雙向孟德爾隨機化分析總膽固醇升高風險與膽石癥發生風險的關系

趙偉偉， 杜曉旭， 戈宏焱

1 內蒙古民族大學臨床醫學院， 內蒙古 通遼 028000

2 興平市湯坊鎮衛生院， 陜西 興平 713100

3 內蒙古民族大學醫學院， 內蒙古 通遼 028000

膽石癥發病率在中西方國家都比較高，在西方國家一些大城市的醫院中，大約有10%的成年人患有膽石癥［1］。目前關于膽石癥的風險因素有很多研究，但在這些研究中存在互相矛盾的地方，如有的研究［2］認為較低的總膽固醇水平是膽石癥的危險因素，但有的研究［3］認為較低膽固醇水平是膽石癥的保護性因素。關于膽石癥對總膽固醇水平的影響和因果關系尚未得到證實。已有的研究大多依靠傳統的觀察性研究得出關聯結論。傳統的觀察性研究由于本身的缺陷，受到大量混雜因素的干擾，因此本研究引入孟德爾隨機化（MR）來進行因果推斷，MR利用等位基因在減數分裂時隨機分配到子代的原理模擬隨機對照試驗，從而規避了不同混雜因素對暴露和對照的影響［4］。MR在觀察性研究中使用遺傳變異作為工具變量來檢測和量化因果關系。本研究使用雙向孟德爾隨機化（bidirectional MR）來探索總膽固醇水平和膽石癥之間的風險關系和因果推斷。

1 資料與方法

1.1 數據來源與研究設計 通過搜索open gwas（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/datasets）數據庫中有關總膽固醇水平和膽石癥相關的全基因組相關聯研究（GWAS）匯總數據，得到兩組樣本量相對較大和單核苷酸多態性（SNP）個數比較多的GWAS數據，具體信息見表1～2。將其中一組數據中的任意一個GWAS數據和另外一組數據中的任意一個GWAS數據進行組合，得到四種不同的暴露和結局的組合。利用設計的bidirectional MR模型來評估暴露和結局（總膽固醇和膽石癥）之間的風險關系和因果推斷（圖1）。

表1 總膽固醇GWAS數據匯總信息Table 1 Summary of the GWAS data for total cholesterol

圖1 bidirectional MR的模型圖Figure 1 Model diagram of bidirectional Mendelian randomization

1.2 工具變量的選擇 從全基因組（GWAS）上獲得P＜5×10-8水平的與暴露相關的遺傳變異。該遺傳變異必須滿足MR分析的三大假設：（1）關聯性假設，SNP與暴露強相關；（2）獨立性假設，遺傳變異與影響“暴露和結局”的混雜因素相獨立；（3）排他性假設，遺傳變異只能通過暴露對結局發生作用，而不通過其他途徑。設置連鎖不平衡參數（r2＜0.001），即兩個SNP之間是完全連鎖平衡的（這兩個SNP的分配是完全隨機的），遺傳距離設定為10 000 kb以選擇SNP，從而確保其獨立性，并排除連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）對結果的影響。通過GWAS提取滿足MR三大假設的SNP，合并暴露與結局的數據集，并刪除回文SNP。最后剩余的SNP即為指代暴露的最佳工具變量。

1.3 bidirectional MR方案 本研究分為兩部分，第一部分分別以表1總膽固醇GWAS數據為暴露、表2膽石癥GWAS數據為結局，應用MR分析方法中的Egger回歸法、中位數加權法、逆方差加權法隨機效應模型和固定效應模型等主要方法來初步計算因果效應值（b值）、OR值及95%CI等。然后將上述暴露和結局調換，以膽石癥GWAS數據為暴露、以總膽固醇水平GWAS為結局進行MR分析。第二部分將第一部分的數據去除異質性后做同樣分析。

表2 膽石癥GWAS數據匯總信息Table 2 Summary of the GWAS data for cholelithiasis

1.4 敏感性分析 用MR分析R包對所涉及的SNP進行Cochran’s Q檢驗，用于評估個體遺傳變異之間的異質性。如果Cochran’s Q檢驗的P＜0.05，代表基因間存在異質性可能。一般來說當異質性很大（P＜0.001）的時候，需要使用隨機效應模型，當異質性小的時候，使用固定效應模型。檢測SNP的水平多效性，當P＜0.05代表存在水平多效性，即所挑選的工具變量通過暴露以外的途徑影響結局，違反了MR三大假設。計算MR-Egger法的截距值，Egger回歸中的截距估計值可以解釋為遺傳變異間的平均多效效應的估計值［5］。當截距值與零相差較大代表存在總體方向多效性［6］，可能導致有偏差的MR估計值，所以本研究中列出MR-Egger方法的截距項。用MR-PRESSO檢驗去除離群的SNP后再進行上述步驟，得到最終的因果效應b值和OR值。

1.5 工具變量的評價 利用計算公式：R2=2×(1-MAF)(MAF)×其中，MAF為暴露的次要等位基因頻率，β為暴露的等位基因效應值，SD為標準差。注意，參與F值計算的R2為所有SNP的R2相加之和，表示最終工具變量指代了暴露的比率。再利用公式：F=其中N為暴露的總樣本數，K為SNP個數，R2同上；F＞10即為強工具變量，F＜10為弱工具變量。在兩樣本MR研究中，I2GX統計量比傳統F統計量更合適MR-Egger回歸方法，用MR-Egger方法計算I2GX。對于Egger回歸法來說，I2GX值越高，檢測定向多效性和因果效應的能力越強，弱工具變量偏差可能性越?。?］。以上所有方法學及可視化圖形均采用R 4.2.3版本獲得。

2 結果

2.1 總膽固醇水平和膽石癥之間因果關系的初步分析 以表1中GLGC或met的總膽固醇GWAS數據為暴露，用R軟件選擇P＜5×10-8的遺傳變異SNP位點進行匯集，去除連鎖不平衡后，篩選出滿足MR三大假設的SNP。用這些篩選出的SNP提取表2中ukb或finn的膽石癥SNP為結局。以Egger回歸法、加權中位數法、逆方差加權法（IVW）隨機效應模型、IVW固定效應模型做兩樣本MR（圖2），結果均顯示因果效應值b為負數，代表總膽固醇水平和膽石癥是負相關的，除了部分Egger方法P＞0.05外，大部分P＜0.05，具有統計學意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知總膽固醇對膽石癥具有負向因果關系。

圖2 以總膽固醇為暴露、膽石癥為結局的MR結果圖Figure 2 MR results of 4 methods with TC as the exposure and cholelithiasis as the outcome

2.2 膽石癥和總膽固醇水平之間因果關系的初步分析以表2中ukb或finn的膽石癥GWAS數據為暴露，表1中GLGC或met的總膽固醇GWAS數據為結局得到MR結果（圖3），顯示因果效應b值為負，代表膽石癥和總膽固醇是負相關，大部分P＜0.05，具有統計學意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知膽石癥對總膽固醇具有負向因果關系。

圖3 以膽石癥為暴露、總膽固醇為結局的MR結果圖Figure 3 MR results of 4 methods with cholelithiasis as the exposure and TC as the outcome

2.3 刪除離群SNP前的工具變量評價以及異質性分析利用R2及F值的計算公式，分別計算出每對暴露-結局數據的總R2值和F值。F值均＞10（表3），證明本次研究所選取的所有工具變量均為強工具變量。由表2可見全部數據都存在異質性（P值均＜0.05），可能會對MR分析結果產生偏差，因此需要去除異質性后（即刪除離群SNP后）再進行分析。雖然全部數據均不存在水平多效性（P值均＞0.05），但小部分數據MR-Egger截距值與零相差較大，也不排除總體方向多效性的存在，可能會導致這部分MR分析結果的偏差，待去除離群SNP后觀察能否消除這部分數據的偏倚。

表3 去除離群SNP前每對暴露-結局數據的工具變量評價及異質性分析結果Table 3 Results of R2，F and heterogeneity analysis for each pair of expose-outcome data before removing outlier SNP

2.4 總膽固醇和膽石癥之間去除異質性后因果分析將以總膽固醇為暴露、膽石癥為結局所得到的SNP用MR-PRESSO方法去除離群SNP后再重復分析，可得MR結果（圖4），nSNP個數較前減少，b值均＜0，代表總膽固醇和膽石癥是負相關，大部分P＜0.05，具有統計學意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知去除異質性后總膽固醇水平對膽石癥仍具有負向因果關系。

圖4 以總膽固醇為暴露、膽石癥為結局去除異質性后的MR結果圖Figure 4 MR results of 4 methods after removing heterogeneity with TC as the exposure and cholelithiasis as the outcome

2.5 膽石癥和總膽固醇之間去除異質性后因果分析將以膽石癥為暴露、總膽固醇為結局所得到的SNP用MR-PRESSO方法去除離群SNP后再重復分析，可得MR結果（圖5），SNP個數較前減少，b值均＜0，代表膽石癥和總膽固醇是負相關的，大部分P＜0.05，具有統計學意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知去除異質性后膽石癥對總膽固醇仍具有負向因果關系。

圖5 以膽石癥為暴露、總膽固醇為結局去除異質性后的MR結果圖Figure 5 MR results of 4 methods after romoving heterogeneity with cholelithiasis as the exposure and TC as the outcome

2.6 刪除離群SNP后工具變量評價以及異質性分析可見去除異質性后，所有工具變量的F值仍然＞10，P值得到很大提升，除了GLGC-finn和met-ukb這兩對暴露-結局數據的異質性較大（P＜0.05），其他的數據均不存在異質性；多效性檢驗顯示P值均＞0.05，提示均不存在水平多效性。ukb-GLGC和ukb-met存在I2GX等于0的情況，表明這兩組數據MR分析結果可能會產生弱工具偏差。ukb-GLGC這組數據的截距值與零相差較大（0.029），進一步證明了其可能存在總體方向多效性，從而導致結果有偏差的可能（表4）。但大部分數據既排除了多效性和異質性，也非弱工具變量，因此確保了結果的可靠性。

表4 去除離群SNP后每對暴露-結局數據的工具變量評價及異質性Table 4 Results of R2，F and heterogeneity analysis for each pair of expose-outcome data after removing outlier SNP

2.7 去除異質性前后四種MR方法的統計學意義 可見無論是否去除異質性，IVW固定效應模型均具有統計學意義（P＜0.05）。對于IVW隨機效應模型，去除異質性后P值均＜0.05。說明總膽固醇和膽石癥之間具有雙向因果效應的結論具有統計學意義（圖6）。

圖6 去除異質性前、后4種MR方法的P值改變Figure 6 The change of P values of MR before and after the removal of heterogeneity

3 討論

膽石癥影響著全世界10%～20%的成年人，是造成經濟負擔最重的疾病之一［8］。Lammert等［9］確定了幾個外源性的危險因素，包括代謝綜合征、飲食因素、膽囊功能低下、腸肝膽紅素循環和藥物，其中代謝因素的影響可能最大，因為環境因素可能通過調節代謝影響膽石癥。這些代謝性因素中，膽固醇水平與膽結石之間的相關性研究比較少。本研究基于bidirectional MR研究，探究總膽固醇水平和膽石癥之間的相互影響。

本次研究中所涉及到的GWAS數據均來自open gwas數據庫，涉及到的人群除了GLGC為混合人群外，其余均來自歐洲人群，最大程度降低人群分層給本研究帶來的影響。本研究所用數據研究不區分性別，但有研究［10］表明雌激素是膽石癥明顯的危險因素，女性更容易患膽結石，下一步可研究不同性別的總膽固醇水平GWAS數據與膽石癥GWAS數據之間的關系。

本研究分為兩部分，一部分為未去除異質性探究暴露與結局的關系，另一部分為去除異質性后探究暴露與結局的關系。以met和finn這組數據為例，其IVW_fe方法所得b＜0，OR=0.74，P=0.06。而去除異質性后可得b＜0，OR=0.83，P=0.000 38，說明去除異質性后，既能得出總膽固醇和膽石癥之間負相關，又有統計學意義。此外，本研究中可以看到去除異質性后MR-Egger方法并沒有之前有效的情況。以ukb-GLGC這組數據為例，去除異質性后的MR-Egger方法P=0.095，其I2GX值為0，而未去除異質性時P=0.038，I2GX值為97.4%。說明此組暴露-結局數據未去除異質性的MR-Egger方法P值更有意義且檢出多效性的能力更強，這也可能是由于去除異質性后SNP個數較少導致。本研究中還可以看到無論是否去除異質性，MR-Egger方法都存在無效的情況。以met-finn數據為例，去除異質性前后，MR-Eggr方法均無統計學意義。這可能由于MR-Egger估計值的精確度并不取決于遺傳變異可以解釋的暴露比例（比如IVW方法），而是取決于與暴露有關的遺傳關聯之間的差異所導致［11］。如果這些關聯都很相似，那么MR-Egger估計值的置信區間就會很大，這會導致MR-Egger估計值的精確度總是會低于IVW估計值［11］。從去除異質性前后4種MR方法的統計學意義分析中也可以看到各組暴露-結局數據間MR-Egger方法的P值差異性也是最大?？傊?，MR-Egger方法的精確度沒有IVW隨機效應模型和IVW固定模型高。也就是說，MR-Egger方法特別容易出現偏差［12］，這也是本研究MR-Egger方法有統計學意義的P值不多的原因。

本研究證實隨著總膽固醇水平暴露的增加，膽石癥發病風險是降低的，其機制有待進一步研究，有研究表明膽汁中會形成簡單膠束，能夠溶解膽固醇、磷脂等其他類型的脂質，所以可能是由于使總膽固醇水平增高的基因能增加膽汁中可以溶解膽固醇的簡單膠束的形成，從而使膽汁中的膽固醇結晶減少，抑制膽結石的形成［2］。也可能是由于基因導致的肝臟從血漿脂蛋白和從頭合成的膽固醇中攝取的膽固醇減少，而使得轉化為膽汁的膽固醇減少來抑制膽結石的形成。但并不意味著高膽固醇飲食或者其他提高血總膽固醇水平的方法都可以使得膽石癥發病風險下降。因為這是兩種不同的機制，MR是從基因水平上做出的因果推斷［13］，與暴露有關的遺傳變異在出生前就已經確定［14］，而中途施加的干預可能不通過暴露-結局的直接途徑，而通過其他混雜因素影響結果。對于隨著膽石癥發病風險增加，總膽固醇水平是降低的這一結論，可能是由于膽石癥影響了膽固醇的吸收，或者增加了肝臟膽固醇分泌進入膽汁的去路［15］，亦或者膽石癥相關基因抑制了膽固醇形成相關酶的活性，其機制有待進一步研究。同樣，MR分析中與膽石癥有關的遺傳變異，并不總是和實際的干預措施有相同的作用機制。

本次研究存在一些局限性。首先，本研究所用數據來自open gwas公共數據庫里的匯總數據，部分數據距今時間較長，當和新近數據進行聯合分析時，后來新增的遺傳位點可能分析不到。但這可能只會影響到分析的精確性，并不會影響分析的真實性。其次，數據集包括歐洲人群，這限制了結果對非歐洲人群的使用性。未來需要更多的研究來驗證這些結果在其他人群和其他種族中的適用性。對于亞洲人群，只有少量日本數據庫有關于總膽固醇水平相關GWAS數據，對于膽石癥的全基因研究還是空白。本研究結果是否可以作為亞洲人群的適用參考還有待考證；再次，從本研究可以看到，以總膽固醇水平為暴露、膽石癥為結局的SNP個數比以膽石癥為暴露、總膽固醇水平為結局的SNP個數多，后者在去除異質性后SNP的數量更少，即研究膽石癥為暴露變量的數據集樣本量較少，后者的統計效能比前者低，所以需增加樣本量后進一步分析，但并不影響研究結果的有效性。從本研究可以看到基于不同數據集產生的結果有些許偏差，可能有如下原因：（1）不同數據集篩選入組的患者可能有種族差異，本研究納入的大多為歐洲人群，也有混合人群，這為結果帶來偏倚，具有明顯的人群效應可能。（2）不同數據集的納入排除標準不一致，比如本研究部分采用的是2021年的GWAS數據，無法明確該數據的納入排除標準與2017年的GWAS數據集是否一致。（3）樣本量不足，尤其是以膽石癥為暴露、總膽固醇水平為結局的數據集。（4）遺傳變異的方向性，尤其是MREgger方法要求與暴露的遺傳關聯具有相同的符號［16］，而本研究數據，大部分與暴露的遺傳關聯的符號不一致，這可能也是導致MR-Egger方法差異性較大的因素之一。

總之，本研究在一定程度上證實了總膽固醇水平與膽石癥之間的雙向因果關系，隨著遺傳上有關能使總膽固醇水平升高的等位基因的增加，發生膽石癥的風險降低。反之，隨著遺傳上有關能使膽石癥發病增高的等位基因的增加，總膽固醇水平降低。這為下一步完善高膽固醇血癥和膽石癥之間關系的研究指出了方向。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：趙偉偉負責課題設計，搜集資料，統計分析，論文撰寫等；杜曉旭負責數據搜集和整理資料；戈宏焱負責寫作思路的制訂，論文的寫作指導，修稿以及最終定稿等工作。

致謝：感謝open gwas網站、英國生物銀行、芬蘭生物銀行、代謝組學研究、全球脂質遺傳協會等公開數據集及有關工作人員的努力。

數據可用性聲明：本研究所用數據均來自公共數據庫，可從文中提及的PMID或數據鏈接進行下載。