腫瘤相關巨噬細胞外泌體調控KRAS 信號通路影響胰腺癌細胞糖酵解功能

迪里夏提·阿力木,鄭堅江,多力坤·吐拉哈孜,阿木提江·馬合木提 （新疆維吾爾自治區人民醫院肝膽胰醫學診療中心，新疆 烏魯木齊 830001）

胰腺癌是發病于胰腺導管上皮及腺泡細胞的惡性腫瘤，其早期發病隱匿，缺乏診斷的標志物，患者生存時間短，被稱為“癌中之王”，因此探究胰腺癌診斷的標志物和治療的新靶點一直是研究的重點領域[1-2]。有研究指出，腫瘤相關巨噬細胞可調控胰腺癌的病理進程，包括腫瘤的生長和轉移[3]。根據巨噬細胞的激活方式可分為M1 型和M2 型，其中M2 型巨噬細胞與腫瘤相關巨噬細胞表型及功能相似，因此常用于腫瘤相關巨噬細胞的體外研究[4]。Ye等[5]研究指出，腫瘤相關巨噬細胞能夠通過調控CCL18/NF-κB/VCAM-1信號通路從而促進胰腺癌的轉移。Wang 等[6]研究發現，腫瘤相關巨噬細胞亦可促進胰腺癌的免疫耐受。外泌體是多種細胞分泌的納米級囊泡，腫瘤相關巨噬細胞可通過分泌外泌體調控胰腺癌血管新生、進展、耐藥等[7-9]。高水平糖酵解是胰腺癌腫瘤微環境的特征之一，既可為腫瘤的生長提供ATP，又可創造利于腫瘤生長的酸性環境[10]。本研究探究了腫瘤相關巨噬細胞外泌體對胰腺癌細胞糖酵解的影響及機制，以期為胰腺癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細胞株CAPAN-2 和ASPC-1，人單核細胞THP-1 購自中國科學院上海細胞庫；佛波酯、rhIL-4和rhIL-13 購自美國Sigma 公司；外泌體提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Lipofectamin 2000試劑盒購自美國Invitrogen 公司；CCK-8 試劑盒、葡萄糖攝取試劑盒購自美國Abcam 公司；TRIzol 和Prime Script RT Reagent 試劑盒購自日本Takara 公司；SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購自美國Med Chemexpress 公司；乳酸檢測試劑盒購自江蘇KeyGEN Bio-TECH 公司；CD9、CD81、TSG101、KRAS、GAPDH 抗體及山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

CAPAN-2 和ASPC-1 細胞培養于含10%胎牛血清DMEM 培養基中，THP-1 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，培養至細胞匯合度達80%時進行細胞傳代。

M2 型巨噬細胞的誘導：THP-1 培養基更換為含150 nmol/L 佛波酯的培養基誘導72 h，使其分化為貼壁的M0 型巨噬細胞，所得M0 型巨噬細胞與20 μg/L rhIL-4 和20 μg/L rhIL-13 共培養，誘導72 h，使其分化為M2型巨噬細胞。

1.3 外泌體的提取與鑒定

收集M0 和M2 型巨噬細胞培養上清，將細胞上清液于4 ℃以3 000 g 離心10 min，取上清液，每1 mL 上清加入250 μL 的外泌體提取試劑，4 ℃靜置2 h，以12 000 g 離心20 min，棄上清，所得外泌體（M0 exo和M2 exo）用500 μL 無菌PBS 重懸。使用透射電鏡觀察外泌體的結構，Western blot 檢測外泌體標志物CD9、CD81、TSG101表達。

1.4 細胞轉染與分組

將CAPAN-2 和ASPC-1 細胞分為PBS 組、M0 exo組、M2 exo 組、M2 exo+siKRAS 組。M0 exo 組和M2 exo組CAPAN-2、ASPC-1 細胞分別與10 μg/mL M0 exo 和10 μg/mL M2 exo 共孵育24 h，M2 exo+siKRAS 組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞轉染KRAS siRNA 后與10 μg/mL M2 exo共孵育24 h，PBS組加入等體積PBS。按照Lipofectamin 2000 試劑盒說明書，將KRAS siRNA轉染至CAPAN-2 和ASPC-1 細胞，轉染48 h 后收集細胞進行后續研究。

1.5 細胞增殖實驗

將PBS 組、M0 exo 組、M2 exo 組、M2 exo+siKRAS組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞接種于96 孔板中，每孔細胞密度為5×104/mL，每孔100 μL，按照細胞分組將細胞與等體積的PBS、10 μg/mL M0 exo、10 μg/mL M2 exo、轉染KRAS siRNA+10 μg/mL M2 exo 共孵育24、48、72 h，在各時間點取出對應的96 孔板，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育4 h 后，使用酶標儀檢測450 nm波長處各孔光密度（optical density，OD）值。

1.6 qRT-PCR

使用TRIzol 試劑盒提取各組巨噬細胞總RNA，使用Prime Script RT Reagent 試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒進行qRT-PCR 反應，反應條件為：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40 個循環；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以GAPDH 為內參，使用2-ΔΔCt法檢測各組細胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10表達，引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.7 葡萄糖的攝取實驗

將各組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞接種至96 孔板中，每孔2 000 個細胞，待細胞貼壁后，PBS 清洗3 次，每孔更換為100 μL 含2%牛血清白蛋白的KRPH 溶液孵育30 min，再加入10 μL 2-DG 孵育20 min 后，加入80 μL 裂解液，分別于80 ℃孵育40 min，冰上孵育5 min，然后各孔加入10 μL 中和溶液，收集各孔上清液，加入10 μL 復合物A 溶液，37 ℃孵育1 h，然后加入等體積的中和緩沖液，混勻后使用酶標儀檢測412 nm 波長處各孔的OD 值。根據標準品濃度和OD值繪制標準曲線，計算各孔葡萄糖濃度，葡萄糖攝取率=（空白組葡萄糖含量-每孔剩余葡萄糖含量）/空白組葡萄糖含量×100%。

1.8 乳酸生成實驗

收集各組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞培養上清，按照乳酸檢測試劑盒說明書，每孔加入待測樣品20 μL（標準管加入3 mmol/L的標準液20 μL，空白管加入PBS 20 μL）、酶工作液1 mL、試劑盒D 工作液200 μL，混合均勻后于37 ℃水浴10 min，然后每管加入2 μL的Buffer E 溶液，混勻后，使用酶標儀檢測530 nm 波長處各孔的OD 值。乳酸含量=（待測樣品OD 值-空白管OD值）/（標準品管OD 值-空白管OD 值）×樣品測試前稀釋倍數×3 mmol/L。

1.9 Western blot

RIPA試劑盒提取M0 exo、M2 exo和各組CAPAN-2和ASPC-1 細胞總蛋白，所得蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉膜后，將PVDF 膜與CD9、CD81、TSG101、KRAS、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH 抗體于4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后，以1∶10 000 的比例稀釋山羊抗體IgG并室溫孵育1 h，洗膜，使用ECL試劑盒顯影。

1.10 統計學分析

使用Graphpad prism 7.0軟件進行統計學分析，所有數據以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 M2型巨噬細胞誘導結果

與THP-1 細胞比較，M0 型巨噬細胞中iNOS、IL-12β、Arg-1 和IL-10 表達無顯著變化（P>0.05），而M0+rhIL-4+rhIL-13 細胞中M1 型巨噬細胞標志蛋白iNOS和IL-12β表達顯著下調（P<0.001），M2型巨噬細胞標志蛋白Arg-1 和IL-10 表達顯著上調（P<0.001），見圖1。說明rhIL-4 和rhIL-13 可誘導M2 型巨噬細胞的極化。

圖1 qRT-PCR檢測細胞iNOS、IL-12β、Arg-1和IL-10 mRNA表達

2.2 M2型巨噬細胞外泌體鑒定結果

提取的M0 exo 和M2 exo 均呈雙層膜結構，粒徑100 nm 左右，呈“杯托”樣，并且均表達外泌體標志蛋白CD9、CD81、TSG101，符合外泌體的特征，見圖2。

圖2 M0 exo和M2 exo鑒定結果

2.3 M2型巨噬細胞外泌體促進胰腺癌細胞中KRAS/ERK1/2信號通路激活

與PBS組比較，M0 exo組CAPAN-2和ASPC-1細胞中KRAS 表達以及ERK1/2 磷酸化水平均無顯著差異（P>0.05）；與M0 exo組和PBS組比較，M2 exo組CAPAN-2和ASPC-1細胞中KRAS表達顯著增加（P<0.001），ERK1/2磷酸化水平顯著升高（P<0.001），見圖3。

圖3 外泌體對CAPAN-2和ASPC-1細胞中KRAS/ERK1/2信號通路的影響

2.4 M2型巨噬細胞外泌體促進胰腺癌細胞增殖

與PBS 組比較，M0 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞增殖能力在24、48、72 h 均無顯著變化（P>0.05）；M2 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞在24、48、72 h 的增殖能力均顯著高于其他組（P<0.05），見圖4。

圖4 外泌體調控KRAS 對CAPAN-2 和ASPC-1 細胞增殖能力的影響

2.5 M2型巨噬細胞外泌體上調KRAS從而促進糖酵解

與PBS 組比較，M0 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞的葡萄糖攝取率與乳酸生成水平均無顯著變化（P>0.05）；M2 exo 組CAPAN-2 和ASPC-1 細胞的葡萄糖攝取率與乳酸生成水平均顯著高于其他組（P<0.001），見圖5。

圖5 外泌體調控KRAS對CAPAN-2和ASPC-1細胞糖酵解的影響

3 討論

腫瘤相關巨噬細胞是一類腫瘤微環境中重要的免疫細胞，其表型和功能與M2 型巨噬細胞相似，具有促進腫瘤惡性生物學行為的功能[11]。Hwang 等[12]的研究指出，腫瘤相關巨噬細胞浸潤的增加與非小細胞肺癌患者不良預后密切相關。D'Errico等[13]的研究表明，腫瘤相關巨噬細胞可促進胰腺癌的轉移。Kemp 等[14]的研究表明，腫瘤相關巨噬細胞的水平能夠反映胰腺癌患者全身免疫水平的變化。腫瘤相關巨噬細胞對腫瘤的調控是通過多種途徑進行。Liu 等[15]的研究表明，腫瘤相關巨噬細胞可通過分泌轉化生長因子-β 而促進腫瘤的轉移。越來越多的研究表明，腫瘤相關巨噬細胞亦可通過分泌外泌體而調控胰腺癌的血管新生、進展、耐藥等[7-9]。本研究將單核細胞THP-1誘導分化為M2 型巨噬細胞，用于腫瘤相關巨噬細胞的體外研究，并且提取M2 型巨噬細胞分泌的外泌體，將外泌體與胰腺癌細胞CAPAN-2 和ASPC-1 共孵育后發現，CAPAN-2 和ASPC-1 細胞的增殖能力顯著增加。Wu等[16]也發現M2 型巨噬細胞外泌體可促進肝癌細胞生長。Wei 等[17]亦發現，M2 型巨噬細胞外泌體可促進肺腺癌細胞的生長。上述結果均說明M2 型巨噬細胞可促進腫瘤細胞的生長。

研究表明，KRAS 通路的異常活化與胰腺癌的病理進程密切相關，超過90%的胰腺癌患者均存在KRAS 基因突變，KRAS 異常活化會導致胰腺癌細胞的快速生長[18]。Diehl 等[19]的研究發現，KRAS/ERK 信號通路在胰腺癌中異常激活，靶向抑制ERK 可抑制KRAS 突變誘導的腫瘤生長。本研究將M2 型巨噬細胞外泌體與CAPAN-2 和ASPC-1 細胞共孵育后，CAPAN-2和ASPC-1細胞中KRAS 基因表達顯著上調，ERK1/2 磷酸化水平亦顯著升高，說明M2 型巨噬細胞外泌體可顯著激活KRAS/ERK1/2信號通路。Katopodi等[20]的研究表明，KRAS 突變可促進腫瘤微環境中腫瘤相關巨噬細胞的形成。Humpton 等[21]的研究表明，原癌基因KRAS 的表達可促進胰腺癌的生長。Dey等[22]的研究表明，KRAS 突變可誘導胰腺癌腫瘤微環境的代謝重編程。本研究發現，與M2 型巨噬細胞外泌體共孵育后，CAPAN-2 和ASPC-1 細胞糖酵解增加，抑制細胞中KRAS 的表達后，M2 型巨噬細胞外泌體對腫瘤細胞的糖酵解誘導能力顯著下降，說明腫瘤相關巨噬細胞外泌體可通過誘導KRAS 信號通路而促進胰腺癌細胞的糖酵解。

綜上所述，腫瘤相關巨噬細胞可通過分泌外泌體誘導KRAS/ERK 信號通路的激活而促進胰腺癌細胞的增殖和糖酵解。