CD4+和CD8+T細胞在結核病免疫應答中的作用

溫淑芳 魏榮榮 李浩然 劉毅

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)作為一種胞內病原體,主要通過飛沫傳播侵入人體引起結核病[1]。據最新的WHO報道指出,2022年全球結核病死亡數為130萬例,是僅次于新型冠狀病毒感染的世界第二大單一傳染源死因[2]。全球約有1060萬例新發結核病患者,130萬例死于結核病,但長期的流行病學研究發現,僅5%～10%的MTB感染者會進展為活動性結核病患者,在大多數情況下,受感染的個體在其整個生命過程中都保持健康即維持結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)狀態[3]。當患者免疫功能低下時,可能會進展為活動性結核病。

在抗MTB感染中,許多細胞及細胞因子發揮關鍵作用。其中包括免疫細胞,如巨噬細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和γδT細胞等[4]。其中,T淋巴細胞來源于骨髓的多能干細胞[5],直接參與MTB感染宿主機體的免疫防御。T淋巴細胞先分化為CD4和CD8雙陽性T細胞(double positive cell,DP),即CD4+和CD8+T細胞。DP細胞分別經歷陽性選擇和陰性選擇階段,獲取主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)限制性識別能力和對自身抗原的耐受性發育為表面標志為CD4或CD8的單陽性T細胞(single positive cell,SP)[6],成為具有免疫活性的T細胞。筆者對CD4+T細胞和CD8+T細胞在抗MTB感染免疫應答中發揮作用的機制進行分析,旨在探索抗MTB感染的免疫清除作用,為結核病的診斷和治療提供借鑒。

CD4+T細胞在MTB感染免疫應答中的作用

MTB通過呼吸道進入機體后首先被巨噬細胞吞噬,從而刺激T細胞增殖和活化,其中CD4+T細胞是參與細胞免疫應答的主要細胞[7],有研究也證實了其在抗MTB感染免疫應答中所起的核心作用[8]。CD4+T細胞可分為輔助性T細胞(Th)1、Th2、Th17及調節性T細胞(regulatory cells,Treg)等細胞亞群[9]。各類CD4+T細胞通過分泌γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等細胞因子來調節巨噬細胞、NK細胞、中性粒細胞等的細胞活性,從而參與MTB的清除[10]。目前,針對CD4+T細胞的研究更多關注其在機體免疫應答中的作用。Künzli和Masopust[11]研究發現,通過酶聯免疫斑點技術(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)對血液樣本中CD4+T細胞產生的IFN-γ進行檢測,使用“天花疫苗”衍生的重疊肽進行評估。結果顯示,在接種疫苗75年后記憶性CD4+T細胞仍可以被檢測到。由此可見,記憶性CD4+T細胞在抗MTB感染中的作用至關重要。

一、CD4+T細胞在MTB感染促炎機制中的作用

Th細胞表面均表達CD4分子,當機體感染MTB時,將誘導未接受抗原刺激的初始CD4+T細胞(Th0)分化為Th1[12]。Th1通過分泌各種細胞因子來增強細胞介導的抗感染免疫,活化巨噬細胞及吞噬存在于巨噬細胞囊泡中的MTB。IFN-γ和TNF-α與肺泡巨噬細胞上的受體結合后,通過信號轉導促進相關基因的表達,增強抗原呈遞能力,促進對MTB的殺傷作用。此外,IFN-γ、白細胞介素2(interleukin-2,IL-2)還可以增強NK細胞的殺傷能力發揮抗MTB的作用[13]。因此,細胞因子IFN-γ在抗MTB感染免疫中發揮著至關重要的作用。

有研究表明,機體抗MTB感染并非僅依賴IFN-γ[14]。當機體感染MTB或出現細胞因子轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)和IL-6時,將誘導Th0分化為Th17。Th17分泌的細胞因子IL-17和IL-22有強促炎、殺傷MTB的作用[15]。有研究表明,IL-17作為一種炎性細胞因子,在抵抗MTB菌株毒力中發揮重要作用[15]。研究人員使用不同的MTB菌株感染小鼠,其中包括實驗室標準株H37Rv和高毒力菌株HN878,再進一步通過比較IL-17缺陷小鼠和野生型小鼠的感染結果,從而發現IL-17對于機體抗高毒力菌株HN878感染早期保護性免疫起重要作用。可見,Th17在抗MTB感染的過程中發揮重要作用。

此外,近期Van Dis等[16]利用從感染小鼠肺部分離的CD4+T細胞來研究抗MTB感染的機制。研究發現,即使在缺乏IFN-γ的情況下,CD4+T細胞也能驅動巨噬細胞活化并控制感染。但是,這種不依賴IFN-γ的免疫應答被低氧誘導因子-1α(HIF-1α)的激活所控制。進一步探明了CD4+T細胞的抑炎機制網絡。

綜上所述,MTB特異性Th1主要通過分泌IFN-γ來促進巨噬細胞產生炎癥反應,并激活巨噬細胞抗MTB,進一步通過肉芽腫的形成從而加強MTB的清除及遏制結核病的發展[17]。此外,近年來也有來自非人靈長類動物的研究證據表明,Th1和Th17細胞不僅與MTB感染的促炎機制有關,可能還與抑炎機制相關[18]。

二、CD4+T細胞在MTB感染抑炎機制中的作用

1.Treg在MTB感染中的抑炎作用:CD4+CD25+Foxp3+T細胞又被稱為免疫調節性T細胞[19]。Treg主要通過兩種方式參與MTB感染抑炎機制:(1)直接接觸抑制效應細胞的活化;(2)分泌TGF-β、IL-10等細胞因子抑制機體免疫應答[20]。機體感染MTB后將激活Treg,抑制炎癥、限制組織損傷[21]。Treg與效應T細胞之間的平衡對疾病的進展非常重要,過強的免疫應答會導致嚴重的炎癥反應或組織損傷,而過強的Treg應答則會下調效應細胞免疫應答水平,導致MTB免疫逃逸并大量增殖[22]。

人體感染MTB后,患者外周血和病灶中的CD4+CD25+T細胞數量明顯增加,同時Foxp3、IL-10 和TGF-β1表達增高,后兩者的高度表達可以間接抑制IFN-γ介導的殺傷作用[23]。另外,Treg細胞還可以通過程序性死亡受體-1(programmed cell death protein 1,PD-1)途徑抑制IFN-γ的產生,IFN-γ的減少將影響到巨噬細胞的激活,減弱機體清除MTB的能力[17]。

綜上,Treg細胞在抗MTB感染過程中發揮重要作用。進一步的研究應當注重于抑炎機制中Treg與促炎機制中尤其是與Th17之間的平衡關系。Treg和Th17分別通過分泌IL-10和IL-17介導機體免疫抑制和炎癥反應。已有研究發現,Treg/IL-17比值失衡會造成機體的免疫功能異常,炎癥反應減弱或持續,進而導致肺結核的發生發展[24]。此外,李威等[25]研究發現,MTB感染機體后,分泌IL-17的同時體內Treg比例將降低。研究進一步發現LTBI者Treg/IL-17比值降低,而活動性結核病患者Treg/IL-17比值明顯升高。通過受試者工作特征(ROC)曲線分析,外周血Treg/IL-17比值預測活動性結核病患者的曲線下面積為0.925,最佳截斷值為1.821時,敏感度為97%,特異度為90%,提示Treg/IL-17比值對活動性結核病具有較高的預測價值。因此,調節抑炎和促炎兩種免疫反應之間的平衡,有助于推動Treg細胞在MTB感染免疫機制中的研究,這也將有望為結核病提供新的免疫治療思路[17]。

2.共抑制分子在MTB感染中的抑炎作用:有研究表明,某些細胞因子如IL-10、TGF-β以及共抑制分子參與到抗MTB感染免疫應答中,不僅Treg在MTB感染抑炎機制中發揮作用,共抑制分子等在機體MTB感染抑炎機制中同樣至關重要[26-27]。

MTB感染后,肺泡巨噬細胞與T細胞在共信號分子配體和受體的相互作用下,介導共刺激或共抑制信號[28]。一方面,由共刺激分子介導的共刺激信號能夠保證T細胞的充分與有效活化。另一方面,細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)、PD-1等共抑制分子介導的共抑制信號能夠抑制T細胞的過度活化與增殖[29],從而在維持適度免疫應答中發揮重要的調控作用。其中,共抑制分子PD-1在活化的CD4+T細胞上高度表達,其在MTB感染抑炎機制中發揮尤為重要的作用[30]。

Tezera等[31]通過小鼠實驗研究PD-1在MTB感染中的作用,研究發現與野生型對照小鼠相比,PD-1缺陷的實驗小鼠的存活率明顯降低,肺內MTB的增殖明顯增強。研究人員還進一步通過氣溶膠感染PD-1缺陷小鼠,結果同樣表明PD-1缺陷小鼠肺部炎癥反應明顯增強,肺內菌落形成單位(colony forming units,CFU)增加及小鼠存活率明顯降低。因此,PD-1途徑是控制肺部MTB感染所必需的。

Ogishi等[32]對1例死于遺傳性PD-1缺陷的結核病患者進行研究,結果發現,在MTB刺激下該患者的淋巴細胞僅產生少量IFN-γ,流式細胞術結果顯示,PD-1缺陷患者中γδT細胞表面表達TCRγδ的Vδ2T亞型T細胞(Vδ2γδT)、黏膜相關恒定T細胞和NK細胞等淋巴細胞亞群的IFN-γ產生都存在缺陷。此外,與健康對照組的細胞相比,患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)誘導活化的原始細胞經抗CD3/CD28抗體耦合珠刺激后產生的IFN-γ更少。因此,IFN-γ產生受損可能是PD-1缺乏患者容易感染MTB的原因。

此外,Liu等[33]認為與簡單產生大量短壽命效應T細胞的疫苗相比,具有PD-1抗原特異性CD4+T細胞的疫苗能夠誘導特異性CD4+T細胞成為具有自我更新潛力的細胞,這可能將增強疫苗的長期保護作用。由此可見,PD-1在控制MTB感染中具有不可或缺的作用,為PD-1缺陷結核病患者的診斷和治療提供潛在可操作的分子靶點。

CD8+T細胞在MTB感染免疫應答中的作用

盡管各類研究已證實CD4+T細胞在抗MTB感染中發揮了核心作用[34],但大量的小鼠結核病模型的研究結果表明,CD8+T細胞對于機體抗MTB感染也具有保護作用[7]。Cai等[35]研究發現,CD4+和CD8+T細胞對機體抗MTB感染具有不同的效應功能。CD8+T細胞能夠識別短肽、非肽類抗原,具有殺傷胞內病原體的能力[34]。MTB特異性CD8+T細胞能夠對被MTB感染的靶細胞產生溶細胞效應[36],其能夠通過分泌促炎細胞因子,凋亡相關因子配體(factor-related apoptosis ligand,FasL)和Fas受體之間的相互作用及通過分泌穿孔素、顆粒酶、顆粒溶解素從而誘導MTB的凋亡[9]。

記憶性CD8+T細胞是機體清除胞內MTB的重要組分,其特點是能夠長期存活,并能夠在MTB再刺激后快速大量增殖[37]。記憶性CD8+T細胞可以在表型、定位和功能上發生變化,從而快速保護宿主。CD8+T細胞具有提供廣泛反應性保護的潛力,可以抵抗表面蛋白迅速突變的病毒,在機體抗MTB感染中發揮重要作用[38]。

一、CD8+T細胞釋放細胞因子及通過凋亡相關因子受體-配體(Fas-FasL)相互作用參與MTB感染免疫應答

當機體感染MTB后,肺泡巨噬細胞可將MTB的降解肽段和脂蛋白抗原提呈給CD8+T淋巴細胞,CD8+T細胞被激活后釋放IFN-γ、TNF-α、IL-2等,進而激活巨噬細胞殺傷細胞內的MTB[39]。其中,IFN-γ的主要效應是活化MTB感染的巨噬細胞,但也有研究發現,并非所有的MTB特異性CD8+T細胞都能產生IFN-γ,其細胞功能之間可能存在不一致性[40]。另外,也有研究證實,當使用四聚體技術計數單一肽段抗原特異性的CD8+T細胞時,這種細胞之間的不一致性尤為明顯[41]。

此外,CD8+T細胞可通過Fas-FasL共刺激分子相互作用參與MTB感染的免疫應答。MTB特異性CD8+T細胞上的FasL與靶細胞上的Fas相互作用,使MTB從肺泡巨噬細胞中釋放出來,然后再被鄰近激活的肺泡巨噬細胞吞噬殺滅[42],從而殺滅MTB,誘導凋亡。

二、CD8+T細胞通過穿孔素、顆粒酶、顆粒溶解素參與MTB感染免疫應答

CD8+T細胞的殺傷機制通常依賴于穿孔素的產生,有研究發現,當機體感染MTB后,CD8+T細胞穿孔素和顆粒酶的表達將上調[43]。一方面,穿孔素能夠作為將其他蛋白質輸送到靶細胞的通道。另一方面,穿孔素還能夠溶解已發生MTB感染的巨噬細胞。同時,CD8+T細胞能夠表達顆粒酶,當CD8+T細胞與靶細胞結合時,這些顆粒酶將通過穿孔素運送至靶細胞。此外,Lin和Flynn[44]認為由于實驗小鼠中缺乏穿孔素,所以想要進一步探索CD8+T細胞功能與穿孔素的關系將具有一定的挑戰性。

有研究發現,與小鼠不同的是,人類和獼猴的肉芽腫中的CD8+T細胞能夠表達另一種重要的細胞溶解蛋白即顆粒溶素[44]。顆粒溶素能夠破壞細胞壁并擾亂MTB中的脂質代謝,但目前研究對于顆粒溶素在細胞介導的抗MTB感染免疫中的作用尚未完全了解[45]。總的來說,顆粒酶、顆粒溶解素利用穿孔素在靶細胞中形成的通道使蛋白酶進入巨噬細胞內,從而導致MTB感染的巨噬細胞被溶解,這主要是通過顆粒胞吐作用途徑使已感染MTB的巨噬細胞凋亡[42]。

三、NK樣CD8+γδT細胞在MTB感染免疫應答中的作用

MTB感染后,外周血中的γδT細胞比例大幅度升高,γδT細胞被激活后釋放大量的IFN-γ、IL-2、穿孔素和色氨酸酯酶,從而激活巨噬細胞并溶解MTB感染的細胞[42]。近期,Lin和Flynn[44]對一群來自南非的青少年的外周血中的γδT細胞進行了分析,發現一個獨特的γδT細胞亞群,即CD8+γδT細胞。

CD8+γδT細胞表面有兩個經典髓系細胞標志物CD11c和CD70,這兩個標志物在αβT細胞上的表達與抗原驅動反應和慢性免疫激活有關[46]。在CD8+γδT細胞中,CD11c的表達和功能可能與其在黏膜和表皮這樣的組織中的定位和遷移有關。CD11c同時也參與調節γδT細胞與其他細胞(如抗原呈遞細胞)的相互作用,影響抗原識別和免疫反應的效率[47]。另外,CD70在CD8+γδT細胞上的作用可能與在CD8+αβT細胞上類似,即通過與CD27的相互作用促進細胞的活化、增殖和功能[48]。然而,CD11c和CD70更具體的作用機制及區別尚不清楚,仍需要更進一步的探索。有研究發現,MTB感染中的CD8+γδ T細胞反應類似于在巨細胞病毒和其他一些病毒感染中的“記憶膨脹”現象,即CD8+γδT細胞具有強大的效應功能和克隆擴張的能力,其甚至在T細胞反應發生后仍然持續[44]。

CD8+γδT細胞與NK細胞一樣,可以產生CD16介導的細胞毒性反應。研究人員將其稱為NK樣CD8+γδT細胞,這類細胞在MTB感染中能夠通過不同途徑產生細胞因子參與免疫應答。NK樣CD8+γδT細胞的增加伴隨著CD8-γδT細胞頻率的降低。與CD8-γδT細胞相比,CD8+γδT細胞表達CD16、顆粒酶和穿孔素的水平明顯升高,通過CD16介導的細胞毒性功能也明顯增強[49]。

CD4+T細胞對CD8+T細胞的促進作用

Lu 等[38]研究發現,CD8+T細胞能夠獨立參與機體免疫應答,在缺乏CD4+T細胞的情況下,由CD8+T細胞參與的抗MTB感染免疫應答并沒有明顯延遲。此外,研究人員對MTB感染8周后的實驗小鼠進行RNA測序。結果表明,在MTB感染期間,CD4+T細胞促進CD8+T細胞產生IFN-γ和TNF-α,且增強了CD8+T細胞毒性。同時,CD4+T細胞能夠促進CD8+T細胞產生IL-2,IL-2和IL-21又能夠保證CD8+T細胞的存活。

此外,Sun和Bevan[50]研究發現,CD4+T細胞對CD8+T細胞的分化有促進作用,其主要機制是通過樹突狀細胞(dendritic cells, DC)的“許可”作用。首先,通過DC和CD4+T細胞之間的CD40∶CD40L相互作用介導,從而允許DC的功能成熟。由此,CD4+T細胞能夠增加DC的抗原呈遞和共刺激能力,即“許可”作用。獲得“許可”的DC即可以與CD8+T細胞相互作用并誘導強烈的原發性反應。另外,在某些情況下,CD40∶CD40L相互作用也可以直接發生在CD8+T細胞和CD4+T細胞之間。由此,CD4+T細胞在CD8+T細胞的分化中至關重要。

綜上,CD4+T細胞對CD8+T細胞具有促進作用。但是,研究進一步發現很難將CD4+T細胞的輔助作用與其對CD8+T細胞的效應作用分開[38],所以,CD4+T細胞是否有助于CD8+T細胞介導更大的免疫應答目前尚無定論,而CD8+T細胞對CD4+T細胞是否有平衡作用也仍需進一步研究。

總結和展望

近年來,國內外學者在抗MTB感染免疫應答機制上展開了多角度、多維度的探討和研究,基本確定了CD4+T細胞及CD8+T細胞分別通過不同效應網絡在MTB感染免疫應答中發揮著重要作用。一方面,CD4+T細胞對于機體抗MTB免疫應答與抑制機體免疫應答之間的平衡至關重要。其中,Th1、Th17在抗MTB感染中發揮促炎作用,Treg和共抑制分子等在抗MTB感染中發揮抑炎作用。另一方面,CD8+T細胞在抗MTB感染中的作用也不容忽視,其中NK樣CD8+γδT細胞發揮至關重要的作用,其作用機制有待進一步研究。

有關各類細胞在結核病免疫應答中作用及功能的研究不應是孤立的,應綜合代謝組學、基因組學、蛋白質組學、表觀遺傳學等不同學科、多種技術手段加以綜合分析,以獲得更全面、客觀的信息。在未來的研究中更應深入理解MTB誘導的免疫功能具體特征及機制,對于結核病的早期診斷、有效免疫干預、預后判斷及新型抗結核疫苗的設計都至關重要。當然,目前對于CD4+和CD8+T細胞在結核病免疫應答機制的研究存在一定局限性,未來應進一步對機體抗MTB感染的T淋巴細胞免疫應答機制展開深入研究,將對結核病的診斷和治療具有極其重要的意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻溫淑芳:起草文章、文稿修改;魏榮榮:文獻查詢和匯總;李浩然:對文章的知識性內容作批評性審閱;劉毅:文章設計、對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、行政/技術/材料支持、指導、支持性貢獻