甲殼素納米纖維溶液作為內鏡黏膜下注射液可行性研究

呂偉彥, 羅婭媛, 白燕鷗, 丁思元, 盧盛言, 劉 旭

1.錦州醫科大學北部戰區總醫院研究生培養基地,遼寧 沈陽 110016;2.北部戰區總醫院 消化內科,遼寧 沈陽 110016

內鏡下微創診療技術在消化道早癌、癌前病變、黏膜下腫物、賁門失弛緩癥等疾病的診療中發揮日益重要的作用[1-6]。在內鏡微創診療技術中,黏膜下注射是主要步驟之一。黏膜下注射溶液可使黏膜層病灶抬起并與固有肌層充分分離,黏膜下腫物與周邊組織分離,黏膜下層更加清晰,從而有助于降低內鏡下手術操作困難程度,提高病灶的完整切除率,降低出血、穿孔、透壁熱損傷等并發癥發生率[7-8]。隨著消化內鏡技術的發展,對黏膜下注射液的促進創面愈合、預防術后感染等新要求已成為內鏡微創診療術的研究熱點。甲殼素納米纖維(chitin nanofibrils,ChitinNFs)提取自甲殼素,是自然界中最豐富的多糖納米材料之一[9-10]。大量研究表明,甲殼素除了具有無毒、良好的生物相容性、生物可降解性等性能,還具有止血、鎮痛、促進傷口愈合、抗菌等性能[11-19]。而ChitinNFs除了具有甲殼素的上述性質外,還具有較高的比表面積、結晶度和模量[20-21]。本研究應用離體豬胃模型對ChitinNFs溶液作為新型黏膜下注射液的可行性進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 ChitinNFs制作 取魷魚軟骨30 g,將其裁剪成約3 cm長的小段,置于500 ml、1 mol/L的氫氧化鈉溶液中,80℃浸泡1 h,然后用清水沖洗至少20次。將上述操作重復3次。將堿洗完畢的物料置于500 ml、1%的鹽酸溶液中,室溫靜置1 h,然后將酸液排出,用去離子水沖洗物料,直至排出液體電導率≤70 S/m。將清洗好的物料于50℃恒溫烘箱中烘干至恒重。取烘干后的物料2 g置于1 L去離子水中,高速剪切至透明凝膠狀,制備成0.2%的ChitinNFs溶液。取一定體積的ChitinNFs溶液與生理鹽水配制所需比例的ChitinNFs溶液進行實驗。通過預實驗,0.1%、0.2%兩個濃度的ChitinNFs溶液可以通過內鏡注射針完成注射,0.3%濃度由于粘稠度較高,無法注射。結合剪切應力數據,確定應用0.1%、0.2%兩個濃度的ChitinNFs溶液進行研究。

1.2 離體豬胃準備方法 取4個新鮮離體豬胃,用組織剪剪取與人類胃黏膜結構相似的豬胃上部1/3,展平以減少胃壁厚薄不均對實驗的干擾。每個標本切成5 cm×10 cm的小塊,水平固定在白色泡沫板上備用。

1.3 可行性研究 在離體豬胃黏膜下分別注射0.1%、0.2%的ChitinNFs溶液及生理鹽水,分別記為0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組、對照組。用1 ml注射器45°在每組黏膜下注射對應的溶液。使用鋼格尺測量黏膜下隆起的高度,記錄各組溶液黏膜下注射后1～60 min的黏膜下隆起高度。同時間段應用Olympus超聲小探頭檢測黏膜下液體墊在1、10、30、60 min時間點的變化情況。測量完成后,將4個標本中的12個注射部位立即固定在甲醛溶液中,經蘇木精-伊紅染色后,行組織學檢查,觀察黏膜層與固有肌層分離情況。

2 結果

2.1 各組黏膜下注射后抬舉高度及維持時間 對照組、0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組注射后1 min抬舉高度分別為(12.5±1.2)mm、(14.5±1.5)mm、(13.8±1.7)mm。注射后間隔5 min測量黏膜抬舉高度,隨著時間推移,0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組各時間點黏膜抬舉高度大于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,圖1～2)。對照組在注射20 min后,黏膜下隆起高度基本消失,且下降趨勢更明顯。注射后60 min,0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組維持黏膜抬舉高度保留率分別為42.8%、61.6%。

圖1 各組黏膜下注射后黏膜抬舉高度變化趨勢

圖2 各組黏膜下注射后各時間點的黏膜抬舉高度

2.2 各組超聲表現 0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組注射后的1、10、30、60 min,超聲影像學所見到的胃黏膜下為均勻稍高回聲,隨時間變化彌散較慢,而對照組均表現為低回聲和混合回聲改變,隨時間變化彌散較快。見圖3。

圖3 各組黏膜下注射后各時間點超聲影像

2.3 各組黏膜下注射后組織改變及病理 0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組黏膜層和固有肌層均明顯分離,可見注射液墊,對照組黏膜層和固有肌層分離不明顯,無液體墊。見圖4。

圖4 各組黏膜下注射60 min后HE病理染色

3 討論

有研究報道,理想的黏膜下注射溶液應具備以下特征:(1)形成明顯的黏膜下水墊;(2)維持足夠長的黏膜隆起時間;(3)盡可能保證切除標本的完整性,便于對病灶進行精確的病理分期;(4)安全無毒,容易注射;(5)價格合理,容易獲取,便于保存[22-23]。目前,臨床較常用的生理鹽水安全性高、價格低廉,但形成隆起效果差、擴散快,需多次注射。近年來,新型黏膜下注射液研究眾多,主要有二氧化碳[24]、異丙烷[25]等無機化合物,甘油[26]等有機物,以及自體血[27]、明膠[28]、透明質酸[29]等生物材料。但這些新型的黏膜下注射液有各自的優缺點,且應用于臨床的進展相對緩慢。

本研究對離體豬胃模型進行黏膜下注射,通過黏膜外測量及超聲影像黏膜下檢測發現,隨著時間推移,0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組黏膜抬舉高度始終大于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),且0.2% ChitinNFs組更為明顯。這說明,ChitinNFs溶液能夠形成明顯的黏膜下水墊,并且具有較好的維持黏膜下隆起時間。HE染色發現,0.1% ChitinNFs組、0.2% ChitinNFs組黏膜下各層清晰,可見溶液注射后的明顯液體墊,說明其能夠保證切除組織病理的完整性。這些條件證實了ChitinNFs溶液能夠作為理想的黏膜下注射液。

綜上所述,ChitinNFs溶液作為黏膜下注射液具有可行性。本研究具有一定的局限性,未在活體內進行甲殼素止血、鎮痛、促進傷口愈合、抗菌等特殊性能的相關驗證。此外,本研究剪切應力的數據和內鏡注射針預實驗驗證了0.1%、0.2%兩個濃度溶液的實驗結果,雖能夠說明其作為內鏡黏膜下注射液的可行性,但更加精準、高效且有更多豐富作用的溶液濃度仍需細致的分組實驗進行探究。