結核分枝桿菌潛伏感染者外周血單個核細胞轉錄組學研究

尚雪恬 董靜 黃麥玲 孫琦 賈紅彥 張藍月 劉秋月 姚明旭 王穎超 姬秀秀 杜博平 邢愛英 潘麗萍

結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)是一種在體內存在“休眠”的持續存活的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB),能夠對MTB抗原刺激產生持久性的反應,但沒有活動性結核病臨床癥狀的狀態[1-3]。全球約有1/4的人口感染MTB,LTBI者中約有5%～10%的個體會發展為活動性結核病[4]。目前,用于診斷LTBI的方法主要是免疫學檢測,包括結核菌素皮膚試驗和γ-干擾素釋放試驗,但在部分特殊人群,如兒童、老年人、免疫抑制人群等的應用中受限[5]。一些研究表明,有相當比例的活動性結核病是由LTBI者體內的MTB重新激活發展而來,特別是在合并其他疾病的情況下,如腫瘤、HIV感染、糖尿病等,發展為活動性結核病的風險更高[6-8]。目前,對于LTBI發生的原因,以及LTBI人群發展為結核病的機制并未完全解析。探索LTBI者中結核抗原特異的免疫應答基因譜,對于揭示LTBI成因及發現更優的LTBI診斷標志物具有重要意義。

高通量分析技術的發展為揭示疾病發生發展機理提供了手段,既往基于結核病血液轉錄組學的研究擴展了對宿主抗結核免疫反應機制的認識,并有助于結核病的鑒別診斷、治療和監測[9-10]。但既往研究多以未經MTB特異性抗原刺激的外周血全血或外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)作為研究對象,而且多是基于傳統的差異基因分析(differentially expressed gene analysis,DEG),以及簡單的京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析和基因本體論(geneontology,GO)生物信息學分析等,未能達到對轉錄組數據的深入探究和挖掘。因此,為了探究LTBI應對MTB特異性抗原的免疫應答譜,尋找LTBI免疫應答過程中重要的信號通路和免疫細胞,本研究對LTBI者和健康對照(healthy control,HC)者經MTB特異性抗原刺激后的PBMC進行mRNA微陣列芯片分析,應用加權基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)選擇與LTBI相關的重要基因模塊,并對相關性最大的兩個模塊中的基因分別進行GO分析和KEGG分析,結合基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)確認與LTBI相關的關鍵通路;通過免疫浸潤分析鑒定參與LTBI的重要免疫細胞;通過STRING數據庫蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡分析繪制兩模塊中差異基因相互作用網絡圖,以期為深入分析LTBI發生發展中的宿主免疫應答機制提供理論基礎。

對象和方法

一、研究對象

本研究用于微陣列芯片檢測的臨床標本,于2009年12月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院招募而來,包含4例LTBI者(LTBI組)和4名HC者(HC組)。本研究用于差異基因qPCR驗證的臨床標本,于2022年10月至2023年1月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院招募而來,包含10例LTBI者和10名HC者。受試者人口學特征見表1。研究得到首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會的批準(倫理審批編號:YJS-2022-12)。在采集血樣前,均獲得每名(例)參與者的書面知情同意。

表1 研究對象人口學特征

納入標準:(1)LTBI個體符合以下標準:γ-干擾素釋放試驗陽性,胸部影像學檢查無異常,無活動性結核病的臨床癥狀。(2)HC個體符合以下標準:γ-干擾素釋放試驗陰性,胸部影像學檢查無異常,無活動性結核病的臨床癥狀。

排除標準:(1)HIV陽性、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒陽性。(2)合并糖尿病、惡性腫瘤或嚴重自身免疫性疾病。(3)服用免疫抑制劑或免疫增強劑。(4)妊娠或哺乳期婦女。(5)年齡<18歲。

二、體外抗原刺激

使用肝素抗凝管采集6 ml外周血,在采集后4 h 內使用Ficoll淋巴細胞分離液采用密度梯度離心法分離PBMC。使用10 μg/ml純化的MTB特異性抗原:早期分泌抗原靶6(6 kDa early secretory antigenic target,ESAT-6)和培養濾液蛋白10(culture filtrate protein 10,CFP-10)(上海晶諾生物科技有限公司),與PBMC共同孵育,在37 ℃、含5%二氧化碳的細胞培養箱中共同孵育20 h后收集PBMC,使用TRIZOL試劑裂解,凍存于―80 ℃直至用于芯片檢測,期間無反復凍融。

三、RNA提取

使用miRneasy?Mini試劑盒(德國QIAGEN公司)從PBMC中提取總RNA。使用無核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶(德國QIAGEN公司)去除基因組DNA污染。使用安捷倫2100生物分析儀(美國安捷倫科技有限公司)對RNA的完整性和質量進行評估。使用具有2100 RIN(RNA完整性數)≥ 7.0和28S/18S>0.7的RNA進行微陣列芯片檢測和qPCR驗證。

四、微陣列芯片檢測

采用美國安捷倫科技有限公司生產的人類全基因組寡核苷酸芯片(4×44 K,包括41 000個基因和轉錄本),以每份樣本中提取的總RNA作為模板進行熒光標記和雜交,并在美國安捷倫科技有限公司微陣列掃描儀上進行掃描。采用Feature Extraction軟件10.7(安捷倫技術)進行原始數據提取,并采用GeneSpring軟件12.6.1(安捷倫技術)中的分位數算法進行數據歸一化。微陣列實驗于2010年在上海伯豪生物科技有限公司完成。微陣列數據保存在GEO數據庫,編號為GSE98461。

五、生物信息學分析

使用TBtools 2.042軟件[11]進行WGCNA分析(https://github.com/ShawnWx2019/WGCNA-shinyApp),尋找與LTBI相關的基因模塊,通過WGCNA自帶cor函數使用皮爾遜相關性分析計算相關性,得到與LTBI最顯著正相關和負相關性的兩個模塊(cor值越接近1或―1,P<0.05)。使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線分析工具對模塊中的基因進行GO富集分析和KEGG信號通路分析。通過微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn)進行GSEA分析[12],鑒定發揮重要功能的信號通路。通過微生信平臺進行免疫浸潤分析[12],鑒定與LTBI相關的重要免疫細胞。重要模塊中的差異基因在STRING數據庫(https://cn.string-db.org)中進行PPI網絡分析,運用cytoHubba插件對PPI網絡圖進行運算,鑒定與LTBI相關的重要差異表達基因。

六、qPCR檢測

按照SuperRT cDNA Synthesis Kit(康為世紀生物科技股份有限公司)說明書將mRNA反轉錄成cDNA,再根據Power SYBR Green PCR Mater Mix[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]說明書對差異基因進行表達量驗證分析。qPCR檢測在ABI公司Quantistudio7實時熒光定量PCR儀上完成。以GAPDH為內參基因,計算2-△CT,以確定基因相對表達量。qPCR引物:mRNA IL2-F:TATGCAGATGAGACAGCAACCAT,mRNA IL2-R:TTGAG-ATGATGCTTTGACAAAAGG,mRNA SPINK1-F:TCTATCTGGTAACACTGGAGCTG,mRNA SPINK1-R:ACACGCATTCATTGGGATAAGT,mRNACHI3L1-F:GTGAAGGCGTCTCAAACAGG,mRNACHI3L1-R:GAAGCGGTCAAGGGCATCT,mRNA TNF-a-F:CAGCCTCTTCTCCTTCCTGAT,mRNA TNF-a-R:GCCAGAGGGCTGATTAGAGA,mRNA RASGRP2-F:ACAATCCCGGAAGGACAACTC,mRNA RASGRP2-R:GTCTATGTCGATTAGGCTGCTG,mRNA TPM2-F:CTGAGACCCGAGCAGAGTTTG,mRNA TPM2-R:TGAATCTCGACGTTCTCCTCC,mRNA CAMK1G-F:CCTGAGATCACCATCACCGA,mRNA CAMK1G-R:GCCATTGACCAGGCAGTTGA,mRNA SUCNR1-F:GACAATGGCACCACCTGTAATG,mRNA SUCNR1-R:CTGCTTTAGGAAGAGAGCAATCTTG,mRNA HCAR3-F:ACCATACAGACACACGCCACTT,mRNA HCAR3-R:CAT-CTCGGAACACACAGCAGT,mRNA IL18BP-F:GACACCAGACCTCAGCCCTT,mRNA IL18BP-R:TCTGCGAGACAGGTGTGGCT,mRNA GAPDH-F:TGACTTCAACAGCGACACCCA,mRNA GAPDH-R:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。qPCR 反應程序設置:50 ℃,2 min;95 ℃,10 min,預變性;95 ℃,變性15 s;60 ℃退火延伸1 min;變性和退火延伸兩步循環40次。

七、統計學處理

結 果

一、差異基因分析及驗證

采用全基因組微陣列分析方法獲得LTBI和HC個體經MTB特異性抗原刺激后PBMC內差異基因表達譜。基于差異基因進行主成分分析(principal component analysis,PCA),結果顯示,LTBI個體與HC個體之間存在明顯分群,說明差異基因能夠較好地分辨LTBI和HC個體(圖1)。分析表達譜數據,以組間差異倍數(fold change,FC)>2或<0.5和組間差異有統計學意義(P<0.05)為閾值,篩選出兩組間差異有統計學意義的393個基因,其中281個基因在LTBI組明顯上調,112個基因在LTBI組明顯下調(圖2)。以微陣列芯片標準化數據中任一組表達量均值(Mean值)>7和組間差異P<0.01為閾值,篩選其中組間差異倍數最為明顯的10個上調基因和10個下調基因,見表2。針對LTBI組和HC組差異表達基因繪制聚類分析熱圖(圖3),結果顯示LTBI組和HC組之間的基因表達存在明顯差異,差異基因能夠很好地對LTBI和HC進行分組。

圖1～3 LTBI和HC個體經結核分枝桿菌特異性抗原刺激后的外周血單個核細胞全基因表達譜。圖1為主成分分析。圖2為火山圖。圖3為差異基因的聚類分析熱圖,s1m～s4m為HC樣本,s1p～s5p為LTBI樣本

表2 LTBI組和HC組間表達差異最為明顯的 10 個上調基因和10個下調基因

為了驗證微陣列芯片的結果,本研究選擇LTBI組中上調差異最大的8個基因和下調差異最大的2個基因進行qPCR驗證。如表2和圖4所示,10個基因經qPCR驗證的表達模式均與芯片結果一致。

注 a:P<0.05, b:P<0.01, c:P<0.001;HC:健康人, LTBI:結核分枝桿菌潛伏感染者圖4 上調差異最大的8個基因和下調差異最大的2個基因qPCR驗證散點圖

二、WGCNA分析鑒定與潛伏感染相關的關鍵模塊

為了挖掘基因共表達網絡,以進行更深度的表達調控分析,本研究對轉錄組進行了WGCNA網絡的構建。WGCNA分析基于19 643個基因,軟閾值β設置為28(R2=0.8),然后評估模塊與疾病分組(LTBI和HC)之間的關系,如圖5所示,藍色模塊(MEblue)的特征基因與LTBI之間存在強烈的正相關(cor=0.88,P=0.004),其中包含1079個基因;而藍綠色模塊(MEturqoise)的特征基因與LTBI之間存在強烈的負相關(cor=―0.93,P=0.001),其中包含1207個基因。

注 黑色框標注的是相關性最強的正相關模塊和負相關模塊圖5 WGCNA基因模塊與分組信息的相關性熱圖

三、LTBI相關基因模塊的功能注釋分析和PPI網絡分析

針對與LTBI相關性最強的藍色和藍綠色模塊基因進行GO分析(表3)。其中生物過程(biological process,BP)分析發現,藍色模塊的基因主要富集在炎癥應答、細胞器內酸化過程、細胞因子介導的信號通路、肌動蛋白細胞骨架組織、白細胞介素-1β產生的正向調節等生物過程;藍綠色模塊的基因主要富集在轉錄調控、炎癥應答、染色質重塑、細胞周期、細胞凋亡等生物過程。分子功能(molecular function,MF)分析顯示,藍色模塊的基因主要參與蛋白結合、細胞因子受體活性、信號受體活性、質子轉運ATP酶活性、錳離子跨膜轉運體活性等分子功能;藍綠色模塊的基因主要參與蛋白結合、脂質結合、DNA結合、染色質結合、轉錄共抑制因子活性等分子功能。細胞組分(cellular component,CC)分析顯示,藍色模塊的基因主要涉及胞質、質膜、細胞器膜等細胞組分;藍綠色模塊的基因主要涉及核膜、核內、胞質等細胞組分。

表3 藍色模塊和藍綠色模塊中基因GO富集分析

針對與LTBI相關性最強的藍色和藍綠色模塊基因進行KEGG分析(表4),發現藍色模塊中的基因主要富集在溶酶體、吞噬體、結核病、凋亡、鐵死亡和趨化因子信號通路等相關信號通路;藍綠色模塊的基因主要富集在FcγR介導的吞噬作用相關信號通路、B細胞受體信號通路、凋亡、C型凝集素受體信號通路和趨化因子信號通路。

表4 藍色模塊和藍綠色模塊中基因KEGG信號通路分析

對兩模塊中的差異基因通過STRING數據庫構建PPI網絡圖(圖6～9),并用Cytohubba插件中最大互相關(maximum cross correlation,MCC)方法鑒定出每個模塊中的前10個關鍵基因,包括藍色模塊中的PTPRC、CD40、IL10、IRF8、CCR1、CD80、TLR8、CLEC7A、CD83和CD274;藍綠色模塊中的TNF、ICAM1、TNFRSF4、HAVCR2、CD276、CCL4、CD33、IL1RN、NCF1和FGR。這些基因多富集在與固有免疫相關的信號通路中,與固有免疫有關。

圖6～9 藍色模塊和藍綠色模塊基因的PPI網絡分析。圖6為藍色模塊差異基因PPI網絡圖。圖7為藍色模塊10個Hub基因。圖8為藍綠色模塊差異基因PPI網絡圖。圖9為藍綠色模塊10個Hub基因。圖7和圖9中基因顏色越深,表示相關性越強

四、全轉錄組GSEA分析鑒定重要信號通路

為了更充分地了解LTBI和HC組間全轉錄組的差異,本研究進行了GSEA研究分析。GSEA主要關注的是整個基因集的表達,而不只是差異表達基因。基于GSEA分析中的通路分析,對比GSEA分析獲得的重要信號通路,以及WGCNA中藍色和藍綠色模塊的基因KEGG通路分析結果,發現3個共同通路(圖10),即趨化因子信號通路(P<0.001)、凋亡信號通路(P=0.003)、癌癥信號通路(P<0.001),可能與LTBI的發生發展密切相關。

圖10 GSEA分析及WGCNA藍色模塊和藍綠色模塊基因KEGG通路分析的韋恩圖

五、免疫細胞浸潤分析

為了進一步了解LTBI個體對MTB特異性抗原的免疫反應情況,本研究通過免疫浸潤分析尋找參與LTBI對MTB特異性抗原免疫應答過程的重要免疫細胞,如圖11～13所示,HC與LTBI組間的22種浸潤性免疫細胞類型的比例存在差異,其中5種免疫細胞有明顯差異:嗜酸性粒細胞(P<0.001)、M1型巨噬細胞(P=0.029)、M2型巨噬細胞(P=0.001)、中性粒細胞(P<0.001)和調節性T細胞(P=0.003)。其中,M1型巨噬細胞比例在LTBI中上調,嗜酸性粒細胞、M2型巨噬細胞、中性粒細胞和調節性T細胞比例在LTBI中均下調。

圖11～13 免疫浸潤分析。圖11為HC與LTBI組間不同免疫細胞相對豐度圖。圖12為HC與LTBI組間免疫浸潤差異的聚類熱圖。圖13為HC與LTBI組間免疫浸潤差異的箱形圖(a:P<0.05)。HC:健康人;LTBI:結核分枝桿菌潛伏感染者

討 論

MTB一旦進入宿主并感染肺泡巨噬細胞,肺泡巨噬細胞將吞噬并試圖通過溶酶體依賴的吞噬小體來消除病原體。然而,MTB可抑制吞噬溶酶體融合并在宿主巨噬細胞內復制,維持一種休眠的低代謝潛伏狀態[14]。在LTBI階段,MTB長期處于不活躍狀態,在表型上對抗結核藥物不敏感,并保持其復蘇和增殖的能力[15]。但在合并感染和其他免疫抑制因素下可以促使其復蘇和復制,從而導致活動性結核病,并增加MTB傳播風險。在本研究中,應用微陣列芯片比較了LTBI和HC個體PBMC經MTB特異性抗原刺激后的基因轉錄譜,可以幫助了解LTBI個體對結核抗原特異的免疫應答譜,為識別新的LTBI生物標記物、深入分析LTBI發生發展的機制提供可靠的數據。

與既往使用未經結核抗原刺激的全血或PBMC完成的微陣列研究不同,本研究檢測了MTB特異性抗原刺激后的PBMC轉錄譜,有利于發現MTB特異性抗原引發的免疫應答相關的差異基因,研究結果也證實MTB感染狀態下的PBMC對MTB特異性抗原的免疫應答存在明顯差異,這些差異有可能成為LTBI診斷的潛在標識。在本研究中,將傳統的差異表達基因篩選方法和WGCNA網絡分析結合起來,以提高識別 LTBI特異表達基因的能力。同時,將WGCNA分析中獲得的重要模塊進行GO和KEGG分析,并與GSEA分析相結合,共同鑒定與LTBI相關的重要信號通路,發現不同生物信息學分析中共同鑒定的通路包括凋亡信號通路和趨化因子信號通路。細胞凋亡是一種受調控的細胞死亡過程,通過激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶來消除受損或多余細胞[16]。細胞凋亡對于MTB感染的結局很重要。目前對于細胞凋亡對MTB感染后機體的保護作用及機制研究較多[17-18]。對于MTB來說,通過自身效應蛋白抑制宿主巨噬細胞凋亡也是促進自身在宿主體內存活的關鍵步驟[19]。目前在宿主導向的免疫治療和疫苗研發中也提到,通過調節巨噬細胞凋亡達到免疫效果[20]。凋亡信號通路在LTBI者體內被激活可能促進了機體對MTB的控制。

本研究中,筆者發現LTBI組的特異表達基因顯著聚集在趨化因子信號通路。趨化因子是由細胞分泌的小分子蛋白,其信號通常由免疫細胞上表達的趨化因子受體轉導,在發生炎癥反應時招募和引導免疫細胞遷移至炎癥部位,因此對宿主的免疫保護作用至關重要。趨化因子受體通常在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和活化的T細胞等多種免疫細胞表達[21]。MTB感染后可以誘導產生趨化因子,進而招募免疫細胞到肺組織以發揮抗結核感染的作用[22]。MTB感染人氣道上皮細胞后在細胞基底側傾向于分泌趨化因子[23],以便招募循環系統中的免疫細胞。樹突狀細胞和巨噬細胞在MTB感染早期均會產生趨化因子,招募不同免疫細胞到達炎癥部位[24]。而且MTB感染的一個主要病理特征是肉芽腫的形成,肉芽腫的形成需要招募大量細胞到感染部位,已有研究證實,在MTB感染過程中,可通過CC趨化因子配體激活趨化因子受體,誘導結核抗原特異性細胞到達感染部位,促進肉芽腫的形成[25-26]。結核病患者淋巴細胞中CCR-2的低表達導致肉芽腫形成延遲和肉芽腫形成不完全[27]。因此,LTBI個體中趨化因子信號通路的激活可能是宿主抗結核感染的重要步驟。

過去有研究指出,T細胞對MTB休眠狀態相關抗原的反應可能在潛伏期占主導地位[28],γ-干擾素釋放試驗也是源于T細胞對結核抗原反應的原理來確定結核感染。不過CD4+T細胞反應既可以限制全身的疾病,也可以促進肺內進行性破壞性病變的發展[29]。潛伏感染狀態下究竟哪類細胞起到關鍵作用,實際上還需要更深入的分析。為了進一步探究免疫細胞在LTBI人群中的作用,本研究對轉錄組數據進行了免疫浸潤分析,發現HC與LTBI組間的22種浸潤性免疫細胞類型的比例存在差異,其中5種免疫細胞有明顯差異,即嗜酸性粒細胞、M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、中性粒細胞和調節性T細胞。嗜酸性粒細胞是Ⅱ型炎癥反應中的主要先天效應細胞[30]。盡管對體內嗜酸性粒細胞反應的研究歷來集中在過敏反應和寄生蟲感染,但最近一項研究發現,嗜酸性粒細胞能被招募到受感染的肺組織中,在控制小鼠MTB感染中發揮保護作用[31]。中性粒細胞可以吞噬MTB,分泌趨化因子和細胞因子,吸引循環中的單核細胞;促進初始抗原特異性CD4+T細胞的激活,觸發適應性免疫反應[32]。雖然嗜酸性粒細胞和中性粒細胞在LTBI中下調,但是在LTBI人群中M1型巨噬細胞增加且M2型巨噬細胞下降,提示促炎免疫應答占優勢,而且調節性T細胞有所下降,說明免疫抑制作用減弱,這表明LTBI人群免疫微環境中巨噬細胞介導的固有免疫對結核抗原刺激發揮重要的作用,巨噬細胞功能改變和分泌的細胞因子在MTB感染中發揮了重要作用。現有研究已經證實,M1型巨噬細胞通過Toll樣受體配體的誘導,可以吞噬并清除病原體,分泌促炎因子,激活T細胞免疫,促進輔助性T細胞1(type-1 helper T cells,Th1)免疫應答,促進初期炎癥反應;M2型巨噬細胞則通過產生白細胞介素(interleukin,IL)-4和IL-10等細胞因子參與抗炎反應[33]。因此,與M2型巨噬細胞相比,M1型巨噬細胞在細胞內控制MTB更有效[34]。本研究結果也提示,以M1型巨噬細胞為主的促炎免疫應答水平上升,與既往研究發現的MTB可以抑制巨噬細胞向M1型極化是一致的[35]。綜上所述,巨噬細胞介導的固有免疫在LTBI發生中發揮重要的作用,這有可能是MTB在LTBI個體內被控制的必不可少的免疫過程。

本研究應用多種生物信息學方法對LTBI與HC兩組人群的轉錄組進行深入挖掘,揭示了LTBI轉錄組學特征性模塊,并鑒定到參與LTBI發生的重要信號通路和免疫細胞,強調了固有免疫細胞、凋亡和趨化因子信號通路等固有免疫應答在LTBI抗結核免疫中的重要作用,這為探索宿主抗結核免疫機制提供了理論基礎。本研究也存在不足之處,一方面芯片樣本數量有限,且用于芯片檢測的樣本均為女性,可能會存在一定的性別偏倚,但是在后續qPCR驗證中入組對象包含男性和女性人群,結果提示qPCR驗證中基因表達趨勢與芯片檢測中基因表達趨勢一致,表明性別偏倚對上述基因的影響不大。另一方面,未能在擴大樣本中對篩選到的重要模塊和信號通路中的基因進行進一步的驗證,因此未能鑒定到可能實現潛伏感染診斷的新標識,也沒有在特定的免疫細胞中對特定基因的功能進行實驗驗證。后續需要對這些基因,以及在特定免疫細胞中的功能進行深入的研究,以闡明其在潛伏感染診斷中的作用,以及潛伏感染發生過程中的潛在病理機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻尚雪恬:醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據、分析解釋數據、起草文章、統計分析;董靜:分析解釋數據、指導、對文章的知識性內容作批評性審閱;黃麥玲、劉秋月、姚明旭、王穎超、杜博平、邢愛英:采集數據;孫琦、賈紅彥:實施研究、采集數據;張藍月:指導和對文章的知識性內容作批評性審閱;姬秀秀:分析解釋數據;潘麗萍:醞釀和設計實驗、分析解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、指導、獲取研究經費、行政/技術或材料支持