基于TLR4／MyD88／NF-κB 通路探討美洲大蠊蟲粉對脊髓損傷大鼠的保護作用

李杰，周邦瑜，馬彥博，阮玉山，李紹波?

（1. 大理大學臨床醫學院，云南大理 671000；2. 大理大學第一附屬醫院，云南大理 671000）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種高病死和高致殘的中樞神經系統疾病，給患者、家庭和社會造成巨大負擔[1]。 研究發現，脊髓損傷后，損傷局部會繼發性產生大量炎性因子，募集血液中單核細胞和巨噬細胞到脊髓損傷區域，產生自身抗體、趨化因子、活性氧和氮等物質，破壞脊髓微環境，導致神經細胞調亡或壞死，軸突再生抑制，神經和運動功能長期或永久喪失[2]。 因此，減少炎性因子產生是治療脊髓損傷的有效切入點。 TOLL 樣受體4 （toll-like receptors， TLR4）-髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）-核因子-κB（NF-κB）通路是調控繼發性炎癥反應的重要通路之一，抑制TLR4／MyD88／NF-κB 通路可以減少炎癥反應，有利于神經和運動功能恢復[3]。

美洲大蠊最早被記錄于《神農本草經》中，其具有消腫、通淤、利咽的作用[4]。 現代研究表明美洲大蠊制劑在治療胃潰瘍[5]、肝纖維化[6]、脂肪性肝炎[7]、心肌損傷[8]等多種疾病時，通過抑制TLR4 通路發揮抗炎作用。 本課題組前期已證明美洲大蠊蟲粉可通過影響自噬促進脊髓損傷恢復[9]，但其抗炎作用是否對脊髓損傷有效尚未可知。

相關地，同一知識點螺旋重復多少次合適？比如，“平行四邊形概念”在4個版本中出現了3次，2個版本出現了4次．“性質1”在北師版中沒有重復，冀教版中出現了3次，其余版本出現了2次．“性質2”在冀教版和青島版中出現了2次，其它4個版本均沒有重復出現．冀教版中的“知識點Z9”出現了2次，分別在二下、四下，其它5個版本均沒有重復出現．

因此，本研究通過給予脊髓損傷的大鼠美洲大蠊蟲粉治療，以驗證其在脊髓損傷后是否可以通過調節TLR4 通路發揮抗炎作用，促進損傷恢復。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

48 只SPF 級健康雌性SD 大鼠，8 周齡，體重200 ～220 g， 購買于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2019-0008】。 飼養在大理大學動物實驗中心【SYXK（滇）2018-0002】，條件：12 h 明暗交替，溫度20 ～25 ℃，濕度40% ～70%。 適應1周時間后進行實驗。 本動物實驗已獲大理大學動物倫理審查會的批準（2023-PZ-114）。

脊髓損傷模型構建：戊巴比妥鈉麻醉大鼠后切開背部皮膚和肌肉，咬除T10 棘突、椎板、上下關節突關節，充分暴露脊髓。 剪斷左側T10 脊髓，此時大鼠左后肢會出現抽搐，表示脊髓半橫斷損傷造模成功[14-15]。 假手術組僅咬除T10 椎板。 術后給予頭孢呋辛鈉（90 mg／kg）預防感染，每天1 次，連續3 d。膀胱按摩，每天2 次，直至可自主排尿。 術后第14天，分別進行心臟灌注和新鮮脊髓組織取材，用作后續實驗。

假手術組組織無損傷，神經元數量最多，染色均勻。 鹽水組神經元數目減少明顯，內部結構模糊不可辨別。 美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組神經元數目較多，部分染色好的神經元可以看到環繞在外圍的尼氏體結構。 見圖3。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

將48 只雌性SD 大鼠隨機分為4 組：假手術組、鹽水組、美洲大蠊蟲粉組、TLR4 抑制劑組，每組12只。 鹽水組給予5 mL 生理鹽水灌胃，美洲大蠊蟲粉組給予等體積美洲大蠊蟲粉（630 mg／kg，此濃度基于前期的探索與既往文獻報道[10-11]）灌胃，TLR4 抑制劑組給予TLR4 抑制劑（3 mg／kg）腹腔注射處理[12-13]，每天1 次，連續14 d。 假手術組不做處理。

1.1.2 主要試劑與儀器

可證該式關于s1的二階偏導數小于0，存在最大值，求該式關于s1的一階偏導，并令其為0，得到企業1最優續航里程研發水平同理可得，企業2最優續航里程研發水平

1.2.2 BBB 運動功能評分

術后1、3、7、14 d 由2 名熟知評分標準但不知道分組情況的評估者進行大鼠后肢髖、膝、踝關節活動度和協調性評分，每次5 min，取平均值。 評分越高運動功能恢復越好[16]。

1.2.3 蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色觀察組織形態

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1.2.4 免疫組化

制片同HE 染色。 使用檸檬酸高壓修復抗原，山羊血清封閉，滴加一抗NeuN（1 ∶10 000），37 ℃孵育60 min，滴加約50 μL 即用型二抗，室溫孵育30 min，顯色，封片，采圖。

工科新教師培訓動機缺失的直接結果是：不能夠將學科知識有效轉化為課程知識，不能夠將課程知識與工程經驗轉化為教學內容，不能夠將教學知識內化為教育思想或教育理念，不能夠將聽、說、讀、寫、交流等基本能力轉化為教學設計、教學組織與實施、教學評價的能力等。

1.2.5 酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測炎性因子

嚴格按照ELISA 試劑盒的說明書在酶標儀450 nm 檢測脊髓組織中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 的表達水平。

以脊髓損傷灰質與白質交界為中心，選取相同區域，假手術組灰質和白質分界清晰、結構緊密、細胞形態完整。 鹽水組損傷最重，脊髓灰質后角與白質界限不清，細胞數量減少，細胞核出現明顯固縮、碎裂。 美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組形態相對完整，灰白界限大致清楚，觀察到完整的細胞數目較鹽水組更多。 如圖2。

取新鮮脊髓組織研磨后加入RIPA 液裂解30 min，每孔10 μL 樣品上樣，電泳（80 V 20 min，120 V 100 min），濕轉（恒流400 mAh、轉膜15 min）。 5%脫脂牛奶封閉1 h，分別按照1 ∶3000、1 ∶1000、1 ∶1000、1 ∶ 5000 稀釋TLR4、MyD88、 NF-κB p65、β-actin 抗體，4 ℃過夜。 山羊抗兔二抗稀釋比例為1 ∶5000， 孵育、顯影。

將灌注的脊髓組織依次進行石蠟包埋，切片，烤片，蘇木素、伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡采圖。

1.3 統計學分析

使用SPSS 20.0 軟件分析，計量資料以平均值± 標準差（±s）表示。 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

圖2為ATmega16最小系統電路圖，包括晶體振蕩器電路、手動復位電路、3.3～5V切換電源電路、ISP下載電路和JTAG仿真電路。

2 結果

2.1 大鼠術后一般狀況

假手術組大鼠手術耐受性好，麻醉恢復后可正常活動。 鹽水組、美洲大蠊蟲粉組、TLR4 抑制劑組術后精神狀況差，少部分大鼠出現血尿、尿潴留和腸梗阻等癥狀，給予腹部按摩、抗感染等治療后有所緩解，極少部分出現死亡。 其中鹽水組和TLR4抑制劑組因血尿各死亡1 只，美洲大蠊蟲粉組因腸梗阻死亡1 只，考慮造成死亡的原因與泌尿系統、消化系統感染相關，也有可能與大鼠個體對損傷耐受程度不同相關。 動物造模成功率為93.75%。

2.2 BBB 運動功能評分

如圖1 所示，假手術組BBB 評分保持在21 分，其余3 組均有不同程度的運動功能下降（P＜0.05）。 術后第1 天和第3 天，鹽水組、美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組之間無統計學意義。 術后第7 天和第14 天，與鹽水組相比，美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組評分較高（P＜0.05），術后第14 天，美洲大蠊蟲粉組比TLR4 抑制劑組出現更頻繁的協調運動，評分高于TLR4 抑制劑組，差異有統計學意義。

圖1 各組術后不同時間BBB 運動評分Note. Compared with saline group，?P ＜0.05. Compared with Periplaneta americana powder group， ＄P ＜0.05. （The same in the following figures and tables）Figure 1 BBB score at different time after operation in each group

2.3 HE 觀察脊髓組織形態

1.2.6 Western Blot 檢測蛋白表達

不同溶劑提取黃連，提取的成分明顯不同。根據性相近則相容的原則，水提物含有多糖、蛋白質、氨基酸、多酚、生物堿、木質素等成分，而無水乙醇提取物中，多糖、蛋白質等大分子物質幾乎未被提出，主要是小分子有機物，含水醇提物的成分介于二者之間。從上述結果看，對2種試驗菌有抑菌活性的主要是小分子的有機物。為進一步了解黃連抗菌活性成分，用化學方法把黃連分成不同極性組分。

圖2 各組術后HE 染色結果比較Figure 2 Comparison of HE staining results after operation in each group

2.4 免疫組化神經元改變結果

美洲大蠊蟲粉（藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，批號：221001），TLR4 抑制劑（MCE，HY-11109），白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） （ 上海酶聯生物（ 國產） YJ037373，YJ102828， YJ002813， YJ002859 ）， TLR4 抗體（Abcam， ab217274 ）、 MyD88 抗體 （ Abclonal，A19082）、 NF-κB p65 抗體（Affinity Biosciences，AF5006）、山羊抗兔IgG 抗體（proteintech，SA00001-2）、NeuN 抗體（Proteintech，26975-1-AP-50），RIPA裂解液（Solarbio，批號：R0010），BCA 試劑盒（碧云天，批號：P0012）。 顯微鏡（奧林巴斯BX53 型），酶標儀（Infinite M Nano 200 PRO），蛋白印跡檢測系統（Bio-Rad ChemiDocMP）。

通過以上分析，綜合考慮研究區域的實地調研數據與視域分析結果，結合空間句法的理論，從可持續發展的角度出發，對中山路教堂廣場區域的改造更新提出以下幾點建議.

圖3 各組術后免疫組化和神經元數目統計圖Note. A. Immunohistochemistry in each group. B. Statistics of the number of neurons. Compared with sham operation group， ＃P ＜0.05. （The same in the following figures and tables）Figure 3 Statistics of immunohistochemistry and neuron number after operation in each group

2.5 ELISA 測定炎性因子變化

與假手術組相比，鹽水組、美洲大蠊蟲粉組、TLR4 抑制劑組中TNF-α 與IL-1 均有所升高（P＜0.05）。 與鹽水組相比，美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組TNF-α、IL-1 減少，而且美洲大蠊蟲粉組中含量下降比TLR4 抑制劑組更顯著（P＜0.05）。 鹽水組中IL-6 比假手術組有所升高，給予美洲大蠊蟲粉和TLR4 抑制劑治療后下降（P＜0.05），美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組之間無明顯差異（P＞0.05）。IL-10 在4 組中無統計學意義（P＞0.05）。 如表1。

表1 各組術后4 個炎性因子表達量（pg／mL）Table 1 Expression of four inflammatory factors after operation in each group（pg／mL）

2.6 Western Blot 結果

與假手術相比，鹽水組中TLR4、MyD88 以及NF-κB P65 蛋白表達顯著升高，與鹽水組相比，美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組下調了這3 個蛋白的表達（P＜0.05）。 美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組表現一致，無統計學意義（P＞0.05）。 如圖4。

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圖4 各組術后3 個通路蛋白變化Figure 4 Changes of three pathway proteins after operation in each group

3 討論

TLR4／MyD88／NF-κB 信號通路是免疫系統中一條重要的信號傳導通路，在炎癥調節中起關鍵作用[17]。 在此通路中，TLR4 作為模式識別受體，當感知細菌、病毒、損傷等信號分子后，激活下游MyD88分子，接著使NF-κB 抑制酶發生磷酸化，誘導并促使NF-κB 進入細胞核[18]。 激活的NF-κB 調控一系列炎癥基因的轉錄，包括炎癥因子和炎癥相關的酶，以發揮免疫應答和炎癥調節的作用[19]。

美洲大蠊蟲粉是將美洲大蠊置55 ～65 ℃熱水中淹死、漂洗、瀝干、烘干后研磨成粉，有效成分為糖類、肽類以及氨基酸，因其良好的抗炎作用被臨床工作者用于治療呼吸系統、消化系統、泌尿生殖系統以及皮膚黏膜損傷[20]。 有研究表明，其抗炎作用與抑制TLR4 通路有關。 美洲大蠊提取物能抑制炎癥細胞因子（IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α）以及TLR4通路蛋白TLR4、MyD88、NF-κB 表達，減輕胃粘膜損傷[5]。 另外，在治療脂肪性肝炎中，美洲大蠊制劑可以減少TLR4 通路上游的高遷移率族蛋白B1 表達，阻斷TLR4 通路，抑制促炎型巨噬細胞表達，減少炎癥反應[7]。 美洲大蠊提取物還能通過抑制炎癥，氧化應激減少神經細胞調亡[21]，但是否與抑制TLR4 通路有關暫無報道。

脊髓損傷是一種嚴重的致殘性疾病，會造成患者感覺和運動功能喪失，而且隨著經濟發展和生活方式改變，患病率逐年增加[22]。 雖然經過手術、藥物、康復等治療有所改善，但總體效果仍不理想[23]。文獻表明，脊髓損傷患者血液中TLR4、MyD88 以及NF-κB 明顯高于健康對照組，而且在脊髓完全損傷患者中的表達高于不完全損傷組，提示損傷越重，TLR4 通路越活躍[24]。 細胞和動物實驗中也發現脊髓損傷后會激活TLR4 通路，促進炎性因子IL-1、IL-6、 TNF-α 等的釋放[3，25]。 因此抑制TLR4 通路激活，有助于脊髓損傷恢復。

本研究通過構建大鼠脊髓損傷模型，研究美洲大蠊是否可以在脊髓損傷后通過抑制TLR4 通路發揮抗炎作用，結果表明，美洲大蠊蟲粉可以促進脊髓損傷大鼠運動功能恢復，改善脊髓組織破壞情況，減少神經細胞死亡數量，減少炎性因子IL-1、IL-6、 TNF-α 的含量，表明了美洲大蠊蟲粉在脊髓損傷后發揮了抗炎作用，有利于脊髓損傷恢復。 值得注意的是，研究發現IL-10 在損傷后14 d 時無明顯改變，這可能與脊髓損傷后抗炎因子IL-10 分泌持續時間比促炎因子短有關。 關于IL-10 在脊髓損傷后具體動態變化研究較少，有文獻報道IL-10 在脊髓損傷后2 周內有先升高后下降的趨勢，在第7 天時到達高峰[26-27]。 因此，需要在損傷早期檢測IL-10 的變化。 另外，通過Westem Blot 對TLR4 通路蛋白的研究發現，脊髓損傷后TLR4、MyD88、NF-κB P65 的表達明顯增高，這與既往研究相一致。 給予美洲大蠊蟲粉和TLR4 抑制劑治療后，脊髓組織中TLR4、MyD88、NF-κB P65 的表達下降，其中美洲大蠊蟲粉組和TLR4 抑制劑組在下調TLR4、MyD88、NF-κB P65 的表達中效果相同，證明美洲大蠊蟲粉有抑制TLR4 通路，減少繼發性炎癥反應的作用。

由于我國人口結構不斷發生改變，導致冠心病的發病率呈上升趨勢發展，冠心病若未能夠得到有效治療能夠使患者的生命安全受到威脅，通過盡早診斷使患者的生存質量得以改善，目前臨床中將冠脈造影檢查作為診斷冠心病的診斷金標準，但該種診斷方式具有創傷性、價格相對較高，部分家庭難以接受，因此，該種診斷方式很難在臨床中廣泛應用[2]。

綜上所述，美洲大蠊蟲粉能促進脊髓損傷大鼠的運動和神經功能恢復，其機制與抑制TLR4／MyD88／NF-κB 通路， 降低炎癥因子IL-1、 IL-6、TNF-α 的釋放，減輕炎癥反應有關。 本研究為美洲大蠊應用于臨床治療脊髓損傷提供了實驗依據，但美洲大蠊蟲粉中具體何種物質發揮了抗炎作用仍需進一步研究。