菌生物被膜的更有效的清除選擇。因此在清除細菌生物被膜時,不僅僅是局限于單一的制劑處理,而應當考慮更多的組合方式。