腫瘤相關巨噬細胞兩種不同亞型在結腸癌中的作用

李靜嫻 何 靖 佀亞蘭 李 巖

1 山東第一醫科大學第一附屬醫院(山東省千佛山醫院) 腫瘤學 山東省風濕免疫病轉化醫學重點實驗室山東省肺癌研究所,山東省濟南市 250000; 2 鄆城誠信醫院腫瘤科

根據國際癌癥研究機構(IARC)的數據,到2020年,全球約有190萬個結直腸癌新病例和94萬個結直腸癌死亡病例[1]。在如此龐大的病例數據的支持下,研究者發現,結腸癌中的腫瘤相關巨噬細胞并不全預示較差的預后,有時甚至可以限制原發性腫瘤的生長和轉移,為患者帶來更好的預后和治療效果。關于腫瘤相關巨噬細胞在結腸癌中發揮的作用目前尚無詳細且統一的確切研究,甚至很多實驗結果都是相互矛盾。

筆者在閱讀了大量臨床資料后發現,以上這些研究所體現出的不同預后價值,主要是因為腫瘤相關巨噬細胞其本身的異質性——兩種不同的腫瘤相關巨噬細胞亞型,即經典激活的M1亞型和交替激活M2亞型。腫瘤微環境中的巨噬細胞并不是單一亞型的聚集,往往都是M1和M2亞型巨噬細胞的混合物。目前人們普遍認為M1亞型的促炎和抗腫瘤效應功能(M1偏斜)更加有利于患者的預后;而M2亞型的免疫抑制和促愈合特性(M2偏斜)則會對結腸癌患者預后產生不利作用[2]。在腫瘤發展的不同階段,兩種亞型之間是可以通過一些免疫反應介質進行轉換來逆轉免疫和炎癥反應[3]。

因此明確腫瘤相關巨噬細胞兩種亞型在結腸癌中的具體作用,可為后續腫瘤學的研究發展提供更有力的參考價值。所以,本文探索了腫瘤相關巨噬細胞的代謝方式、標記物、在腫瘤中發生的作用、影響因素、臨床治療等方面,全面分析了M1亞型和M2亞型的不同之處。

1 腫瘤相關巨噬細胞兩種亞型不同的代謝方式適應不同的功能需求

1.1 M1型巨噬細胞的代謝方式 主要是由于糖酵解、三羧酸循環、脂肪酸合成和戊糖磷酸鹽通路的產生。其中,糖酵解是M1亞型獲取能量的主要方式,被經典激活的炎性M1巨噬細胞通過 AKT/mTOR/HIF誘導途徑所誘導。雖然糖酵解的方式效率低、葡萄糖消耗高,但其可快速產生能量用于生物合成的特性,非常有利于M1巨噬細胞及時防御病原體的功能。同時產生的琥珀酸、一氧化氮 (NO)、乳酸和活性氧(ROS)等也能抵御細菌和腫瘤細胞的侵襲。

1.2 M2型巨噬細胞的代謝方式 M2巨噬細胞則是通過激活脂肪酸氧化和增加氧化磷酸化、減少糖酵解等方式進行代謝。首先為M2提供能量的則是氧化磷酸化偶聯的氧化TCA循環。脂肪細胞中儲存的游離脂肪酸被激活的M2型巨噬細胞獲取、利用后,以甘油三酯的形式促進脂肪酸的合成。而在M1代謝過程中起主要作用的有氧糖酵解,在M2代謝中反而被抑制以產生細胞因子。

2 可識別腫瘤相關巨噬細胞的標記物

目前評判腫瘤相關巨噬細胞的預后相關性指標主要依賴一些泛巨噬細胞標志物,比如CD68等。然而作為泛標志物,它可以同時標記M1和M2兩種亞型的腫瘤相關巨噬細胞,被CD68標記的腫瘤相關巨噬細胞也被稱為泛腫瘤相關巨噬細胞。即使同為CD68陽性巨噬細胞,腫瘤內的巨噬細胞預示著更差的預后,而在腫瘤浸潤前沿(ITF)的巨噬細胞則預示著更好的生存率。這無法體現出腫瘤相關巨噬細胞的異質性,以這些指標預測預后必定會得到截然相反的結果[4]。因此在臨床實踐與實驗分析中應充分了解標志物,仔細謹慎對待使用CD68等泛標記物獲得的數據,排除掉泛標記物的影響,從而獲取最準確的信息。

2.1 M1型巨噬細胞的標記物 M1型巨噬細胞在抗原呈遞、淋巴細胞共刺激和殺傷的過程中,產生的標記物標志是CD68、CD80、CD83、iNOS、HLA-DR、CD40和iNOS等。周圍健康黏膜組織內巨噬細胞CD80的表達較腫瘤內的表達更高,從而使得腫瘤內巨噬細胞表現出免疫抑制作用。而在Ⅲ期腫瘤中,腫瘤浸潤前沿高 CD80/CD163比值則預示著更好的臨床預后。

2.2 M2型巨噬細胞的標記物 而M2巨噬細胞的標志是CD68、IL-10、CD163、CCL17、Arg1、MRC1、CCL22、CD206和CD204[5]。在巨噬細胞被極化時,M2型細胞亞型的標志物是CD163。CD163陽性的CD68+巨噬細胞占比為40%,而NOS2陽性的CD68+巨噬細胞占比為60%。所以,可以推測出,CD68對腫瘤的積極作用主要是由占比為60%的NOS2+巨噬細胞——M1型巨噬細胞產生的。幾乎40%的腫瘤相關巨噬細胞都可以表達CD163。通過分析CD68+/iNOS陰性腫瘤相關巨噬細胞的結腸癌患者的臨床數據,發現表達CD163+和CD68+腫瘤相關巨噬細胞的M2型巨噬細胞的腫瘤間質中的腫瘤壞死因子往往提示著更短的無病生存期(DFS)和總生存率(OS)。因此CD163往往預示著結腸癌患者較差的預后。

3 腫瘤相關巨噬細胞不同亞型在結腸癌中產生不同的作用

腫瘤相關巨噬細胞和結腸癌的關系緊密相連。首先,腫瘤相關巨噬細胞本身就是大多數炎癥細胞聚集的部位。其次,為了維持和調節腸道內環境的穩定,腸道內存在體內最大數量、最豐富的巨噬細胞。一旦受損就會導致腸道炎癥的出現。而這種持續的局部炎癥狀態就有利于腫瘤的產生。因此,揭示腫瘤相關巨噬細胞在結腸癌中的具體作用可以達到更加精準的臨床治療及推測預后。

3.1 M1型在腫瘤初始階段的抑制作用 M1型的巨噬細胞最初往往可以抑制腫瘤的生長。M1巨噬細胞在腫瘤發展過程中的主要作用在于促進Th1型免疫反應、表達高水平的促炎細胞因子、表達高活性氮和氧中間體和殺傷腫瘤活性等。例如,M1型細胞的極化可以刺激Th1細胞反應,對腫瘤和微生物發揮殺傷力。可以誘導抗腫瘤反應的高表達的促炎細胞因子主要有:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-23 (IL-23)和活性氧(ROS)[6]。另外,即使在低氧或者腫瘤細胞因子缺乏的環境下,M1型巨噬細胞仍然可以對腫瘤起到殺傷作用。

3.2 M2型對腫瘤發展的促進作用 M2型的巨噬細胞常常表現出預后不良和腫瘤免疫抑制的效果。 在一項針對81名中國結直腸癌患者的IHC研究中,侵襲前基質中CD163的高表達與較短的腫瘤分級、淋巴管侵襲、腫瘤侵襲、淋巴結轉移、TNM分期和無復發生存率顯著相關。CD163+(M2偏斜)巨噬細胞的密度越高,患者的預后越差[7]。在兩個連續的獨立隊列的病理Ⅱ期結直腸癌患者中,M2偏向的巨噬細胞數量較多,CD206+/CD68+比例較高,與復發頻率較高和總生存期較短有關[8]。M2型巨噬細胞也可能表明患者的腫瘤低分化、淋巴結轉移和肝轉移程度。

M2型巨噬細胞可促進組織和腫瘤的生長、高清除分子同時提供有效吞噬的作用,從而影響腫瘤微環境中免疫細胞的作用。M2型巨噬細胞的作用則是通過促進血管和上皮—間質轉化(EMT)的形成,為腫瘤提供營養,增強腫瘤細胞遷移和侵襲,參與組織建模和修復、調節性T細胞的分化并抑制抗腫瘤免疫等方式實現。可以產生的分子包括IL-6、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)和轉化生長因子-β(TGF-β)[9]。 其中,已知TGF-b通過miR-34a/VEGF軸促進腫瘤的生長和侵襲。

4 影響腫瘤相關巨噬細胞向不同亞型復極的因素。

4.1 促進M1型極化的生物因素 細菌產物(LPS)、干擾素γ(IFN-γ)、TNF-α、脂多糖(LPS)、Th1細胞因子(IFNγ)和toll樣受體激動劑可以極化激活M1,從而產生促炎、細胞毒性和呈遞抗原的作用。在單核細胞表面可以通過信號轉導和轉錄激活因子(STAT)1信號通路來產生M1型細胞。誘導M1型極化不僅有助于炎癥反應,而且在抗腫瘤免疫反應中也發揮著重要作用。

有學者指出,p50基因消除后IL-23表達的下調已被證明可增強M1/Th1免疫反應,這也是腸道內腫瘤多樣性和生長明顯減少的原因之一[10]。對PGE2受體EP4進行藥理抑制可增加抗腫瘤的M1型巨噬細胞的數量,抑制結腸中腫瘤的形成。

4.2 影響M2型的生物因素

4.2.1 促進M2型極化的生物因素:從細胞周圍環境來看,腫瘤微環境能對腫瘤相關巨噬細胞的異質性產生影響,促進其從促炎的M1型復極為抗腫瘤的M2型。首先,癌細胞本身可以招募骨髓來源的血液單核細胞,改變其代謝以促進M2型的極化。同時,結腸癌細胞還可以激活EGFR/PI3K/AKT/mTOR途徑分泌表皮生長因子來誘導M2的極化;結腸癌細胞CT116和HT29可以調節M2型巨噬細胞的表達,并使M2型更具侵襲性,例如通過增加波形蛋白表達和降低E-鈣蛋白水平。此外,正常結腸上皮細胞如果缺失SLC7A2的表達,也可以促進促炎細胞因子/趨化因子(IL-1β)、C-X-C基序配體1、2和5(CXCL1、CXCL2和CXCL5)、IL-3和CC-趨化因子配體3和4(CCL3和CCL4)的表達,從而刺激M2型的極化。

其次,一些白細胞介素除了可以幫助腫瘤免疫逃逸、增強其免疫抑制外,還能刺激腫瘤血管生成,促進腫瘤細胞生長、轉移和侵襲。其中,單核細胞表面的受體IL-4R可以和IL-4通過Jnaus激酶1(JAK1)和Jnaus激酶3(JAK3)促進STAT6的激活和移位,從而促進M2型的極化。除了上述的IL-4和IL-13之外,糖皮質激素可以誘導M2型巨噬細胞分泌部分抗炎細胞因子,如IL-10和IL-1β。TGF-β、CCL18均可以誘導促進M2型的極化,CCL18可能與炎癥消退過程中出現的第二波趨化因子和細胞浸潤有關,它也可以參與正反饋回路以維持患者體內的抗炎表型。肥胖的結腸癌患者體內IL-6的表達較非肥胖的結腸癌患者增高,這可以誘導CCL20的分泌,從而通過趨化作用招募表達CCR6的B細胞和γδT細胞,促進結腸癌的進展。

血管內皮生長因子一方面可以聚集腫瘤微環境中的髓源性抑制細胞、腫瘤相關巨噬細胞和調節性T細胞(Tregs)等免疫抑制細胞,另一方面可以驅動Tregs,降低CD8+T細胞中IFN-γ的分泌,促進M2型的活性表達。同時,M2型的類腫瘤壞死因子可以反過來產生大量的血管內皮生長因子,在腫瘤內形成一個免疫增強的逆向循環。

還有一些可以影響M2型的細菌,如產氣莢膜梭菌,它通過激活IL-6/STAT3/c-MYC信號有助于調節腫瘤免疫逃避,并被腫瘤相關的中性粒細胞、MDSC細胞和M2型巨噬細胞選擇性地招募。此外,前列腺素也可能有助于M2型極化。 例如,發揮重要作用的前列腺素E2,在組織炎癥條件下可通過花生四烯酸誘導環氧化酶-2(COX-2)的產生,促進M2型巨噬細胞的極化[11]。

許多外泌體都對M2型的極化產生重要作用。首先,M2型巨噬細胞本身所分泌的外泌體miR-155-5p、miR-21-5p可以分別通過影響IL-6穩定性、與結腸癌細胞編碼序列結合從而下調BRG1的表達來加速結腸癌的發生進展和轉移[12]。其次,在體外,M2型巨噬細胞的數量可以被結腸腫瘤球分泌的外體miR-1246提高;CAF分泌的含GM-CSF和IL-6的外泌體可以使單核細胞分化成M2型巨噬細胞,使M2巨噬細胞被激活從而促進結腸癌細胞的新生血管形成和血管生成,有利于腫瘤的轉移[13]。此外,幾個攜帶來自CRC細胞的miRNA的外泌體(miR-130b-3p、miR-25-3p和miR-425-5p)通過PI3K/Akt信號促進M2極化以調節PTEN基因所表達的蛋白,而腫瘤相關巨噬細胞也可以促進EMT和VEGF的產生。攜帶miRNA-106b-5p的外泌體也可以促進M2型極化并誘導CRC細胞的EMT,這可能與腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞之間的串擾有關。

4.2.2 抑制M2型極化的生物因素:在小鼠實驗中有學者觀察到,在隔日禁食的小鼠中,它們結腸癌細胞的生長速度會更慢一點,同時體重也沒有出現明顯下降。這與細胞外腺苷生成的減少和JAK1/STAT3途徑的失活有關,它們共同導致了M2型極化的抑制。這個實驗說明干預飲食是可以通過影響腫瘤相關巨噬細胞極化活性來影響腫瘤的發生發展。眾所周知,結腸癌腫瘤外源性因素包括飽和脂肪酸、精制碳水化合物、精加工肉類具有促炎特性的食物。這些食物和少量運動力量還可以導致肥胖—另一重要外源性因素。因此對于高危人群來說,控制飲食(減少促炎特性食物的攝入)對于預防癌癥來說有著積極作用。

5 有關腫瘤相關巨噬細胞的臨床腫瘤治療

由于M2型極化對腫瘤的促進作用和M1型極化對腫瘤的抑制作用,人工促進M2型腫瘤相關巨噬細胞向M1 型腫瘤相關巨噬細胞極化對確保腫瘤細胞的退化至關重要。目前,臨床上抑制腫瘤進展的治療思路也是刺激M1型的極化和抑制M2型的極化。然而,晚期腫瘤傾向于使大多數巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化。再加上實際的腫瘤微環境中M2型巨噬細胞的數量遠遠高于M1型巨噬細胞的數量,這些都使得腫瘤細胞的退化變得極為復雜。通過巧妙運用兩種亞型的不同特點和影響因素之間的關系,相當一部分藥物已經取得了一定的成效。

5.1 促進M1型極化的臨床治療 首先,在基因水平層面,塞來昔布通過增加ApcMin/+小鼠息肉中M1型相關基因(iNOS, CXCL10)的mRNA水平。其次,干擾M1、M2型極化的途徑及物質表達也可以產生相應的抗腫瘤作用。西妥昔單抗誘導結直腸癌中的M1型巨噬細胞標志物誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-12和TNF-α的表達。CCR5抑制劑可以通過STAT3/SOCS3途徑促進結腸癌患者體內的M1極化,從而抑制腫瘤的進展。他喹莫德影響早期腫瘤浸潤的骨髓細胞,誘導血管生成和表型變化,從而將腫瘤相關巨噬細胞轉變為炎癥性M1型。T2核糖核酸酶、多激酶抑制劑瑞戈非尼在平衡腫瘤中巨噬細胞的M1/M2型比例和招募適應性抗腫瘤CD8+T細胞方面都起著關鍵作用。

5.2 抑制M2型極化的臨床治療 一些臨床研究表明,非甾體抗炎藥(NSAIDs)可以通過抑制前列腺素E2,從而促進p50 NF-κB的激活和M2型的極化。抗CD40抗體也可以阻斷NK-κB途徑來抑制巨噬細胞M2免疫活性。多激酶抑制劑瑞戈非尼、達沙替尼可以抑制腫瘤相關巨噬細胞的M2極化[14]。 厄洛替尼則通過抑制EGFR相關的細胞內酪氨酸激酶的磷酸化來減少腫瘤相關巨噬細胞[15]。此外,一些血管內皮生長因子抑制劑如IL-33可溶性異構體sST2(ST2)等通過阻斷上文所述的血管內皮生長因子和M2型之間的反饋通路,使腫瘤免疫微環境正常化,從而抑制M2型極化。在使用IBC治療的基礎上,添加益生菌可以減少免疫抑制性調節性T細胞和M2型巨噬細胞的浸潤,改善免疫浸潤。

正如上文所述,腫瘤相關巨噬細胞對腫瘤的作用,主要是通過改變細胞外基質重塑、腫瘤代謝、血管生成以及腫瘤微環境等來促進腫瘤發展。雖然對腫瘤發展起到一定作用,但是兩種不同亞型的腫瘤相關巨噬細胞作用卻大相徑庭,因此本文總結分類兩種亞型在代謝方式、標記物、在腫瘤中發生的作用、影響因素、臨床治療等方面對于未來選擇腫瘤預后標志物、進行相關腫瘤相關巨噬細胞實驗研究和治療結腸癌都是非常有價值的。

在腫瘤相關巨噬細胞的研究中發現,部分泛標志物的使用不僅會導致實驗結果可信度的降低,同時也會為后續的研究增添不必要的困惑。對于所獲得的大量相互矛盾的實驗和臨床數據,筆者認為應該更仔細謹慎對待并詳細分析其出現的可能性。在研究結腸癌的進展當中,腫瘤相關巨噬細胞起到了主導地位,根據腫瘤微環境中產生的具體生物信號而改變,兩種不同亞型可以使其在腫瘤發展的不同階段起到完全相反的作用。如M1亞型具有促炎、抗腫瘤等作用,M2亞型可以抗炎、促進腫瘤發展。這兩種亞型的腫瘤相關巨噬細胞主要是通過分泌一些趨化因子和細胞因子來影響腫瘤生長、浸潤和免疫抑制的過程。目前臨床開發的一些抑制腫瘤進展的治療藥物,其治療思路主要就是刺激M1亞型的極化(增加M1巨噬細胞的數量和占比)和抑制M2亞型的偏斜極化激活(減少體內M2巨噬細胞的數量和占比)來改善患者病情,提高患者預后效果。

總之,分辨TAMs不同亞型在結腸癌中的作用對于未來選擇腫瘤預后標志物、進行相關TAMs實驗研究和結腸癌治療的臨床實踐都是非常有價值的。相信在不久的將來,會有更有效地促進M1型極化的藥物出現,應用于臨床。腫瘤研究人員都應該為此努力,并就腫瘤相關巨噬細胞的作用方式與治療應用進行更為深入的討論和探索。