基于PCR-DGGE技術分析濃香白酒窖泥梭菌多樣性

吳玉軒，汪俊卿，劉玉濤，張夢夢，任廣花，王文潔，崔吉鵬

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東濟南 250353；2.濟南趵突泉釀酒有限責任公司技術質量部，山東濟南 250115）

窖池固態釀造是我國濃香型白酒的獨特生產方式。酒醅與窖池四周的窖泥大面積直接接觸，為釀造微生物提供了良好的生存環境，也是合成己酸乙酯、丁酸、己酸等多種關鍵風味物質微生物的重要來源。不同窖池生產的濃香型白酒存在品質差異，這主要由于窖池中的窖泥在長期的釀造過程中，窖泥的理化因素（如含水量、有效磷、腐殖質、有效鉀、pH值、銨態氮等）會發生變化，這些變化會對窖泥中優勢微生物的富集起到較好的促進作用[1-4]。如窖泥的含水量可影響土壤的酸堿度和窖泥是否板結；pH 值變化不僅能夠改變窖泥性質，影響窖泥微生物群落結構，而且能夠影響微生物的代謝和促進酒精發酵，進而提高優質白酒的得率；銨態氮可使窖泥中的營養物質直接被窖泥中的微生物吸收，能夠有效促進微生物的生長和代謝，對改善窖泥品質具有重要作用等等，由此可知理化指標可間接反映窖泥的微生物群落結構及其豐度[5-7]。

梭菌屬（Clostridium）微生物是濃香型白酒風味物質形成的重要菌群之一，窖泥中梭菌綱微生物是濃香型白酒釀造過程重要的生香菌，它們能夠產生多種脂肪酸，對濃香型白酒典型風格的形成發揮著重要作用。白酒發酵體系是多菌種參與的體系，梭菌之間、梭菌和其他微生物之間都會存在相互作用。如梭菌利用其他種屬微生物的代謝產物為底物生長并代謝。C.kluyveri可以利用C.ljungdahlii產生的乙酸和乙醇合成丁酸和己酸。對濃香型白酒窖泥微生物追蹤發現，窖泥是厭氧菌的持續釋放源，厭氧菌（Clostridium、Petrimonas、Sedimentibacter和Syntrophomonas等）會不斷的遷移到酒醅當中。Gao[11]發現窖泥中的Caproiciporducens、Caloramator、Sedimentibacter和Caldicoprobacter等細菌遷移到了酒醅當中，而且這些微生物增加了酒醅微生物的多樣性，并產生了豐富的揮發性酸和直鏈醇，改善了白酒的風味[9-11]。

本實驗以山東某酒廠優質老窖泥作為研究對象，通過聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術結合窖泥理化性質，探究優質窖泥的梭菌微生物群落結構和豐度，為穩固窖泥質量提供了技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

窖泥采集：具體見1.2.1。

試劑及耗材：Gelstain 染液、Easytaq DNA 聚合酶、DNA maker，北京全式金生物科技有限公司提供；DNA 提取試劑盒、Dia Spin 柱式PCR 產物純化試劑盒、去離子甲酰胺、丙烯酰胺，生工生物工程（上海）股份有限公司；窖泥，來自山東某酒廠濃香型白酒車間。

儀器設備：PCR反應擴增儀，美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統，生工生物工程（上海）股份有限公司；ST16R高速冷凍離心機，美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥樣品采集

窖泥樣品：取10個窖泥樣品，分別為A班的A-1、A-2、A-3、A-4、A-5 號窖池和B 班的B-1、B-2、B-3、B-4、B-5 號窖池。均采集于山東某酒廠優質窖池的池底泥，將樣品保存在無菌自封袋中，迅速放置到-20 ℃備用。取樣方法參照五點取樣法，如圖1 所示分別在窖池底部的五個點進行取樣，在每個點分別取10 g 左右的窖泥樣品，然后將樣品混合均勻后置于無菌袋中，記錄樣品信息及相關理化指標，于-20 ℃保存備用。

圖1 窖池底部取樣示意圖

1.2.2 窖泥理化指標的測定

含水量測定：烘干法；pH 值：電位法；氨態氮：采用比色法；腐殖質：采用油浴法；有效磷：采用鉬酸銨比色法。具體操作方法參照白酒生產技術全書[1]。

1.2.3 窖泥微生物DNA提取

將窖泥樣品取出解凍，稱取0.23 g，按照生工土壤DNA 提取試劑盒說明書進行窖泥總DNA 的提取。

1.2.4 窖泥梭菌的PCR擴增

以提取到的窖泥總DNA 為模板。使用引物SJ-F（GC）和引物SJR 對窖泥微生物中的梭菌進行PCR擴增，引物及擴增程序參考盧振試驗方法[12-13]。

1.2.5 窖泥梭菌的變性梯度凝膠電泳

電泳完畢后取45 μL PCR 產物進行DGGE 分析。采用變性梯度為50%～55%、質量分數8%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE 緩沖液中60 V、60 ℃條件下電泳930 min。

使用gelatain 染液染色30 min，然后用超純水脫色30 min，利用凝膠成像系統拍照[14-17]。

1.2.6 條帶測序

用滅菌的手術刀切下待回收的DGGE 條帶，以引物SJ-F 和SJ-R 進行PCR 擴增，擴增產物連接至大腸桿菌Trans1-T1 感受態細胞，經藍白斑篩選和M13F/R引物PCR檢測后置于LB培養液中培養，將菌液進行測序分析。

2 結果與分析

2.1 理化指標檢測

由圖2 可知，參照趙長青窖泥指標進行比較[5]，所挑選的10 個優質窖泥水分含量檢測，A-1、B-1、B-4、B-5 為二級窖泥指標，A-2、A-3、A-4、A-5、B-2、B-3 為一級窖泥指標；pH 數據檢測結果表明，B-1、B-4 為二級窖泥指標，其余皆為一級窖泥指標；腐殖質的檢測結果顯示，所挑選的10 個窖泥所含有的腐殖質含量均滿足一級窖泥質量要求；有效磷和氨態氮檢測結果表明，除B-1 有效磷滿足一級窖泥指標外，其余優質窖池的窖泥檢測數據均高于文獻中一級窖泥指標。查閱文獻可知不同酒廠的窖泥理化指標因培養環境、地理位置、測定方法等因素而沒有一個統一的標準范圍，不同酒企要根據窖池的實際情況，依據酒廠窖泥理化指標的長期實驗數據積累和生產經驗來確定窖泥的參考指標。窖泥中絕大多數微生物以銨鹽和含氮有機物作為養料，氨態氮可以為窖泥中細菌的生長提供營養物質，故窖泥中氨態氮含量高可以判定窖泥的質量較好。有效磷是土壤中植物直接吸收利用的磷，是微生物生長、繁殖的必需成分之一，因此，較高的有效磷含量可以作為窖泥質量較優的指標。綜上所述，理化分析結果表明所選10 個窖泥在理化參數層面均符合優質窖泥的要求[21-22]。

圖2 窖泥理化檢測

2.2 瓊脂糖凝膠電泳

實驗結果如圖3 所示，所測10 個窖池泥中擴增到的梭菌條帶清晰明亮，且對照未擴增出目的條帶，說明擴增的結果可用于以下實驗的進行。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳

2.3 變性梯度凝膠電泳

2.3.1 DGGE指紋圖譜的豐度和優勢度比較

如圖4 和圖5 所示，在優質窖池泥中擴增出大量的梭菌綱微生物。條帶的數目代表了微生物種類，在B-2 號窖池泥中測出的梭菌綱微生物最多，有21 種；在B-1 號窖池泥測出的梭菌綱最少，有8種。這些優質窖池泥中分離出的共有微生物較多。條帶的寬度和亮度代表了微生物的含量，條帶越寬越亮，該微生物的含量就越大，在這些優質窖池泥中擴增出大量的優勢微生物，如15 號（圖5 所示的標號）在各自的泳道中均占到了5.2 %以上的比例[18-20]。

圖4 窖池泥梭菌DGGE指紋圖譜

圖5 窖池泥梭菌群落豐度示意圖

條帶（代表菌）在各自泳道中所占的比例如表1所示（以下標號同圖4 中的標號），4 號、7 號、15 號、23 號均存在于所有的窖泥中。在A-3、A-4 和B-1號窖池含量最多的菌是4 號菌；A-2 號窖池含量最多的菌是12 號菌；A-4 號窖池中含量最多的菌是14 號菌；A-1 號窖池含量最多的菌是中15 號菌；B-2、B-3、B-4 及B-5 號窖池含量最多的菌是13 號菌。根據泳道中各條帶所占比例可知B 班的5 個窖池中有4 個窖池的最優菌是相同的，優質窖池的優勢功能菌集中在這幾種菌[23-25]。

表1 泳道中各條帶所占比例

2.3.2 DGGE指紋圖譜的相似性比較

根據DGGE 指紋圖譜的條帶光密度值對檢測的10 個窖池進行聚類分析，聚類結果如圖6 所示。泳道6單獨為一簇；#1（A-1）、#2（A-2）、#4（A-4）聚為一簇，相似度在0.66～0.71 之間；其它6 個泳道聚為一簇，相似度在0.62～0.88 之間。相似度高于0.60 的群體具有較好的相似性，可知#1（A-1）號池、#2（A-2）號池和#4（A-4）號池具有較好的相似性，#7（B-2）號池和#9（B-4）號池的相似性較好，#8（B-3）號池和#10（B-5）號池的相似度較好。由此可見同一班次內的優質窖池的梭菌相似性較好，不同班次的梭菌相似性存在差異。

圖6 窖泥梭菌群落相似性指數樹狀圖

2.4 測序結果分析

在DGGE 指紋圖譜上選取處于不同位置且清晰明亮的條帶，剪切后進行擴增-連接-轉化-篩選-測序等一系列操作后獲得梭菌的16S rRNA 序列，經分析后結果見表2。

在窖池泥中檢測到的梭菌在科水平上有：真細菌科、毛螺菌科、顫螺旋菌科、梭菌科、Caldicoprobacteraceae、Tissierellaceae，其中梭菌科含量最高，其次為毛螺菌科和Tissierellaceae。在屬水平上有：嗜堿菌屬、丁酸弧菌屬、梭菌屬、喜熱菌屬、瘤胃梭菌屬、糞球菌屬、Sedimentibacter、Caldicoprobacter、Tepidimicrobium、Tissierella、Sporanaerobacter、硫酸鹽還原菌屬、魯替孢菌屬和Clostridiisalibacter[26]。

Alkalibaculum sporogenes發酵的終產物是醋酸酯；丁酸弧菌能夠產生丁酸，為十個優質窖池泥中共有的優勢菌，且該菌在無機和有機窖泥中也是共有的優勢菌，由此可見該菌是該廠窖泥中普遍存在的優勢菌；梭菌MT1 與己酸酯的合成相關；喜熱菌能發酵產生甲酸、乙酸、乳酸及乙醇，該菌在有機窖泥中檢測出但在無機窖泥中沒有檢出；Ruminiclostridium papyrosolvens是纖維素降解梭菌，分解纖維素的活性強；糞球菌屬，能發酵產物丁酸、乙酸和氣體，該菌在有機窖泥中檢測出過；沉積微生物（Sedimentibacter）又叫產氫產乙酸菌，能將元素硫、硫酸鹽或硫代硫酸鹽還原成硫化物(如硫化氫)，是非常重要的己酸菌；Caldicoprobacter是在五糧液、瀘州老窖等窖泥中檢測出的優勢菌[27]；Tepidimicrobium能夠利用乳酸，是降乳酸菌群的優勢微生物，是甲酚生產潛在菌；Sporanaerobacter acetigenes能利用一些糖類、多肽和氨基酸發酵產醋酸酯、異丁酸和異戊酸酯；硫酸鹽還原菌是一種厭氧、嗜熱、硝酸鹽和硫代硫酸鹽還原菌；魯替孢菌與纖維素降解有關。硫酸鹽還原菌、己酸菌、甲烷菌等共同組成厭氧發酵的循環通路，是優質窖泥的重要標志，由菌的代謝功能可知擴增到的細菌以己酸生成菌和硫酸鹽還原菌為主，硫酸鹽還原菌在釀酒發酵過程中發揮重要的作用，說明所選的窖池泥里面的功能菌達到益于白酒釀造的平衡狀態。大量研究表明，Sedimentbacter、Tissierella、Caldicoprobacter、硫 酸鹽還原菌、Sporanaerobacter、喜熱菌等是優質窖泥的重要的指示菌[28]。

3 總結

通過對所選山東某酒廠10 個窖泥的水分、pH值、有效磷、氨態氮和腐殖質進行檢測，結果顯示在理化參數層面均符合優質窖泥標準的要求。

通過PCR-DGGE 技術分析窖泥中微生物群落結構可知，在窖池泥中檢測到的梭菌在屬水平上有：嗜堿菌屬、丁酸弧菌屬、梭菌屬、喜熱菌屬、瘤胃梭菌屬、糞球菌屬、Sedimentibacter、Caldicoprobacter、Tepidimicrobium、Tissierella、Sporanaerobacter、硫酸鹽還原菌屬、魯替孢菌屬和Clostridiisalibacter，這些菌是優質窖泥的重要的指示菌，可知窖池泥中含有極其豐富的釀酒功能菌。

窖泥測序檢測出來的梭菌中的硫酸鹽還原菌、己酸菌、甲烷菌等共同組成厭氧發酵的循環通路，并且檢測到大量的己酸生成菌和硫酸鹽還原菌，其中以Sedimentibacter等為代表的己酸菌所占比重最大。將條帶與序列結果對應后發現丁酸弧菌、Sedimentibacter、Caldicoprobacter、Sporanaerobacter acetigenes、魯替孢菌等菌均存在于所有的窖泥中。其中窖池泥的主要優勢菌是硫酸鹽還原菌、Sporanaerobacter acetigenes、Sedimentibacter和Caldicoprobacter。

本研究通過對山東某酒廠濃香型白酒中十個窖泥的梭菌種類和豐富度進行探究和比較，揭示了可能在白酒釀造中起關鍵作用的梭菌菌群，在分子水平上為研究濃香型白酒提供了理論依據。后續可以通過從濃香窖泥中篩選優勢梭菌菌株進行培養，研究其相關特性，進一步為濃香型白酒生產提供理論依據。