PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬在力學(xué)失衡誘導(dǎo)終板軟骨退變中的作用

鄭 權(quán),吳明凡,邵 松,孫良業(yè),許俊勝 （安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院骨科，安徽 六安 237001）

椎間盤退變是引起頸腰痛及神經(jīng)損害的重要因素，而椎間盤退變主要由異常應(yīng)力、細(xì)胞衰老、炎性介質(zhì)分泌以及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙等引起。目前認(rèn)為終板途徑是椎間盤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的主要途徑，終板軟骨為透明軟骨，終板軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原（type Ⅱ collagen,COL-2A）、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）等細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于椎間盤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及形態(tài)維持都具有重要的作用[1]。有研究表明，終板軟骨的損傷可使相鄰椎間盤的壓力分布發(fā)生改變，髓核內(nèi)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少，從而誘導(dǎo)椎間盤退變[2]。研究顯示，異常力學(xué)刺激是導(dǎo)致終板軟骨退變的主要因素，脊柱穩(wěn)定性降低會(huì)導(dǎo)致椎間盤內(nèi)應(yīng)力異常，直接導(dǎo)致終板軟骨及椎間盤退變[3]。然而異常應(yīng)力誘導(dǎo)終板軟骨退變的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

自噬是細(xì)胞降解和再利用功能異常蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)的過(guò)程，通過(guò)自噬降解及重復(fù)利用細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞適應(yīng)外界的刺激及存活。線粒體自噬作為一種選擇性自噬，能夠清除細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及功能穩(wěn)定。目前認(rèn)為線粒體自噬主要是由PINK1/Parkin 信號(hào)通路以及不依賴PINK1 的受體介導(dǎo)[4]。PINK1/Parkin 信號(hào)通路作為介導(dǎo)線粒體自噬重要且較為成熟的信號(hào)通路，具有維持軟骨細(xì)胞功能的作用[5]。有研究表明，在關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程中，由PINK1/Parkin 信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬水平明顯降低，過(guò)表達(dá)Parkin 基因能夠明顯提高軟骨細(xì)胞COL-2A、ACAN 等細(xì)胞外基質(zhì)的水平，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨退變[6]。終板軟骨與關(guān)節(jié)軟骨同屬透明軟骨，但線粒體自噬對(duì)于應(yīng)力刺激誘導(dǎo)終板軟骨退變的影響及作用機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠脊柱失穩(wěn)模型，探討力學(xué)失衡條件下PINK1/Parkin信號(hào)通路介導(dǎo)線粒體自噬對(duì)于終板軟骨退變的影響，以期為椎間盤退變的相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD 大鼠18只（10周齡），雌雄不限，體質(zhì)量（180±20）g，上海西普爾一必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0035。本研究獲安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20220407001）。

1.2 試劑和儀器

DMEM/F12（美國(guó)Hyclone 公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibico 公司）；胰蛋白酶、COL-2A 酶（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；TRIzol（美國(guó)Invitrogen 公司）；PCR 反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas 公司）；RT-PCR儀（德國(guó)Roche 公司，LightCycler 480）；NanoDrop 2000（美國(guó)Thermo&Scientific 公司）；Odyssey 紅外成像系統(tǒng)（英國(guó)Li-Cor 公司）；羰基氰化物3-氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）；兔抗鼠COL-2A抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，1：1 000）；兔抗鼠ACAN、Parkin 抗體（英國(guó)Abcam 公司，1：1 000），兔抗鼠PINK1、Tomm20、Timm23 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，1：1 000），山羊抗兔二抗（美國(guó)Bioworld Technology公司，1：5 000）。

1.3 大鼠脊柱失穩(wěn)模型的構(gòu)建及分組

取18只SD大鼠，分為正常組、退變組及CCCP組，每組6 只。正常組大鼠未做任何處理。退變組：大鼠以6.5%的水合氯醛0.055 mL/kg 腹腔注射麻醉后取俯臥位，固定四肢，腰背部剃毛備皮約4 cm×8 cm，消毒鋪單，沿腰背部棘突作后正中切口，切開(kāi)皮膚后，沿骨膜下剝離。用咬骨鉗去除L2~L5的棘上韌帶、棘間韌帶以及兩側(cè)關(guān)節(jié)突，切斷棘突兩側(cè)的棘旁肌，逐層縫合皮下筋膜、皮膚。術(shù)后連續(xù)3 d，每只SD大鼠給予青霉素5 萬(wàn)U 肌肉注射。CCCP 組：在退變組手術(shù)基礎(chǔ)上，參考Kim 等[7]的方法沿纖維環(huán)緊貼終板軟骨向椎間盤注射CCCP（10 μmol/L）5 μL。所有大鼠單籠飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)16周。

1.4 石蠟切片的制作及組織染色

包埋與切片：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死各組大鼠，獲取L2~L5椎間盤組織，4%多聚甲醛固定24 h，EDTA 液中脫鈣1 個(gè)月，流水沖洗干凈，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。將蠟塊置于切片機(jī)上切片，取5 μm 厚的切片，置于載玻片上，37 ℃烘片過(guò)夜，標(biāo)記后進(jìn)行組織染色。HE染色：切片脫蠟、脫水，蘇木精染色3 min，自來(lái)水沖洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗10 min，伊紅染色2～3 min，自來(lái)水沖洗，梯度脫水后中性樹(shù)膠封片后觀察。番紅-固綠染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟，自來(lái)水沖洗30 s，固綠染色5 min；自來(lái)水沖洗1 min，番紅染色5 min。1%冰醋酸分色1 s，95%乙醇脫水2 次，每次1 min，100%乙醇脫水2 次，每次1 min，二甲苯透明2次，每次5 min，中性樹(shù)膠封固后觀察。

1.5 RNA提取及 RT-PCR

取各組大鼠的椎間盤組織，在4 倍解剖顯微鏡下用尖刀切開(kāi)，刮除髓核及纖維環(huán)，獲取終板軟骨放入研缽中，研磨至粉末狀。常規(guī)TRIzol 法提取終板軟骨組織的RNA，NanoDrop 2000 檢測(cè)RNA 的濃度與純度；取1 μg 總RNA，采用一步法20 μL 體系[DEPC 水12.5 μL，Oligo dT（100 mol/L）1 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，200 U反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，dNTP（濃度為10 mmol/L）2 μL]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA 稀釋5 倍，按20 μL體系在設(shè)定的程序下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，相關(guān)引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸25 s，擴(kuò)增50 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，滅菌超純水作為陰性對(duì)照，每個(gè)模板設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果使用相對(duì)定量2-△△Ct法分析。

表1 RT-PCR 引物序列

1.6 蛋白提取及Western blot

分離獲取終板軟骨組織，盡量剪碎研磨至粉末狀，采用RIPA 蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑PMSF提取總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取20 μg 蛋白樣品，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗后4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入二抗室溫孵育1 h，Odyssey 機(jī)器成像。采用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，目標(biāo)蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值為蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 力學(xué)失衡對(duì)大鼠椎間盤組織形態(tài)的影響

HE 染色顯示，退變組大鼠脊柱失穩(wěn)誘導(dǎo)的椎間盤組織破壞明顯，終板軟骨及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)也明顯受損；而CCCP 組大鼠椎間盤與退變組比較，髓核較為完整，終板軟骨及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)受損較輕，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤組織HE染色

番紅-固綠染色結(jié)果顯示，退變組大鼠脊柱失穩(wěn)誘導(dǎo)的髓核及終板軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌均較正常組明顯減少，CCCP 組大鼠中終板軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分泌較退變組明顯增多，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠椎間盤組織番紅-固綠染色

2.2 力學(xué)失衡誘導(dǎo)大鼠終板軟骨退變

RT-PCR 結(jié)果顯示，與正常組比較，退變組大鼠脊柱失穩(wěn)誘導(dǎo)的終板軟骨組織中ACAN、COL-2A mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）；而CCCP 組大鼠終板軟骨組織中ACAN、COL-2A mRNA 的表達(dá)明顯增高(P<0.05），見(jiàn)圖3a。Western blot 結(jié)果顯示，退變組大鼠終板軟骨中ACAN、COL-2A 蛋白水平較正常組明顯降低（P<0.05），而CCCP 組大鼠終板軟骨中ACAN、COL-2A 蛋白水平較退變組明顯增高（P<0.05），見(jiàn)圖3b、c。

圖3 各組終板軟骨組織中ACAN和COL-2A mRNA及蛋白表達(dá)

2.3 PINK1/Parkin 信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬在終板軟骨組織中的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示，與正常組比較，退變組大鼠終板軟骨PINK1、Parkin mRNA 表達(dá)明顯降低（P<0.05）；CCCP 組大鼠終板軟骨組織PINK1、Parkin mRNA 表達(dá)較退變組明顯增高（P<0.05），見(jiàn)圖4a。此外，Western blot 結(jié)果顯示，退變組大鼠終板軟骨PINK1 及Parkin蛋白水平較正常組均明顯降低（P<0.05），而線粒體蛋白Tomm20 及Timm23 水平較正常組增高（P<0.05）；CCCP 組大鼠終板軟骨中PINK1 及Parkin 蛋白水平較退變組明顯增高（P<0.05），線粒體蛋白Tomm20 及Timm23水平較退變組明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖4b、c。

圖4 各組終板軟骨組織中線粒體自噬相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)量

3 討論

椎間盤作為人體最大的無(wú)血管組織，其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要依賴椎體兩端終板軟骨以及外層纖維環(huán)的滲透作用。終板軟骨是連接椎體與椎間盤的薄層透明軟骨，其特殊結(jié)構(gòu)能夠維持椎間盤的形態(tài)及功能的穩(wěn)定。一方面，終板軟骨分泌的COL-2A、ACAN 等細(xì)胞外基質(zhì)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向椎間盤的運(yùn)輸[8]；另一方面，終板軟骨對(duì)于椎體與椎間盤之間的力學(xué)傳遞具有重要的緩沖作用[8]。研究顯示，終板退變是椎間盤退變的始動(dòng)因素，維持終板軟骨的正常功能對(duì)于椎間盤退變的防治起著決定性作用[9]。在肌肉及周圍韌帶的保護(hù)下，椎間盤通常處于靜態(tài)平衡或者動(dòng)態(tài)平衡，而一旦這種平衡被打破，脊柱穩(wěn)定性喪失，就會(huì)導(dǎo)致椎間關(guān)節(jié)退變，椎間盤異常應(yīng)力，進(jìn)而引起椎間盤退變[10]。本研究通過(guò)破壞大鼠脊柱后方結(jié)構(gòu)，構(gòu)建脊柱失穩(wěn)模型，結(jié)果顯示，脊柱失穩(wěn)能夠明顯誘導(dǎo)椎間盤退變，終板軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分COL-2A 以及ACAN 的合成減少；因此，我們認(rèn)為脊柱失穩(wěn)引起的力學(xué)失衡導(dǎo)致終板軟骨退變，終板營(yíng)養(yǎng)途徑障礙誘導(dǎo)椎間盤退變，改善終板軟骨的功能可延緩椎間盤退變。

線粒體是真核動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所，線粒體功能障礙與軟骨細(xì)胞退變密切相關(guān)。線粒體受損以及功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧及氧化應(yīng)激水平增高，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞合成及分解代謝，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞退變[11]。因此，適時(shí)清除老化和損傷的線粒體對(duì)于軟骨細(xì)胞功能維持具有重要的作用。線粒體自噬能夠選擇性地清除細(xì)胞內(nèi)受損或功能障礙的線粒體，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，從而維持軟骨細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境及功能穩(wěn)定[12]。有研究表明，PINK1/Parkin 信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬水平降低能夠抑制關(guān)節(jié)軟骨合成代謝，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨退變[13]。然而，在力學(xué)失衡誘導(dǎo)的終板軟骨退變過(guò)程中線粒體自噬水平的變化及作用機(jī)制目前仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，脊柱失穩(wěn)模型中終板軟骨細(xì)胞中PINK1/Parkin 信號(hào)通路被抑制，線粒體膜蛋白Tomm20 和Timm23水平增高，說(shuō)明線粒體自噬水平降低導(dǎo)致線粒體蛋白降解減少；在脊柱失穩(wěn)模型中給予線粒體自噬激動(dòng)劑CCCP 激活線粒體自噬后，終板軟骨中COL-2A及ACAN 表達(dá)升高，終板軟骨及椎間盤的退變均明顯減輕。由此可見(jiàn)，脊柱失穩(wěn)導(dǎo)致的異常應(yīng)力能夠通過(guò)抑制線粒體自噬影響終板軟骨細(xì)胞合成及分解代謝，進(jìn)而誘導(dǎo)終板軟骨退變，但異常應(yīng)力刺激調(diào)控PINK1/Parkin 信號(hào)通路介導(dǎo)線粒體自噬的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。