許 玲，董喬娟，姜明慧，王 洋，白秀彬，趙紀文*

(1.山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300；2.山東好客酒業有限公司，山東成武 274200)

優越的生態環境是中國白酒形成復合性、豐富性風格的自然條件。山東扳倒井股份有限公司地處北緯37°黃金名酒帶和黃河“安瀾灣”濕地交匯處。北緯37°是北半球暖溫帶的中位線，這里四季分明，溫度適宜，世界上許多著名的釀酒產區都分布在該自然帶上。黃河是中華民族的母親河，萬里黃河在高青“安瀾”形成了獨特的濕地環境，使扳倒井所在地具有溫暖濕潤、雨熱同期的地域環境。

大曲，是釀酒風格形成的關鍵。國井扳倒井白酒采用黃河流域的冬小麥制曲。這里的小麥歷經寒暑，經黃河水的灌溉，顆粒飽滿，富含淀粉、蛋白質等營養成分，制備的大曲品質優良，釀酒一酒多味，完善發展了非物質文化遺產“宋代扳倒井白酒釀造技藝”。為進一步解析黃河麥曲的優良性能，本研究對春季制曲過程進行全面跟蹤，運用高通量測序技術解析微生物多樣性，明確了大曲在不同發酵階段微生物群落結構和關鍵微生物種類，為優化操作、提升大曲質量提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

曲樣：黃河麥曲（春季生產過程），取自國井扳倒井制曲車間2#—19#曲房。

儀器設備：Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺（生工生物工程上海股份有限公司）；大曲酶系測定相關儀器設備均由山東扳倒井股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲發酵過程取樣

根據生產工藝，在入房、不同翻曲時間節點、出房時進行大曲樣品采集。采集時，按照四分法采樣，從曲房的四角和中間5 個位置各取3 塊長勢良好的大曲曲塊，全部粉碎后混合均勻，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 大曲理化指標及酶活力測定

測定大曲的水分、酸度、淀粉含量，糖化酶、液化酶、蛋白酶、酯化酶活力以及發酵力。按照《大曲檢測方法》（BDJ/JW-WSW-06）進行。

1.2.3 大曲微生物類群的多樣性分析

采用高通量測序技術分別對大曲中細菌類群和真菌類群的多樣性進行分析。

細菌的16S rRNA 定制V4 區擴增引物為：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），真菌擴增引物為ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。

PCR 反應體系：12.5 μL 2×Taq PCRMasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2Primer(5 μM)，2 μL 模板DNA，5 μL ddH2O。反應參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min 終止。擴增序列通過Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺進行測序，下機數據經過cutadapt（去除接頭）、PEAR(序列對拼)、Prinseq(質量剪切），去除得分低于20 分、堿基模糊、引物錯配或測序長度小于150 bp 的序列。

經過上述步驟后，將標簽分組具有97 %序列相似性的高質量的OTU 序列[14-16]，細菌得到的每個OTU 代表序列比對RDP 數據庫、silva 數據庫和NCBI 16S 數據庫，真菌得到的OTU 代表序列比對RDP 數據庫和UNITE 數據庫。最后再通過人工進行檢查以獲得物種信息。

2 結果與分析

2.1 大曲發酵過程品溫變化

由圖1 可知，扳倒井春季制曲時曲房內培養時間在24 d 左右。培養過程經過三次翻曲、一次合房。中挺時間7 d左右，中挺溫度60 ℃左右。

圖1 中高溫大曲發酵過程品溫變化

2.2 大曲理化指標變化

由表1可知，一翻前曲塊主要產酸，酸度由0.11上升至1.21，之后隨發酵有所降低；三翻時液化酶活力達到最大，二翻和三翻之間是液化酶大量生成階段，之后有所降低；小麥自身的糖化力較高，入房后糖化力降低，隨著發酵進行，由于微生物的作用，糖化力有所起伏，但最終出房糖化力比較高；小麥自身帶有發酵力，并且在整個發酵過程處于動態平衡；酯化力在合房到出房時是大量生成階段；酸性蛋白酶是大曲發酵過程產生的酶類，一翻前就大量生成，隨著發酵進行有所起伏。

2.3 微生物多樣性

2.3.1 16S高通量分析

由表2 可知，入房時曲塊的細菌菌群多樣性最小（shannon 值最小），二翻前多樣性越來越大，二翻后有所起伏；三翻前細菌菌群的豐富度越來越高，但三翻后逐漸降低。總體來看，二翻前的培養階段是大曲微生物菌系生長比較活躍的時期。

表2 Alpha多樣性指數統計表

由表3和圖2可知：

表3 屬水平下不同制曲階段的細菌相對豐度比例（%）

圖2 屬水平下不同制曲階段的細菌相對豐度柱狀圖

①制曲入房時，物料的微生物來源主要是原料和水中的微生物。因此鏈型植物占據絕對優勢（49.12%），其次是泛菌屬；

②之后的培養過程，泛菌屬（Pantoea）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）是主要的優勢菌屬，乳桿菌屬相對豐度占到42.5%；

③一翻后至二翻，泛菌屬（Pantoea）、魏斯氏菌屬（Weissella）和芽孢桿菌屬（Bacillus）占據優勢；

④三翻操作時，泛菌屬（Pantoea）再次占據絕對優勢，相對豐度比例高達49.82 %。分析可能與采集樣品有關；

⑤合房階段，不動桿菌屬（Acinetobacter）和泛菌屬（Pantoea）占據優勢，相對豐度分別是41.07 %和24.65%；

⑥出房時，未分類的腸桿菌科（unclassified_Enterobacteriaceae）占據絕對優勢，魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）也屬優勢菌屬。

2.3.2 ITS高通量分析

由表4 可知，入房時真菌的多樣性最小（shannon 值最小），隨著培養過程出現波動，但變化不大；真菌豐富度的變化與多樣性相似，出房時真菌豐富度最小。

表4 Alpha多樣性指數統計表

由表5和圖3可知：

表5 屬水平下不同制曲階段的真菌相對豐度比例（%）

圖3 屬水平下不同制曲階段的真菌相對豐度柱狀圖

①入房時，物料和水攜帶的優勢真菌為鏈格孢霉屬（Alternaria）和雙足囊菌屬（Dipodascus）；

②一翻時，優勢真菌屬發生較大變化，生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、根霉屬（Rhizopus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）占據優勢，尤其生絲畢赤酵母屬相對豐度高達39.97%；

③二翻時，威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）為優勢菌屬；

④三翻時，根毛霉屬（Rhizomucor）、根霉屬（Rhizopus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）成為優勢菌屬；

⑤合房時，根毛霉屬（Rhizomucor）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、根霉屬（Rhizopus）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）為優勢菌屬；

⑥出房時，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、根毛霉屬（Rhizomucor）為優勢菌屬。

2.4 綜合分析

2.4.1 溫度和水分對微生物多樣性的影響

①一翻之前，水分損耗較小，芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、根霉屬（Rhizopus）在小麥自身糖化的情況下，利用糖類迅速繁殖，占據微生物群落優勢，曲塊品溫由30 ℃上升到48 ℃左右。

②二翻至三翻時曲塊品溫到達60 ℃左右，并且持續時間較長。這個溫度對微生物的生長繁殖已經造成較大影響，但溫度的上升是有一個過程的，對大曲微生物形成了溫度馴化，因此，此時仍然由泛菌屬（Pantoea）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等耐高溫的菌屬占據優勢。經過這個高溫階段，水分散發也比較快，降到了14.8%。

③三翻后曲塊的品溫逐步降低，魏斯氏菌屬（Weissella）、生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）等又開始活躍成為優勢菌屬，尤其是出房時伊薩酵母屬（Issatchenkia）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）占據真菌較大優勢。

2.4.2 酶系與微生物菌屬的關系

①在一翻前乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）占據絕對優勢，推測是造成大曲酸度上升和酸性蛋白酶生成的主要菌屬；

②二翻至三翻時的根霉屬（Rhizopus）和根毛霉屬（Rhizomucor）占據優勢，推測是液化力和糖化力的主要貢獻者，尤其是液化力，在二翻和三翻時達到頂峰；

③合房后的后熟階段，酵母菌屬占據優勢，推測是出房酯化力的主要貢獻者。

3 結論

扳倒井黃河麥春季制曲工藝經歷三次翻曲，翻曲節點品溫控制為48 ℃、61 ℃、61 ℃，中挺時間控制在6～7 d，微生物菌群多樣性和酶系豐富，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）是造成大曲酸度上升和酸性蛋白酶生成的主要菌屬，根霉屬（Rhizopus）和根毛霉屬（Rhizomucor）是液化力和糖化力的主要貢獻者，酵母菌屬是大曲酯化力的主要貢獻者。下一步將進一步挖掘可培養的菌屬資源，并進一步探究其和制曲操作的對應關系，提升大曲質量，為白酒品質提升奠定基礎。