針刺損傷后修復中的淋巴樣結(jié)構(gòu)

陳丹丹，于寧，劉然，孟繁偉?

（1. 山東中醫(yī)藥高等專科學校解剖教研室，山東煙臺 264100；2. 山東中醫(yī)藥高等專科學校口腔教研室，山東煙臺 264100）

外傷性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴重的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病，可導致患者感覺障礙和運動功能永久性喪失，給患者及家屬造成沉重的打擊。 脊髓損傷后壞死的神經(jīng)組織會產(chǎn)生大量的包括脂類在內(nèi)的廢物，而這些物質(zhì)的及時清除對于脊髓損傷后的修復、重建很重要[1]。 脂類的運輸通常是通過內(nèi)皮細胞間隙較大的毛細淋巴管[2]，而非中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的連續(xù)型毛細血管[3]。 傳統(tǒng)觀念認為CNS 缺乏淋巴管，但是隨著技術的發(fā)展，陸續(xù)有研究證實腦脊膜淋巴管在小鼠[4-7]、大鼠[8]和人[9]等中均存在，同時，在維系內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、腦脊液循環(huán)穩(wěn)定以及控制包括免疫細胞在內(nèi)的大分子物質(zhì)進出中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用[6]。

據(jù)報道，小鼠淋巴管的發(fā)育大約在胚胎期第9.5 天開始，主要來源于前主靜脈靜脈內(nèi)皮細胞的亞群[10]。 后者表達SOX18（SRY-related box-18），SOX18 通過與其啟動子結(jié)合來激活同源異型盒基因轉(zhuǎn)錄因子1（prospero-related homeobox 1，prox-1）轉(zhuǎn)錄。 prox-1 被認為是淋巴管分化的“關鍵調(diào)節(jié)因子”，在驅(qū)動淋巴管生成及其維持方面發(fā)揮重要作用[11]。 胚胎期第10.0 天，血管內(nèi)皮生長因子3（vascular endothelial growth factor 3，vegf3）誘導血管內(nèi)皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor 3，vegfr3）陽性淋巴管內(nèi)皮祖細胞從靜脈出芽，靜脈內(nèi)皮細胞亞群從靜脈分離并開始表達淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1 （lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1， lyve-1）[12]。lyve-1 促進平足蛋白（podoplanin）在靜脈內(nèi)皮細胞亞群中均勻表達。 lyve-1 和podoplanin 是淋巴管生成的關鍵介質(zhì)[13]。 vegf3 通過與vegfr3 的結(jié)合啟動淋巴管的發(fā)芽和原始淋巴囊的形成，使得淋巴管內(nèi)皮細胞（lymphatic endothelial cells，LECs）從靜脈中分離并增殖發(fā)育成淋巴管。 淋巴管的發(fā)育形成在小鼠胚胎期第14.5 天完成。 因此，prox-1、lyve-1、podoplanin 和vegfr3 被廣泛用作LECs 標記物以檢測各種情況下的淋巴管生成[14-15]。 ANTILA 等[16]對出生后小鼠腦膜淋巴管的發(fā)育進行了詳細的研究，發(fā)現(xiàn)小鼠腦膜淋巴管首先出現(xiàn)在顱骨和椎管基底部的椎間孔周圍，然后沿著血管、腦神經(jīng)和脊神經(jīng)萌芽到腦脊膜周圍的各個部位，且具備可塑性和再生潛力。 脊髓損傷后，脊膜部位的淋巴管出現(xiàn)廣泛重塑[7-8]。 但是脊髓內(nèi)部是否存在淋巴管以及脊髓損傷修復的過程中是否有淋巴管參與均未見報道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)穿透性顱腦損傷后，受損的小鼠腦組織中檢測到LECs 標志物的表達，考慮LECs 在CNS 損傷中的表達可能與淋巴管促進損傷組織清除有關[17]。 本實驗通過建立小鼠脊髓針刺損傷模型，運用免疫組織化學技術檢測正常小鼠脊髓及針刺損傷后小鼠脊髓中LECs 標志物的表達情況，探討正常成年小鼠脊髓是否分布有淋巴管樣結(jié)構(gòu)及其走行、分布特征；觀察脊髓損傷處重建過程中有無新生淋巴管樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)及其可能來源，以期為CNS 損傷后的臨床修復治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

39 只4 周齡SPF 級雌性健康KM 小鼠，體重18～25 g，購于濟南朋悅動物繁育有限公司【SCXK（魯）2019 0003】。 飼養(yǎng)期間，自由飲食水，控制濕度40% ～60%，溫度23 ～25 ℃，按晝夜各半循環(huán)照明，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學院動物實驗室【SYXK（魯）2018-0029】。 所有操作符合山東中醫(yī)藥高等專科學校動物實驗倫理學要求（2021-47）。

1.1.2 主要試劑與儀器

lyve-1 抗體（R＆D Systerms，美國），CD34 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國）、prox-1 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國），podoplanin抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國），Alexa Fluor?488 IgG（武漢安特捷生物技術有限公司，中國），DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國）。 倒置熒光相差顯微鏡（Olympus IX51 ＋DP72，日本），組織包埋機（Leica HistoCore Arcadia，德國），烘片機（Leica HI1220，德國），展片機（Leica HI1220，德國），切片機（Kedee KD2258，中國）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模

小鼠隨機分為兩組：正常組6 只和損傷組33只。 將損傷組小鼠隨機分為術后1 d 組、術后3 d組、術后5 d 組、術后7 d 組和術后14 d 組，每組6只。 損傷組部分小鼠針刺損傷后死亡3 只，后隨機補充樣本。 造模前將KM 小鼠以1%戊巴比妥鈉按50 mL／kg 劑量行腹腔注射麻醉后，取俯臥位，固定小鼠四肢，胸腰節(jié)段附近背部備皮、消毒。 正常組切開皮膚、不進行針刺損傷，損傷組小鼠顯露棘上韌帶，剪斷T12 與L1 之間棘間韌帶，使用直徑0.45 mm 的26 號針灸針垂直刺入椎管，見小鼠下肢出現(xiàn)明顯的肌肉抽搐，拔出針體，縫合棘上韌帶、皮膚，關閉切口。

1.2.2 術后處理

術后，將小鼠置于37 ℃溫箱復溫蘇醒，然后，飼養(yǎng)于23 ～25 ℃的室溫環(huán)境，自由進食和飲水，每7 d 更換墊料。 分別在術后第1、3、5、7、14 天經(jīng)1%戊巴比妥鈉過量麻醉處死各組小鼠取脊髓標本。正常對照組小鼠只將背部皮膚切開，不做椎管內(nèi)針刺處理。

1.2.3 脊髓組織取材

小鼠在相應時間點經(jīng)1%戊巴比妥鈉麻醉后，迅速打開胸腔，經(jīng)左心室至升主動脈插管，首先用100 mL 生理鹽水灌注，再用4%（pH ＝7.4，4 ℃）的多聚甲醛快速灌注，隨后慢速灌注150 mL。 確定小鼠脊柱胸腰段交界處，切開皮膚，用眼科鉗咬斷椎板，暴露脊髓，在針刺部位上下5 mm 處剪斷，將取下的脊髓置于4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，進行脫水、透明、浸蠟、包埋。 在針刺點周圍行連續(xù)組織切片，將5 μm 厚的縱切面標本黏附在玻片上。

1.2.4 脊髓組織免疫組織化學染色及定量分析

（1）HE 染色觀察脊髓針刺損傷后病理過程：脊髓組織在多聚甲醛中固定24 h 后，修剪為約5 mm3的組織塊，石蠟包埋切片，HE 染色，封片后，鏡下觀察、拍照。

（2）脊髓組織免疫組織化學染色：采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合（SABC）法進行免疫組織化學染色操作：切片常規(guī)脫蠟、入水，用PBS 漂洗3 次，每次5 min；37 ℃水浴箱胰酶法抗原修復10 min， PBS 漂洗3 次，每次5 min；10%的山羊血清封閉1 h。 孵育一抗：使用1% BSA 按比例稀釋一抗，分別滴加CD34（1 ∶200）、prox-1（1 ∶100）、podoplanin（1 ∶100）和lyve-1（1 ∶100）到切片組織上將其覆蓋，之后將切片放入濕盒中4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，取出濕盒，在37 ℃水浴箱復溫1 h， PBS 漂洗 3 次， 每次5 min，滴加生物素化二抗到切片組織上將其覆蓋。 DAB 顯色，蘇木素復染，充分水化，光鏡下觀察。

（3）定量分析：每只小鼠在針刺點周圍選取5 張切片，每張切片隨機選取10 個高倍視野，拍照。應用Image-Pro Plus 6.0 進行prox-1 陽性表達的半定量分析，統(tǒng)計平均光密度值。

1.2.5 脊髓組織免疫熒光染色

根據(jù)組織免疫熒光染色步驟進行操作：切片常規(guī)脫蠟、入水，PBS 漂洗3 次，每次5 min；37 ℃水浴箱胰酶法抗原修復10 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min； 10%的山羊血清封閉1 h。 孵育一抗：使用1% BSA 按比例稀釋一抗，分別滴加CD34（1 ∶200）、prox-1（1 ∶100）、podoplanin（1 ∶100）和lyve-1（1 ∶100）到切片組織上將其覆蓋，之后將切片放入濕盒中4 ℃孵育過夜。 一抗孵育結(jié)束后，取出濕盒，故在37 ℃水浴箱復溫1 h，PBS 漂洗3 次，每次5 min，后續(xù)操作全程避光，滴加TRITC 或alexa fluor＠488，37 ℃， 60 min，防淬滅封片劑封片，4 ℃，避光保存。暗室中熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

所獲的數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0 進行分析，計量資料使用平均值± 標準差（±s）表示。 計量資料滿足正態(tài)分布時，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，三組及以上比較采用單因素方差分析。 若計量資料不滿足正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗進行分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓針刺損傷小鼠模型

針刺脊髓損傷過程中，有3 只小鼠死亡，考慮由于針刺小鼠脊髓過深或定位不準確所致。 后改進實驗措施：在T12 為中心，沿背部正中縱行切開皮膚2 cm，暴露椎骨，顯露棘上韌帶，剪斷T12 與L1 之間棘間韌帶，使用直徑0.45 mm 的26 號針灸針垂直刺入椎管，見小鼠下肢出現(xiàn)明顯的肌肉抽搐，拔出針體，縫合棘上韌帶、皮膚，關閉切口。 改進后實驗小鼠無死亡。

2.2 脊髓針刺損傷后病理過程

HE 染色顯示正常組脊髓中灰質(zhì)與白質(zhì)分別分布于中央和外周，神經(jīng)元大小形態(tài)正常，白質(zhì)中神經(jīng)纖維排列整齊，無斷裂（圖1A）。 損傷組針刺術后1 d，損傷處灰質(zhì)可見明顯的出血，周圍組織結(jié)構(gòu)紊亂，連續(xù)性出現(xiàn)中斷（圖1B）。 針刺術后3 d，損傷處可見神經(jīng)纖維排列紊亂，相互之間出現(xiàn)大量不規(guī)則孔隙，并伴有炎性細胞浸潤（圖1C）。 針刺術后5 d， 損傷處被大量新生細胞逐漸替代，細胞間隙減少，排列無序（圖1D）。 針刺術后7 d，損傷處間隙逐漸縮小，被肉芽組織逐漸替代（圖1E）。 針刺術后14 d，損傷處被瘢痕組織替代（圖1F）。

圖1 脊髓HE 染色Figure 1 HE staining of spinal cord

2.3 脊髓針刺損傷前、后LECs 標記物的表達變化

2.3.1 脊髓針刺損傷前、后podoplanin 的表達變化

正常組小鼠脊髓中左右兩側(cè)均檢測到典型的podoplanin 陽性淋巴管，其呈節(jié)段性分布，走行與脊髓長軸相垂直，分布于中央管與脊髓邊緣之間（圖2A）。 針刺術后1 d，損傷處均未發(fā)現(xiàn)LECs 特異性標識分子podoplanin 的陽性表達（圖2B）；針刺術后3 d，損傷處的肉芽組織中可檢測到podoplanin 陽性表達細胞的分布（圖2C）；針刺術后5 d，損傷處的肉芽組織中檢測到podoplanin 陽性表達細胞的分布（圖2D），針刺術后7 d，肉芽組織中血管周圍出現(xiàn)了典型的podoplanin 陽性淋巴管結(jié)構(gòu)（圖2E）；針刺術后14 d，瘢痕處邊緣仍有podoplanin 陽性細胞分布（圖2F）。

圖2 各組脊髓免疫組織化學染色檢測podoplanin 的表達Figure 2 Expression of podoplanin in each group of spinal cord measured by IHC

2.3.2 脊髓針刺損傷前、后lyve-1 的表達變化

正常組小鼠脊髓中左右兩側(cè)均檢測到lyve-1 陽性淋巴管樣結(jié)構(gòu)，其呈節(jié)段性分布，走行與脊髓長軸相垂直，分布于中央管與脊髓邊緣之間（圖3A）。針刺術后1 d，損傷處均未發(fā)現(xiàn)LECs 特異性標識分子lyve-1 的陽性表達（圖3B）；針刺術后3 d，損傷處的肉芽組織中檢測到lyve-1 陽性表達細胞的分布（圖3C）；針刺術后5 d，損傷處的肉芽組織中檢測到lyve-1 陽性表達細胞的分布（圖3D）；針刺術后7 d，肉芽組織中血管周圍出現(xiàn)lyve-1 陽性表達細胞（圖3E）；針刺術后14 d，瘢痕組織周圍出現(xiàn)的典型的lyve-1 陽性淋巴管樣結(jié)構(gòu)（圖3F）。

圖3 各組脊髓免疫組織化學染色檢測lyve-1 的表達Figure 3 Expression of lyve-1 in each group of spinal cord measured by IHC

2.3.3 脊髓針刺損傷前、后prox-1 的表達變化

正常組小鼠脊髓不表達prox-1（圖4A）。 針刺術后1 d，損傷處出現(xiàn)大量prox-1 陽性表達細胞（圖4B）；針刺術后3 d，損傷處的肉芽組織中檢測到prox-1 陽性細胞表達（圖4C）。 針刺術后5 d，肉芽組織中可以看到prox-1 陽性細胞，部分prox-1 陽性細胞形成淋巴管結(jié)構(gòu)（圖4D）。 針刺術后7 d，肉芽組織中prox-1 陽性淋巴管狀結(jié)構(gòu)持續(xù)存在（圖4E）。針刺術后14 d，瘢痕組織周圍prox-1 陽性細胞基本消失（圖4F）。 通過檢測免疫組織化學平均光密度值發(fā)現(xiàn)，針刺術后1 d，prox-1 高表達。 針刺術后3 d， prox-1 表達下降。 針刺術后5 d，prox-1 表達繼續(xù)下降。 針刺術后14 d，prox-1 不表達（圖4G）。

圖4 各組脊髓免疫組織化學染色檢測prox-1 的表達Figure 4 Expression of prox-1 in each group of spinal cord measured by IHC

2.4 脊髓損傷前、后血管分布的變化

正常組小鼠脊髓中血管內(nèi)皮標記物CD34 陽性細胞很少表達（圖5A）。 損傷組針刺后1 d，損傷處未見CD34 陽性細胞（圖5B）。 針刺后3 d，損傷處開始出現(xiàn)CD34 免疫陽性反應物（圖5C）。 針刺后5 d， 損傷處肉芽組織中可見到CD34 陽性細胞顯著表達，廣泛分布（圖5D）。 針刺后7 d，損傷處可見到CD34 陽性細胞反應物的顏色變淺，數(shù)量仍然較多（圖5E）。 針刺術后14 d，瘢痕組織處已無CD34陽性細胞檢出（圖5F）。

圖5 各組脊髓免疫組織化學染色檢測CD34 的表達Figure 5 Expression of CD34 in each group of spinal cord measured by IHC

2.5 免疫熒光雙重染色結(jié)果

針刺后3 d，脊髓針刺損傷處出現(xiàn)的新生細胞部分共表達lyve-1／podoplanin、lyve-1／prox-1 和CD34／prox-1，且lyve-1／prox-1 共表達的新生細胞呈典型淋巴管狀結(jié)構(gòu)（圖6）。

圖6 損傷組術后3 d lyve-1／podoplanin、lyve-1／prox-1、CD34／prox-1 熒光雙重染色結(jié)果Figure 6 Lyve-1／podoplanin， lyve-1／prox-1 and CD34／prox-1 on 3 d after spinal cord injury by immunofluorescence

3 討論

淋巴管由淋巴管內(nèi)皮細胞構(gòu)成，外面附有薄層平滑肌及外膜。 淋巴管參與運輸脂類、蛋白質(zhì)、免疫細胞等的功能，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫防御功能方面發(fā)揮重要的作用[18]。

目前已發(fā)現(xiàn)并常用的LECs 標志物有：vegfr3，應用最早最廣泛[19]；prox-1，被認為是淋巴管分化的主要調(diào)控基因，可以促使靜脈分化為淋巴管[20-21]；lyve-1，參與淋巴管系統(tǒng)的透明質(zhì)酸代謝，是最具特征的淋巴內(nèi)皮標記之一[22-23]；podoplanin，主要表達于LECs[24-25]。 目前關于淋巴管尚未發(fā)現(xiàn)唯一的特異性標記物[26]。 因此，多個LEC 標記物常被聯(lián)合應用以提高LECs 鑒定的特異性。 本研究同時使用prox1、lyve-1、podoplanin 進行淋巴管標記。

實驗采用免疫組織化學技術檢測正常小鼠脊髓中LECs 標志物prox1、lyve-1 和podoplanin 的表達情況，發(fā)現(xiàn)在正常小鼠脊髓中prox1 不表達，lyve-1和podoplanin 存在節(jié)段性陽性表達，分布于脊髓中央管與脊髓邊緣之間，其走行與脊髓長軸相垂直，中央管兩側(cè)均存在且基本呈左右對稱現(xiàn)象。 因此，推斷在正常小鼠脊髓中可能存在淋巴管樣結(jié)構(gòu)，并執(zhí)行特定的功能。 損傷之后的小鼠脊髓中觀察不到lyve-1 和podoplanin 的陽性淋巴管樣結(jié)構(gòu)的存在。

在本次動物實驗中，運用免疫組織化學技術檢測針刺損傷后脊髓內(nèi)相關LECs 標志物的表達，發(fā)現(xiàn)針刺后3 d，小鼠脊髓肉芽組織中prox1、lyve-1 和podoplanin 表達明顯增加。 針刺后5 ～7 d，肉芽組織中出現(xiàn)典型的prox1 陽性淋巴管樣結(jié)構(gòu)。 針刺后7 d，出現(xiàn)典型的podoplanin 陽性淋巴管樣結(jié)構(gòu)，針刺后14 d，出現(xiàn)典型的lyve-1 陽性淋巴管樣結(jié)構(gòu)。針刺后3 d，lyve-1／podoplanin、lyve-1／prox-1 熒光雙重染色結(jié)果進一步表明脊髓針刺損傷后組織修復過程中出現(xiàn)了新生LECs 標志物的陽性表達，并呈現(xiàn)典型的淋巴管樣結(jié)構(gòu)。 脊髓損傷勢必會發(fā)生炎性反應，壞死的神經(jīng)組織會產(chǎn)生大量的包括脂類在內(nèi)的廢物，而這些物質(zhì)的及時清除對脊髓損傷后的重建很重要[1]。 脂類通常是通過內(nèi)皮細胞間隙較大的毛細淋巴管運輸[2，27]。 同時，炎癥又可促進淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管道形成[28]。 淋巴管結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)往往意味著可以執(zhí)行淋巴管功能。 這與之前研究的小鼠大腦貫通傷處組織修復重建過程出現(xiàn)了新生淋巴管[17]的結(jié)果相一致，提示CNS損傷修復過程中極可能出現(xiàn)了新生淋巴管，新生淋巴管可以清除壞死神經(jīng)細胞的磷脂分解產(chǎn)物及炎癥細胞，是損傷后重建的重要一環(huán)[29]。 針刺后14 d，lyve-1 和podoplanin 陽性反應物只在瘢痕組織周圍存在，且表達明顯減少，而瘢痕組織周圍很少有陽性表達，說明新生淋巴管在損傷后的出現(xiàn)為一過性。 當損傷處被瘢痕組織替代后，新生的淋巴管失去了其作用，也就逐漸消失了。 因此，推斷損傷后脊髓中新生淋巴管積極參與了神經(jīng)組織的重建。CD34 為血管內(nèi)皮細胞標志物。 為推測新生淋巴管樣結(jié)構(gòu)的可能來源，進行了CD34 與淋巴管內(nèi)皮標記物的免疫熒光雙染。 本實驗證實正常脊髓組織中很少有細胞表達血管內(nèi)皮細胞標志物CD34。 小鼠脊髓針刺損傷術后，損傷后3 ～5 d，損傷處可見CD34 陽性反應物逐漸增多，廣泛分布；損傷后 7 d，CD34 陽性反應物的顏色變淺，數(shù)量仍然較多；損傷后14 d，瘢痕組織周圍已無CD34 陽性細胞分布。免疫熒光雙染證實損傷處的部分CD34 陽性細胞同時也表達prox1，推測新生淋巴管內(nèi)皮細胞也可能來自于周圍血管內(nèi)皮細胞。 這與胚胎期淋巴管發(fā)育過程中，早期的淋巴管的內(nèi)皮細胞是由靜脈的血管內(nèi)皮細胞分化而來[30]的結(jié)論相一致。 因此，可以推測，脊髓損傷處的新生淋巴管內(nèi)皮細胞可能來源于兩種途徑，周圍既存的淋巴管或血管內(nèi)皮細胞，但尚不能明確兩種路徑的哪一種，或兩者之間的比例，因此值得進一步探討研究。

綜上所述，正常小鼠脊髓中存在左右對稱、節(jié)段性分布的淋巴管樣結(jié)構(gòu)，小鼠脊髓損傷后出現(xiàn)一過性新生淋巴管。 該結(jié)果證實了中樞神經(jīng)淋巴管樣結(jié)構(gòu)的存在及可塑性，也為淋巴管在CNS 損傷修復中的作用提供了研究佐證。 同時表明，淋巴系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)可能是中樞神經(jīng)創(chuàng)傷性損傷后修復的臨床治療靶點之一。