牛乳中乳源糖巨肽及β-酪蛋白的分離純化

潘學春，黃 宇，錢成林

新希望乳業股份有限公司，四川成都 610011

0 引言

由于酪蛋白糖巨肽（CGMP）化學組成獨特，不含苯環氨基酸，含有唾液酸和低聚糖，因此具有生理活性。從相關文獻報道看，其活性（表達方式）主要有：①抗微生物活性；②糖巨肽中的唾液酸可抑制細菌和病毒在宿主細胞表面的附著和定植；③可與霍亂毒素和大腸桿菌毒素結合，降低其毒性；④能改善苯丙酮尿癥患者的治療效果[1～6]。由于CGMP具有生理活性，分離純化CGMP具有一定的研究價值。

凝乳酶能特異性水解κ-酪蛋白，使牛乳中酪蛋白結構穩定性被破壞，得到酪蛋白沉淀和乳清層。κ-酪蛋白水解后得到疏水性副干酪和親水性CGMP[7]，由于CGMP的親水性，使其存在于乳清液層中，因此可從乳清中分離CGMP。文獻中報道CGMP分離方法有：沉淀法、層析法及超濾法等[8～10]。綜合考慮成本、硬件投入及試驗環境要求等因素，本試驗采用以三氯乙酸（TCA）作為沉淀劑的沉淀法，探索不同濃度TCA對CGMP的溶解性影響，以期得到一套CGMP的分離純化工藝。

凝乳酶處理牛乳，排出乳清后得到沉淀，其主要成分是酪蛋白，含有較高比例的β-酪蛋白。若能從中分離出β-酪蛋白，則可增加β-酪蛋白分離的新途徑，同時也能提升CGMP提取副產物的利用率。結合張艷等[11]從牛乳中分離β-酪蛋白的方法，本試驗探討從凝乳酶酶解后沉淀中分離出β-酪蛋白的工藝路徑。

從相關文獻報道可知，CGMP的檢測方法包括比色法、間苯二酚法、電泳法及高效液相色譜法；β-酪蛋白的檢測方法包括高效液相色譜法和電泳法。從實驗室硬件基礎、技術難度等方面分析后，本試驗采用高效液相色譜法來測定CGMP和β-酪蛋白含量和純度[12～14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛乳。β-酪蛋白標準品（sigma），CGMP、氯化鈉（GR級）、凝乳酶（35 萬U/g）、三氯乙酸（色譜純）、三氟乙酸（色譜純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）、95%乙醇（色譜純）、丙酮（色譜純）、β-巰基乙醇（色譜純）、鹽酸胍（色譜純）。

1 mol/L氯化鈉溶液：稱取58.44 g氯化鈉溶解于50 mL純水中，純水定容至100 mL混勻備用。

1%凝乳酶溶液：稱取0.25 g凝乳酶溶解于15 mL 1 mol/L氯化鈉溶液中，1 mol/L氯化鈉溶液定容至25 mL，混勻備用，2～6 ℃保存。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（安捷倫1260）、LCMSMS（安捷倫6470）、恒溫水浴鍋、冷凍離心機、高速離心機、渦旋振蕩器、0.45 μm PEFT濾膜。

1.3 方法

1.3.1 CGMP制備流程

新鮮牛乳→脫脂→加入凝乳酶→35 ℃酶解40～60 min→溶液B→加TCA溶液→離心→上清液C和沉淀D（含β-酪蛋白）。

上清液C→加TCA溶液→離心→CGMP沉淀→乙醇潤洗→丙酮潤洗→干燥→CGMP組分。

沉淀D→堿性復溶→降溫→調節pH值（4.6）→冷凍離心→上清液→升溫至30 ℃→常溫離心→β-酪蛋白組分→純水潤洗→干燥→β-酪蛋白。

1.3.2 CGMP和β-酪蛋白分離

（1）TCA濃度對CGMP制備的影響

分別量取6 組相同體積、凝乳酶酶解離心后的上清液C，加入20%的TCA溶液或固體TCA，使上清液C中TCA[5]濃度分別為3%、5%、8%、10%、12%、14%，將6 組樣品離心后，取上清液并用高效液相色譜法，測定溶液中CGMP含量。

（2）酶解后沉淀提取β-酪蛋白

沉淀D在pH值為11.0條件下復溶后，冷卻至2～4 ℃，全程保持在5 ℃以下，調節pH值到3.5，經過4 ℃冷凍離心后，收集上清液至新的離心管中（如果是絮狀物，可通過紗布或濾紙過濾）。水浴升溫至35 ℃，如果室溫較低（低于15 ℃），可將上清液溫度升至40 ℃，常溫離心得到β-酪蛋白固體，純水潤洗β-酪蛋白3 次以上，至純水pH值為中性，60 ℃以下烘干，-18 ℃保存。

1.3.3 CGMP高效液相色譜法測定

（1）樣品前處理

TCA沉淀后的CGMP溶液用0.45 μm PTFE濾膜過濾后，上機檢測。

取適量待測CGMP樣品，純水溶解后，渦旋混勻，0.45 μm PTFE濾膜過濾后用于液相檢測。

（2）液相色譜參數

色譜柱：300SB-CB 250★4.6 mm 5 μm；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：214 nm，輔助280 nm；流動相A：0.1 wt%三氟乙酸水溶液；流動相B：0.1 wt%三氟乙酸乙腈溶液；流速：1 mL/min。洗脫程序見表1。

表1 CGMP 高效液相色譜法洗脫程序

1.3.4 β-酪蛋白高效液相色譜法測定

（1）樣品前處理

取適量待測樣品加入490 μL的6 mol/L鹽酸胍靜置30～60 min后，再加入490 μL的4.5 mol/L鹽酸胍和10 μL的β-巰基乙醇，混勻，0.45 μm PTFE濾膜過濾后用于液相檢測。

（2）液相色譜參數

色譜柱：Vydac Everest C18 column，250×4.6 mm，5 μm，300 ?；進樣量：50 μL；柱溫：40℃；檢測波長：214 nm，輔助280 nm；流動相A：0.1 wt%三氟乙酸水溶液；流動相B：0.1 wt%三氟乙酸乙腈溶液；流速：0.7 mL/min。洗脫程序見表2。

表2 β-酪蛋白高效液相色譜法洗脫程序

2 結果與討論

2.1 不同TCA 濃度對CGMP 的影響分析

由表3可知，隨著酶解液中TCA濃度逐漸升高，CGMP不斷析出。當TCA濃度達到10%時，溶液中CGMP全部析出，因此選擇10%作為CGMP的沉淀濃度能實現CGMP的最高回收率，同時消耗TCA最少。另外，對比不同TCA濃度處理酶解上清液檢測色譜圖（圖1），當酶解液中TCA含量達3%時酶解液中CGMP的含量最高。

圖1 CGMP 高效液相色譜圖

表3 不同TCA 濃度對上清液中CGMP 含量測定匯總

綜合上述結果，優化后的CGMP分離純化工藝為：用3%的TCA沉淀酶解液中雜質，通過離心分離酶解后溶液中的雜質。繼續提高上清液中TCA濃度到10%，離心收集沉淀，經過潤洗后得到純度較高CGMP固體。收集分離純化后的CGMP固體，經高效液相色譜法檢測，CGMP純度為80%～90%。

2.2 β-酪蛋白的提取

牛奶經過凝乳酶酶解后得到沉淀D，在堿性條件下復溶后制備成蛋白液，經過低溫處理、pH值調節、冷凍離心、升溫及常溫離心后得到最終β-酪蛋白固體，通過高效液相色譜法測定其純度為8 5%～9 0%，高效液相色譜圖見圖2。

圖2 β-酪蛋白高效液相色譜圖

利用β-酪蛋白在低溫低酸性條件下游離的特性，本文采用凝乳酶酶解后的固體產品為原料，通過堿性復溶、低溫調酸、冷凍離心、升溫、常溫離心、水洗等操作后得到純度較高的β-酪蛋白。對比張艷等[11]以酪蛋白為原料通過鈣鹽沉淀，經過多次溶解沉淀得到較高純度的β-酪蛋白，本方法僅需要一次溶解和沉淀操作就能得到較高純度的β-酪蛋白，操作方便，效率更高。另外對比李武祎等[15]通過尿素拆解法，不需噴霧干燥等操作。

3 結論

本文通過乳品生產中常見的凝乳酶處理后得到的液體和固體產物，利用CGMP在不同濃度TCA中的溶解度差異，對CGMP分離純化，同時利用β-酪蛋白在低溫低酸性條件下能游離的特性，實現β-酪蛋白的分離純化。

通過增加TCA濃度實現CGMP的分離與純化，對比試驗結果顯示，采用3% TCA可有效沉淀酶解后上清液中溶解的雜質（主要是牛乳中的乳清乳白類蛋白質），再經過離心后得到純度較高的CGMP溶液，最后采用10% TCA沉淀出CGMP固體，得到的CGMP固體需通過乙醇和丙酮潤洗去除沉淀中殘留TCA，避免TCA對CGMP的分解。通過高效液相色譜法測定CGMP含量，考慮到無商品化的CGMP標準品，本試驗通過高效液相色譜法測定目標物的峰面積進行輔助驗證，通過色譜圖峰面積比值來測算目標產品的色譜純度，最終得到目標產物的色譜純度為80%～90%。

采用酶解后的沉淀為原料直接分離得到較高純度的β-酪蛋白，除試驗方法簡便高效外，擴展分離β-酪蛋白的原料選擇。另外酶解后固體中除含有β-酪蛋白外，還含有αs-酪蛋白，對于固體中αs-酪蛋白的分離純化，有待研究。