基于小鼠糞菌移植臨床前研究影響因素的討論

孫詩琪劉路胡雙元王雨巖孫銘聲趙凌

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610075；2. 針灸治療老年病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都中醫(yī)藥大學(xué)），成都 610075）

近年來，腸道微生物在健康和疾病中的作用成為熱點(diǎn)，其中糞便微生物移植，即糞菌移植（fecal microbiota transplant，F(xiàn)MT），是一種以腸道微生物為靶向，通過將供體糞菌移植到受體胃腸道，以重構(gòu)受體腸道菌群的治療方式[1]。 大量研究表明FMT不僅在治療潰瘍性結(jié)腸炎[2]、腸易激綜合癥[3]等腸道疾病中作用顯著，且對包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病（包括脊髓損傷[4]、阿爾茨海默癥[5]）、代謝性疾病（肥胖癥[6]、糖尿病[7]）等因腸道菌群紊亂引起的腸道外疾病同樣具有治療價值。 FMT 將腸道微生物變化與病理聯(lián)系起來，為疾病的治療及深入研究提供了新的思路和手段。 但FMT 應(yīng)對不同疾病的作用機(jī)制及不良反應(yīng)尚未明確，因而無法廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中，仍需依賴臨床前研究的深入。 當(dāng)前報(bào)道的FMT 臨床前研究中實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)高度不一致或不完整，嚴(yán)重影響了其研究的可重復(fù)性和結(jié)果解釋，阻礙了成果的臨床轉(zhuǎn)化。 本綜述從FMT 常用的小鼠受體著手，對其中包括受體選擇、飼養(yǎng)環(huán)境、抗生素使用、樣本采集及儲存條件、移植材料制備、移植途徑等在內(nèi)的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了討論，并對不同選擇的優(yōu)勢及局限性進(jìn)行分析。 上述影響因素的繁雜性提示亟需提供FMT 臨床前研究標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)以減少異質(zhì)性及非必要損耗、提升嚴(yán)謹(jǐn)性及可復(fù)制性的必要性。 本文回顧并分析近年的相關(guān)報(bào)道，從FMT 動物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟及重要影響因素著手，提出針對實(shí)現(xiàn)其研究可復(fù)制及標(biāo)準(zhǔn)化的建議，并對未來的研究提出展望。

1 受體動物選擇

1.1 不同品種及特征受體差異

嚙齒動物由于生理解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，被廣泛應(yīng)用于臨床前研究。 得益于腸道微生物在屬水平與人類的相似性，小鼠被廣泛應(yīng)用于FMT 的相關(guān)研究，盡管其豐度存在差異[8-9]，但研究人員在小鼠中發(fā)現(xiàn)了與人類相似的腸型，且不同菌株豐度差異導(dǎo)致的疾病表現(xiàn)與人類研究中結(jié)果一致，為小鼠在FMT 臨床前研究中的應(yīng)用提供了更多的可能[10]。LLEAL 等[11]在評估小鼠和大鼠作為人類微生物移植臨床前模型的性能時發(fā)現(xiàn)，較小鼠而言，大鼠的腸道環(huán)境表現(xiàn)出與人類更高的相似性，且大鼠捕獲人類腸道微生物的效率更高，未來或能成為日后建立人源化腸道微生物模型的重要工具。 但當(dāng)前，F(xiàn)MT 的基礎(chǔ)研究仍以小鼠為主，大鼠的使用仍有待更多研究的認(rèn)可。 除品系外，設(shè)計(jì)FMT 實(shí)驗(yàn)時還需考慮性別、年齡等影響因素，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同性別、年齡中都能得到解釋。 研究表明，腸道微生物狀態(tài)因性別及年齡而異，其豐度在不同性別受體中不盡相同[12]，F(xiàn)MT 療效也受受體年齡的影響[13-15]。 綜上所述，受體的選擇需要依據(jù)研究目的選擇最相適的品種及特征。

1.2 受體腸道微生物控制途徑

1.2.1 選擇無菌動物或無特定病原體動物限制常駐微生物

無菌（germ-free，GF）物由于缺乏常駐腸道微生物，在接收外源性腸道微生物時無須競爭，表現(xiàn)出對供體微生物的高效“吸收”，因而GF 動物被認(rèn)為是該領(lǐng)域的最佳受體模型[16-17]。 但GF 狀態(tài)會導(dǎo)致小鼠的異常發(fā)育或生理性改變，如：免疫及代謝系統(tǒng)異常、神經(jīng)系統(tǒng)異常等[18-20]；如選擇GF 模型則需要考慮規(guī)避其特異性改變對目標(biāo)疾病的影響（表1）。 同時，GF 動物在運(yùn)輸、飼養(yǎng)及處理中對成本投入、環(huán)境設(shè)施的高要求限制了其廣泛應(yīng)用，加之人類不存在等效的無菌狀態(tài)，因此使用GF 動物的研究從臨床前向臨床的轉(zhuǎn)化存在尚待解釋的環(huán)節(jié)。常規(guī)無特定病原體（specific pathogen free，SPF）動物，即指不攜帶潛在感染或條件致病的病原體的實(shí)驗(yàn)動物。 與GF 動物的無菌飼養(yǎng)不同，SPF 動物腸道菌群易受出生及成長環(huán)境的影響，通過對GF 與SPF 模型疾病表征異同的比較，能夠分析常駐腸道微生物對疾病的影響，更能進(jìn)一步聚焦其中單菌或多菌的具體作用。 簡化腸道微生物動物亦屬于悉生動物，如被報(bào)道的最小微生物群落（OligoMM12）小鼠或謝德勒菌群ASF（Altered Schaedler Flora）模型，作為含有明確微生物的受體模型，能實(shí)現(xiàn)對腸道微生物的更準(zhǔn)確把控[21-22]。 綜上，可選擇單獨(dú)通風(fēng)籠（Individual ventilated caging，IVC）系統(tǒng)在降低無菌飼養(yǎng)對環(huán)境設(shè)施及成本的雙重高要求的同時實(shí)現(xiàn)對菌群一定程度的控制[23]。 針對GF 動物存在的特異性改變，或能通過ex-GF 鼠，即出生后立即飼養(yǎng)于微生物充足但無病原體環(huán)境的鼠作為對照，以提供由于先天因素對研究結(jié)果產(chǎn)生影響的證據(jù)。

表1 不同受體動物模型間比較Table 1 Comparison between different receptor animal models

1.2.2 抗生素預(yù)處理消耗腸道微生物

通過抗生素預(yù)處理破壞菌群，有操作簡單、成本低、環(huán)境及設(shè)施要求低、可控性強(qiáng)的優(yōu)勢，是當(dāng)前普遍采用的誘導(dǎo)腸道微生物消耗的有效方法。 抗生素預(yù)處理不僅能實(shí)現(xiàn)FMT 前的腸道清理[24]，還能有效增強(qiáng)異體微生物的定殖能力[25]。 但研究者對攜帶不同微生物的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行抗生素預(yù)處理后，表現(xiàn)出抗生素?cái)_動后菌群的個體間變異[26]；并在不同抗生素單獨(dú)使用后觀察到對特定類別微生物的特異性改變[27-28]，提示不同抗生素及不同受體在腸道微生物消耗過程中存在個性化差異，建議選擇由多種抗生素混合的抗生素雞尾酒以實(shí)現(xiàn)腸道微生物的有效消除。 另有研究表明，使用抗生素將促生耐抗生素菌株，并增強(qiáng)病原體的腸道定植力，提升炎癥及感染風(fēng)險[29]；部分抗生素使用存在毒性反應(yīng)，包括誘發(fā)心血管疾病[30]、破壞血腦屏障[31]，甚至誘發(fā)認(rèn)知障礙[32]等。 因此建議使用被報(bào)道的不可吸收的抗生素，以規(guī)避由抗生素使用造成的額外影響[33]，如若目標(biāo)疾病存在使用抗生素?zé)o法規(guī)避的影響，則考慮采用其他替代方法[34]。 此外，據(jù)報(bào)道，給藥7 d 足以在保證受體腸道微生物耗盡的同時避免耐抗生素菌的過度生長或耐藥性的產(chǎn)生[35-36]，但不排除部分研究為保證微生物的徹底清除而選擇了更長的給藥時間。 在給藥方式中，口服灌胃能更好的控制給藥劑量及時間，但單次給藥能維持的抗生素作用時間有限；飲用水給藥雖能長時間維持藥效，但難以確保攝入藥品的劑量，需刻意記錄其飲水量以估算每日攝入抗生素劑量，不適于群居動物，還需要考慮抗生素在飲用水中的放置時間與穩(wěn)定性[37-39]。

基于上述的影響因素，研究人員提出建議：（1）在抗生素選擇方面建議選用被報(bào)道的不可吸收的抗生素類型，以規(guī)避抗生素對模型動物造成的額外影響，并以抗生素雞尾酒的形式配置，以涵蓋更廣泛的目標(biāo)微生物；從整理的結(jié)果來看，氨芐西林、新霉素、甲硝唑及萬古霉素的組合是最廣泛使用的；（2）建議采取間斷重復(fù)灌胃為主，飲用水添加抗生素維持為輔的給藥方式，在保證抗生素?cái)z入量的同時延長抗生素作用時間，以更徹底的清除腸道微生物；（3）給藥時間建議保持在7 ～10 d，在有效清除腸道微生物的同時盡可能避免產(chǎn)生抗生素毒性。由于當(dāng)前不同報(bào)道中抗生素給藥類型、給藥方式、持續(xù)時間及劑量等存在差異，基于上述建議研究人員整理了當(dāng)前高質(zhì)量報(bào)道中抗生素使用的配方及細(xì)則，以期為后續(xù)研究者提供參考（見表2）。

表2 抗生素腸道預(yù)處理方案細(xì)則Table 2 Details of the antibiotic enteral pretreatment program

1.2.3 其他替代方式

腸道清潔溶液（bowel cleansing，BC）是臨床腸道檢查常用的腸道清潔方法，但研究發(fā)現(xiàn)BC 溶液使用后，小鼠腸道微生物群同未處理小鼠一樣維持原始狀態(tài)，且異體微生物的定殖效率不及抗生素制備的腸道環(huán)境[92]；又或微生物群的結(jié)構(gòu)和組成在短期內(nèi)發(fā)生變化，但迅速恢復(fù)了初始狀態(tài)[93]。 盡管并不建議使用這樣的處理方式，但在抗生素不適用情況下BC 溶液可作為替代方法，或與抗生素聯(lián)合使用以增強(qiáng)對腸道微生物的清除效果[94]。 人源化菌群模型是通過移植人類患者的菌群到受體動物，使受體動物攜帶大部分的人類腸道微生物，以表現(xiàn)出一種或多種疾病特征，模擬疾病發(fā)病狀態(tài)。 該模型是藥物篩選或疾病發(fā)病機(jī)制等需要模擬還原疾病狀態(tài)人類腸道環(huán)境研究的重要工具[95]。 研究表明，當(dāng)前僅約47%的人類腸道菌群可以在小鼠中重建，其中超過1／3 發(fā)生顯著改變[16]；FMT 的療效因跨物種移植中外源性微生物定植受阻而減弱[34]，人類腸道環(huán)境在嚙齒動物中的完整重建仍有待后續(xù)研究的深入，如需選擇該模型則應(yīng)當(dāng)明確是否需要建立對照以對跨物種移植產(chǎn)生的紊亂作出合理解釋。

1.3 飲食及環(huán)境對腸道微生物的影響

腸道微生物的組成和比例是動態(tài)的，同時受內(nèi)部（年齡和遺傳背景）和外部（飲食和環(huán)境）因素的影響[96-97]。 通過控制飲食攝入及環(huán)境溫度可以誘導(dǎo)能量消耗、腸道菌群及代謝物的改變[98-101]。 基于飲食-環(huán)境-微生物群間相互作用的復(fù)雜性，研究者在使用相同飲食方案但光暗周期及環(huán)境溫度不同的嚙齒動物中觀察到腸道微生物組成的顯著差異，并在每日明暗循環(huán)及季節(jié)變化中觀察到腸道微生物的規(guī)律性改變[102-103]。 因此可考慮使用時間限制喂養(yǎng)（TRF）將飲食攝入控制在24 h 周期的特定時間內(nèi)，避免生物鐘改變對腸道菌群的影響[104]。此外，由于嚙齒類動物具有食糞習(xí)性，研究發(fā)現(xiàn)同籠飼養(yǎng)幾周后，微生物相關(guān)表型能夠在共同安置的小鼠間轉(zhuǎn)移，因而要避免將準(zhǔn)備接受來自不同組別供體的受體置于同一飼養(yǎng)區(qū)域[105]。 未來的FMT 臨床前研究當(dāng)謹(jǐn)慎選擇并在報(bào)告中交代實(shí)驗(yàn)動物所接受的飲食、環(huán)境（如溫度、濕度以及明／暗循環(huán)），以完整解釋飲食或環(huán)境因素對結(jié)果的影響。

2 移植前操作

2.1 樣本收集及儲存的建議

采集糞便樣本時建議先用75%乙醇消毒嚙齒動物肛門，然后用無菌棉球輕壓肛門同時按揉腹部，引起自發(fā)排便后立即將糞便顆粒轉(zhuǎn)移到冰上的無菌離心管或凍存管中；如果無法誘導(dǎo)即時排便可以將供體動物轉(zhuǎn)移到高壓滅菌籠或已消毒的獨(dú)立環(huán)境中，待其自然排便后再立即收集[106-109]。 嚙齒動物供體樣本除糞便外還可能涉及腸腔內(nèi)容物，可待動物麻醉后直接在厭氧無菌條件下采集[110]。 相較于局部內(nèi)容物而言全腸菌群移植（Wholeintestinal microbiota transplantation，WIMT）能夠相對完整的重建整個胃腸道環(huán)境[111]，且來自特定位置的微生物能夠選擇性地定殖到同源區(qū)域，因此當(dāng)需要重建整個胃腸道微生物狀態(tài)或?qū)δc道不同區(qū)域微生物進(jìn)行靶向分析、干預(yù)時WIMT 可作為最佳選擇。 上述空間異質(zhì)性提示胃腸道中不同部分間微生物不可相互替代，且其組成及豐度存在差異，據(jù)報(bào)道，與空腸和回腸相比，盲腸、結(jié)腸和糞便中的微生物含量更高，因而多被選擇[112]。 在采集時間上，基于報(bào)道的嚙齒動物24 h 內(nèi)腸道微生物豐度變化規(guī)律，建議在7：00 ～11：00 或15：00 ～17：00 進(jìn)行，以避免晝夜節(jié)律影響樣本成分的穩(wěn)定性[112-113]。

研究表明哺乳動物腸道內(nèi)多數(shù)微生物屬于厭氧菌，在氧氣中暴露將使這些菌群失去活性[114]，為最大限度保留微生物活性，糞便樣本的采集及勻質(zhì)化、過濾等操作需要在厭氧條件下進(jìn)行。 糞便的采集難以在絕對厭氧的環(huán)境中進(jìn)行，因此建議使用厭氧袋或在裝有二氧化碳的開放式容器中進(jìn)行的半?yún)捬跆幚矸ā?若采集腸腔內(nèi)容物則可當(dāng)動物處死后在厭氧室內(nèi)進(jìn)行，并使用脫氧溶液進(jìn)行稀釋和均質(zhì)。

低溫凍存是保持糞便樣本中微生物組成及豐度的有效方式，樣本在采集后及運(yùn)輸過程中需保持4 ℃或臨時冰上保存，短期保存時-20 ℃可以實(shí)現(xiàn)對其中微生物定殖能力的保護(hù)，如需凍存超過6 個月則需要-80 ℃儲存，以保證定植能力不受影響[115-117]，但理想模式是采集后1 h 內(nèi)制備并立即移植[118]。 需要強(qiáng)調(diào)的是，凍融循環(huán)比持續(xù)長時間凍存更傷害微生物活性，如不能持續(xù)低溫凍存，可以暫存于較低溫環(huán)境，避免反復(fù)的凍融循環(huán)。 樣本長期零度以下儲存時需添加冷凍保護(hù)劑（cryoprotectants，CPA），如15%或20%（v／v）甘油及5%（v／v）二甲基亞砜亦或麥芽糊精與海藻糖混合物（1 ∶3）等[119]，以減少凍融環(huán)節(jié)對細(xì)胞的損傷，并保持凍存樣本的菌株活性[120]。 此外，凍干樣品能更大限度保持微生物穩(wěn)定性[121]，糞便等分吸管技術(shù)（Fecal Aliquot Straw Technique，F(xiàn)AST）能實(shí)現(xiàn)不解凍情況下的二次取樣[122-123]，研究者可持續(xù)關(guān)注新報(bào)道的方法以選擇成本及設(shè)施范圍內(nèi)的最佳儲存方案。

2.2 移植材料制備的建議

制備移植材料時樣本需先稀釋并過濾后，再按照比例懸浮在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中靜置沉淀，然后以預(yù)設(shè)參數(shù)反復(fù)離心[124-127]，制備完成后應(yīng)立即進(jìn)行移植（圖1）。 為避免微生物成分在移植前發(fā)生改變，建議在移植前10 min 臨時制備移植材料，以保證最短的氧氣暴露時間。 如果不具備新鮮制備條件，可以將新鮮樣本立即制成移植材料然后低溫凍存，至使用時再解凍[126]。 本文回顧了近年的相關(guān)研究，在移植材料的制備過程中盡管具體配置比例及離心參數(shù)有所不同，但大致步驟相似，研究人員總結(jié)了其中相對完整的操作方案以供參考（表3）。

圖1 糞菌移植的關(guān)鍵步驟Figure 1 Critical steps in fecal bacteria transplantation

表3 糞菌移植前關(guān)鍵操作細(xì)則Table 3 Details of key operations before fecal bacteria transplantation

3 移植途徑的選擇

口服灌胃或灌腸給藥是嚙齒動物FMT 最為常見的移植途徑（圖1），口服灌胃給藥因具有給藥量可控且無需麻醉的優(yōu)勢而更廣泛采用，移植時通過彎頭灌胃針將移植材料注入受體胃內(nèi)，以盡可能避免與氧氣的接觸，保持厭氧菌活性。 通常可以選擇每天給予受體動物100 ～200 μL 的移植材料，持續(xù)7 ～ 14 d 以確保異體腸道微生物的成功定植[150-151]；亦可選擇集中連續(xù)給藥3 d，而后每隔1 d 給藥1 次，能達(dá)到同等的移植效果[152-153]。 不同報(bào)道中移植材料的使用量存在差異，相對標(biāo)準(zhǔn)化的建議是根據(jù)每10 g 體重給予0.1 mL 液體（微生物移植或生理鹽水）的比例個性化給藥[108]，或明確將每只受體動物每日接受的移植量控制在200 μL（108CFU／mL）內(nèi)[112，154]。 肛門給藥時將涂抹石蠟油的置入管輕插入肛門，再把加熱到體溫的懸浮液緩慢注入，拔下置入管后用棉簽按壓肛門處，并倒置動物1 min，防止液體流出[155-156]。 研究表明，灌腸給藥在壞死性結(jié)腸炎等相關(guān)腸道疾病中可以更好的發(fā)揮減輕炎癥等作用[157]，研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適宜的移植途徑。 報(bào)道中亦有通過將移植材料涂抹于受體動物皮毛等基于接觸共生環(huán)境中微生物接受定植的方式，但這類方式無法明確攝入量且無法實(shí)現(xiàn)微生物群的完整傳遞[75，158-159]，在結(jié)果解釋上或存在疑慮。 人類FMT 往往需要多輪移植來保證定值效果，但相對無菌條件下的受體動物是否同樣需要多輪移植尚無定論，通常認(rèn)為當(dāng)目標(biāo)微生物較為復(fù)雜時，建議進(jìn)行一輪以上的定植以保證定殖效率。 亦或者通過熒光染色、16S rRNA 全長測序等方式對其定植情況進(jìn)行監(jiān)測[160]，以保證成功移植。

4 展望

一篇關(guān)于洗滌菌群移植（washed microbiota transplantation，WMT）的報(bào)道[161]基于智能化糞菌分離系統(tǒng)及嚴(yán)格質(zhì)控相關(guān)漂洗過程的概念，通過以具體菌群數(shù)量作為精確劑量的衡量依據(jù)，并且通過自動凈化系統(tǒng)去除了大部分病毒及促炎物質(zhì)，在量化和質(zhì)控移植材料、提高治療安全性等方面將未來FMT 研究引入機(jī)械化精度把控時代。 研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群產(chǎn)生的脂質(zhì)能夠進(jìn)入循環(huán)并控制與微生物組成相關(guān)的表型變化，同時能顯著影響包括炎癥信號在內(nèi)的多種信號通路[162]，未來腸道微生物源脂質(zhì)的應(yīng)用或能通過靶向特定受體調(diào)控信號通路，實(shí)現(xiàn)針對性個性化治療，同時有效避免病原體的伴隨轉(zhuǎn)移。 基于當(dāng)前對FMT 后微生物定植規(guī)律的不明晰，IANIRO 等[163]發(fā)表的一項(xiàng)分析供體菌株植入率與療效關(guān)系的研究提出，建立可預(yù)測FMT 后菌株定植情況的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，能夠幫助選擇最匹配受體的菌群供體，提示在未來研究中通過智能算法的廣泛應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)對FMT 后受體腸道菌群的精準(zhǔn)預(yù)測，以確定最佳供體。 此外，未來若能基于機(jī)器學(xué)習(xí)等手段預(yù)測藥物成分-腸道微生物-宿主間的復(fù)雜作用，或能有效助力化學(xué)結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的藥物作用機(jī)制的闡釋、應(yīng)用思路的拓展[164-165]

5 總結(jié)

基于當(dāng)前FMT 臨床前研究的報(bào)道中實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的高度不一致，亟需標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)指導(dǎo)。 本文回顧并討論了FMT 動物實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟細(xì)節(jié)，其目的在于提高實(shí)驗(yàn)動物、耗材及勞動力等因素的利用率，其中部分是基于當(dāng)前動物實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，其他則是綜合參考了評議性文章[166-167]。 受限于回顧的文獻(xiàn)以小鼠為目標(biāo)對象，以上提及的方法學(xué)建議或存在偏倚，期待更多關(guān)于FMT 臨床前研究方法學(xué)建議的文章，并最終提出“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的方法學(xué)指導(dǎo)。