陳化糧混合發酵生產燃料乙醇的效果研究

鄧衍宏，汪 虎，盧久靈，湯德朋，唐金超，劉慶國*

（1.宿州中糧生物化學有限公司，安徽宿州 234000；2.南京高新工大生物技術研究院有限公司，江蘇南京 210032）

燃料乙醇被認為是一種環境友好型的可再生能源，有很大的潛力取代傳統的化石燃料[1]。燃料乙醇與汽油一般按照1∶9 的比例混合，應用于汽車燃料，不僅可減輕對石油資源依賴的壓力，而且可減少汽車尾氣對空氣的污染，符合國家雙碳戰略部署[2-3]。

目前燃料乙醇主要生產方式為生物發酵法，即采用酵母為發酵菌種、淀粉質糖（糖蜜、木薯、玉米等）為原料進行深層液態發酵[4-5]。在我國，燃料乙醇生產原料以玉米、木薯和水稻等為主，但是近年來，我國玉米和木薯價格持續較高，使得燃料乙醇生產成本也水漲船高[6]。部分相關生產企業采用陳化糧為原料柔性混合或交叉生產已是當下乙醇行業發展趨勢，一方面消化陳化糧，有效維持農產品價值，增強市場的調控能力，另一方面也能暫時解決乙醇行業原料緊缺的問題，保障能源戰略[7]。

由于陳化糧（水稻和小麥等）長期儲藏，霉菌污染、毒素超標，不能直接作為口糧和飼料使用，必須經過特殊加工后才可飼養動物[8]。陳小麥中含有較高的非淀粉性多糖，導致陳小麥醪液黏度高，造成生產物料輸送能耗增高，管線堵塞；陳小麥的添加也會產生一部分具有還原性但不能被酵母利用的糖，導致發酵終點殘糖偏高[9-10]；陳小麥未提取谷朊粉，所以蛋白含量較高，可以適當減少氮源投加。另外，陳化水稻稻殼較多，淀粉含量較低，使得發酵酒精度偏低[11]，低酒精度發酵又造成下游蒸餾能耗偏高[12]。因此需采取與高淀粉含量的原料按一定比例進行混合發酵。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：安琪耐高溫活性酵母粉。

試劑及耗材：克菌靈（抑菌劑），山東安茂康生物科技有限公司；尿素，中國農資集團股份有限公司；酸性蛋白酶，廣西樂酵生物科技有限公司。

儀器設備：ZQZY-CF 震蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1BU 超凈臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-2450 紫外可見分光光度計，日本島津公司；顯微鏡，徠卡顯微系統（上海）有限公司；50 L發酵罐，迪必爾（上海）生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理

混合液化醪：按32 %干物質比例配制淀粉基原料（水稻∶小麥=6∶4）粉漿，調pH5.5 左右，溫度升溫至85 ℃以上，加液化酶16 U/g（淀粉基原料質量），液化2 h左右，降溫后調pH4.2左右。

淀粉液化醪：按22.0 %（w/v）濃度配置，調pH5.5左右，溫度升溫至85 ℃以上，加液化酶16 U/g（淀粉質量），液化2 h 左右。在使用前調pH4.2左右。

1.2.2 酒母培養

用潔凈的500 mL 三角瓶，裝150 mL 液化醪，并加活性干酵母粉0.2 g/L、糖化酶200 U/g（淀粉基原料質量）、酸性蛋白酶0.02 mL/L 和尿素0.2 g/L，搖勻后至150 r/min、28 ℃搖床環境下培養24～30 h，至酵母數達到2.2～2.5 億個/mL備用。

1.2.3 發酵

搖瓶：按一定的接種量加入至裝有200 mL 液化醪的500 mL 三角瓶中，加入與種子培養一致濃度的糖化酶，并加入10 mg/L 青霉素。每個條件做3 個平行樣。32 ℃靜置培養48～56 h，每隔8 h 手動搖勻一次。50 L 罐：參照搖瓶最優接種量和最佳配方，溫度32 ℃，80 r/min培養48～56 h。

1.2.4 分析方法

細胞數測定：取2.5 mL 混勻樣品放入100 mL容量瓶中，加1 mL 次亞甲基藍；定容后靜置1 min，置于血球計數板上，用顯微鏡計量細胞數量，其中，死亡率=染色細胞數/總細胞數。黏度、總糖、還原糖、揮發酸和酸度等參數測定參照文獻[13-14]。酒精度：量取100 mL發酵液，通過蒸餾裝置蒸餾，蒸出液體定量到100 mL，采用酒精度計進行酒精度測定。乙酸、乳酸等測定：液相色譜法，流動性為5 mM H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃。總氮：采用凱氏定氮儀。

2 結果與分析

2.1 不同淀粉添加量對混合發酵的影響

表1 所示的是混合液化醪和淀粉液化醪相關指標情況。由表1 可知，混合液化醪和淀粉液化醪的總糖相當，前者還原糖相對較低；混合醪液的黏度顯著較大，遠遠高于淀粉液化醪，這主要是混合醪液中小麥的蛋白含量較高導致[15]。淀粉醪液總氮含量為零，在使用中，需要添加適當尿素補齊氮源濃度。

表1 不同醪液指標對比

為了考察陳化淀粉直接摻混陳化糧進行乙醇發酵的可行性，在原陳化糧發酵液的基礎上添加不同比例的淀粉溶液（如表2 所示），其中接種量均15%，發酵48 h。實驗發現，用陳化糧醪液在此條件下，獲得最終酒精度為11.8%vol，殘總糖和還原糖水平較高，屬于嚴重發酵不徹底現象。隨著淀粉添加量加大，發酵酒精度顯著提升，殘總糖水平下降顯著。當添加量為40 %～50 %時，酒精度達到最高13.4%vol～13.6%vol，殘總糖降至較低濃度，發酵較為徹底。當添加量提到60 %時，殘總糖濃度回升，酒精度有下降趨勢。從細胞角度分析，當淀粉量加大到40%時，酵母數開始下降，這可能由于營養物質的缺乏限制了細胞生長。雖然淀粉添加量較低條件下，酵母數較高，但發酵強度未有提升，這可能由于體系黏度較大，影響了傳質作用，限制了發酵過程菌體對底物的利用速率。劉曉峰等[16]研究發現，添加20%的小麥，在不改變生產工藝的條件下，對生產影響不大。所以適當降低小麥比例有利于提高發酵指標。另外，在高粘體系中，由于物料品質和發酵強度慢，有生酸現象，對發酵體系不利。綜上分析，添加適量淀粉，有利于提升發酵強度和維持發酵體系的穩定性。

表2 不同淀粉添加量下發酵指標情況

2.2 高濃度乙醇發酵可行性

從上可分析出淀粉液化醪添加的體積分數為40%～50%時對發酵指標提升有利。當進一步提高體積分數時，發酵效果明顯下降，推測營養物質含量偏低。故采用提高淀粉液化醪中淀粉的含量，來維持發酵過程淀粉醪液的體積分數，同時可以提升發酵酒精度。結果如表3所示。

表3 淀粉液化醪不同總糖濃度對發酵影響

以淀粉醪液添加量50%作為實驗對照組。當提高淀粉液化醪中淀粉含量，在一定程度上可以提升酒精度，但當淀粉液化醪總糖超過250 g/L 以上時，混合后醪液總糖約240 g/L，對發酵初期有一定的抑制作用，尤其當淀粉液化醪總糖達到300 g/L左右時，抑制作用更為顯著，這也表現在較低的細胞數和較高的總糖水平方面。所以單純提高淀粉醪液淀粉含量，并不能有效提高發酵酒精度。

2.3 接種量對高濃度乙醇發酵的影響

由于淀粉的引入，增加了陳化糧醪液初始糖濃度，底物抑制顯著。隨著工業淀粉濃度的不斷增加，發酵體系中底物抑制將愈發顯著[17-19]。為了降低底物抑制對酵母細胞活性的影響，提高對高濃度淀粉乙醇發酵應用可行性，將醪液中酸性蛋白酶提高了4 倍以釋放更多的氮源促進細胞培養[20]，同時考察了不同接種量對總糖為270 g/L 的淀粉液化醪摻入混合醪液發酵的影響。

如表3 和圖1 所示，當提高酸性蛋白酶量（接種量均為15 %），可以有效提升酵母細胞數，從而提高發酵酒精度。而且隨著接種量增加，酵母數有明顯上升趨勢，殘總糖也有明顯下降。當接種量提高至30%以上，殘總糖降至15 g/L 左右，酒精度達到14.7 %vol；當接種量提到40 %時，酒精度可達15.1%vol；當接種量提升至50%時，酒精度并沒有明顯上升，這可能由于接種量過大，使得酵母生長消耗了部分碳源[21-22]。

圖1 不同接種量對混合醪液發酵的影響

另外，也分析了接種量對淀粉出酒率的影響。淀粉出酒率是酒精質量（以體積分數95%計）與原料中淀粉質量的百分比，可以充分考察不同淀粉含量原料生產乙醇的效率[23-25]。由于不同原料的淀粉含量不同，所以以淀粉出酒率考察發酵指標相對準確。從圖1 可以明顯發現，接種量為40%時出酒率較高，出酒率可達52.3 %。以上結果說明，提高酸性蛋白酶濃度和加大接種量，可以有效促進酵母細胞生長，從而提升發酵強度和出酒率。

2.4 成熟醪評價

在50 L 發酵罐中，以總糖270 g/L 的淀粉液化醪摻入混合醪液作為發酵原料，接入40 %的酒母進行小試驗證，結果如表4 所示，發酵成熟醪殘總糖、酒精度和生酸情況基本與搖瓶實驗一致，成熟醪特性（黏度）與搖瓶也無明顯差異，甚至在傳質較好的發酵罐中效果更好些。從表5 的DDGS（玉米酒精糟及可溶物，distillers dried grains with soluble）指標上能明顯發現，50 L 罐發酵固含物中蛋白含量較高（超過28%），灰分和粗纖維等指標不高，該結果表明陳化淀粉等混合原料發酵制備的DDGS 是一種良好的蛋白飼料。

表4 發酵成熟醪指標

表5 DDGS指標

3 結論

本試驗通過搖瓶試驗，以陳化水稻、陳小麥和淀粉為原料，研究酸性蛋白酶和接種量對于燃料乙醇發酵的影響。結果顯示，以陳化水稻和陳化小麥為基礎培養基，添加一定比例的淀粉有利于酒精度的提高，當添加量為40%～50%時，酒精度達到最高（13.4 %vol～13.6 %vol），總糖消耗較為徹底。采用高濃度淀粉醪液（總糖270 g/L 左右）可以提升酒精度，但效果有限。添加適量的酸性蛋白酶，能夠明顯提高發酵強度，尤其將接種量提升至40 %左右時，最高酒精度可達15.1%vol，出酒率達52%以上，其下游DDGS 產品指標也都較好。此研究結果表明將高濃度的淀粉以一定比例摻入到混合陳化糧醪液發酵是可行的，具有較強的工業化應用參考價值。