某規模化牧場致犢牛腹瀉的大腸桿菌分離鑒定及耐藥性檢測

曹 芳，魏 勇，吳 憂，趙鵬飛，陳釗銘，任靜靜，齊亞銀

1 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤科技股份有限公司，新疆烏魯木齊 830063

0 引言

犢牛腹瀉俗稱犢牛拉稀，一年四季均可發生，是犢牛常發的一種胃腸問題。多發于2 周齡犢牛，這個階段的牛抵抗力差，容易受感染。犢牛患病后，如不及時治療，其死亡率升高，患腹瀉病的牛表現為便稀、嘔吐、脫水等癥狀，治療不當會影響生長。犢牛腹瀉的發生主要由多種因素引起，國內外研究結果證實，傳染性犢牛腹瀉主要由大腸桿菌、沙門氏菌、球蟲、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒等病原導致[1～4]。其中，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的最主要病原菌，病死率40%～50%[5]，是一種可誘發腸內和腸外疾病的病原體[6，7]。目前臨床對大腸桿菌感染所致的犢牛腹瀉，一般采取抗菌藥治療，但抗生素長期、不規范使用，致病菌容易產生耐藥性，導致治療效果下降甚至無效。

為了解新疆某規?；翀鰻倥８篂a流行情況以及大腸桿菌感染情況，找到合適的治療措施，本試驗從石河子地區某規?；翀霾杉篂a犢牛糞便樣品，進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，并結合牧場實際情況，提出合理應對措施，為石河子地區犢牛腹瀉的防治及犢牛健康養殖方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例來源

石河子某規模化牧場腹瀉犢牛糞便樣品。

1.2 試驗儀器設備

光學顯微鏡（Olympus公司）、恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器廠）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、PCR擴增儀（Techne公司）、凝膠成像系統（Biorad公司）。

1.3 主要試劑

LB液體培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司），鏈霉素、青霉素、氨芐西林、四環素、頭孢噻肟、萬古霉素藥敏紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.4 臨床診斷與采樣

觀察犢牛肛門及糞便，注意犢牛的精神狀態、被毛、采食情況等。清晨飼喂前無菌采集腹瀉嚴重犢牛的糞便樣品15份，置于5 mL無菌離心管中，-20 ℃保存備用。

1.5 病原菌分離純化及DNA 提取

取糞便樣品無菌接種于5 mL LB液體培養基中，置于37 ℃搖床中過夜培養。取2 mL菌液按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取細菌總DNA，-80 ℃儲存備用。從剩余菌液中無菌劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養基中，置于37 ℃溫箱中培養24～48 h。挑取伊紅美藍瓊脂培養基中典型單菌落接種于LB液體培養基中，37 ℃搖床中過夜培養；然后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基中，37 ℃培養24～48 h。繼續挑取典型單菌落接種于LB液體培養基，37 ℃搖床中過夜培養，后染色鏡檢。

1.6 PCR 鑒定

設計大腸桿菌特異性引物，將上述DNA進行PCR擴增。引物序列見表1，反應體系為25 μL：2× Taq Plus Master mix Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 12 μL，cDNA模板2 uL。反應程序為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，30 個循環，72 ℃延伸50 s，72 ℃終延伸10 min。

表1 相關細菌引物序列

PCR擴增反應完成后，進行凝膠電泳試驗，在凝膠成像儀下觀察，若出現與引物相應大小條帶則為目的條帶。

1.7 藥敏試驗

取營養肉湯增菌培養后的菌液，用移液槍吸取100 μL均勻涂抹到整個麥康凱瓊脂培養基上[8]，貼藥敏片，37 ℃倒置培養24～48 h，判定結果參照美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）藥敏紙片擴散法法規[9]。

2 結果與分析

2.1 臨床診斷結果

該牧場犢牛出現腹瀉癥狀，糞便呈黃色，稀狀；被毛雜亂無光澤；腹瀉犢牛食欲下降，腹部收縮，精神不濟（圖1）。

圖1 腹瀉犢牛的被毛和糞便情況

2.2 病原菌分離鑒定及純化

針對采集的腹瀉犢牛糞便樣品，增菌培養后提取D N A 進行特異性引物P C R 擴增，鑒定結果顯示，1 5 份樣品中共有1 2 份感染大腸桿菌，感染率為8 0%，P C R 擴增結果如圖2 所示，可觀察到287 bp（大腸桿菌）條帶，大小與預期符合。

圖2 PCR 鑒定結果

將菌液接種于伊紅美藍瓊脂培養基上，培養基上生長出紫黑色并帶有綠色金屬光澤菌落（圖3a）。挑取典型單菌落增菌接種于麥康凱瓊脂平板中培養，發現麥康凱培養基平板上長出圓形、金屬紅色光澤菌落（圖3b）。菌落分離純化后，鏡檢結果顯示該菌為革蘭氏陰性桿菌，其形態與大腸桿菌一致（圖3c）。

圖3 接種于鑒別培養基后的形態結果和菌液鏡檢結果

經P C R 結果、培養基培養鑒定結果以及鏡檢結果，可判定糞便樣品中致病菌之一為大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，1 2 份大腸桿菌糞便樣品中分理得到的1 3 株大腸桿菌對鏈霉素耐藥率最高為46.15%（6/13），對青霉素、氨芐西林耐藥率為3 8.4 6%（5/1 3），且敏感菌株多為中低敏或低敏感；對四環素敏感性為76.92%（10/13），13 株菌株對頭孢噻肟和萬古霉素敏感性最高，為84.62%（11/13）。通過藥敏試驗結果，發現分離菌株多出現多重耐藥現象，詳細數據見表2。

表2 分離菌株藥敏試驗結果

3 討論

引發犢牛腹瀉的大腸桿菌病在全國乃至世界各地廣泛流行，給奶牛養殖造成巨大經濟損失[2]。目前，對大腸桿菌導致犢牛腹瀉的治療，多以抗生素為主。但隨著抗生素的廣泛、長期使用，細菌耐藥性問題日趨嚴重[10]。細菌耐藥性不僅對臨床治療有很大影響[11]，也給動物食品安全帶來潛在風險，對養殖業可持續發展帶來極大危害[12]。犢牛出生后由于自身機能較差，免疫力低下，易受環境、飼養管理、應激等因素[13]的影響，導致腹瀉。

本試驗對1 5 份犢牛腹瀉病料進行病原菌鑒定，除3 份為其他病原菌感染外，1 2 份是由大腸桿菌感染，大腸桿菌分離率為8 0%，說明該牧場犢牛腹瀉多為大腸桿菌感染所致。對1 3 株大腸桿菌進行藥敏試驗，結果顯示，大多數大腸桿菌出現多重耐藥現象，1 3 株大腸桿菌對頭孢噻肟及萬古霉素較敏感，對四環素敏感度也較高，建議該牧場根據分離得到的病原菌及耐藥結果采取合理治療措施。

通過調查發現，該牧場存在犢牛島無遮擋，且部分犢牛島未安裝蓋子；犢牛出生后疫苗接種落實不到位；犢牛圈舍環境臟、亂、差，糞便無人清理，墊料更換不及時；犢牛料不新鮮；犢牛發病初期未能及時察覺、未能合理使用有效藥物治療等問題。相關人員應加強飼養管理，及時更換墊草、清理糞便，及時消毒圈舍。對新生犢牛及時接種疫苗，制定嚴格的免疫保健方案。關注犢牛生長及身體狀況，一旦發現身體異常的犢牛，應盡快檢測。若確診為犢牛腹瀉，應及時確定引起腹瀉的病原菌，采取應對治療措施，按照嚴重程度使用乳酶生（乳酸菌片）調節腸道菌群，灌服萬金水，清理胃腸道有害致病菌。后期采用慶大霉素灌服，必要時及時補液。

4 總結

犢牛腹瀉是腸道消化功能障礙，主要由犢牛自身因素、環境條件、病原微生物等引起。牧場應加強管理，增強飼養人員的責任心，隨時觀察犢牛精神狀態，一旦出現腹瀉和脫水癥狀，立即查找原因，采取有效措施救治，盡量降低腹瀉對犢牛生長發育帶來的影響，同時合理使用抗生素，避免出現細菌耐藥情況。