膽管癌和膽總管結石患者膽汁中鈣衛蛋白檢測的臨床意義

計婷婷， 白冰清， 崔喻芳， 汪少飛， 洪江龍， 李揚， 鮑峻峻， 梅俏

安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科， 合肥 230000

膽管癌是膽管上皮細胞的惡性腫瘤，主要為腺癌，可發生于肝內、外膽管的任何部位［1］。治療方法主要為根治性手術切除，診斷依賴于病理學結果，如以內鏡逆行性胰膽管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）為基礎的膽管活檢和細胞刷檢等，但存在操作難度較大，出血穿孔風險較高，病理陽性率偏低等缺點［2］，因此，患者早期診斷較為困難，需要尋找協助膽管癌診斷的生物標志物。

在膽道慢性炎癥過程中，大量炎癥細胞聚集形成促進膽道腫瘤發生發展的微環境［3-4］。中性粒細胞是腫瘤微環境中的主要免疫細胞，在腫瘤中的作用仍存在爭議，在干擾素或轉化生長因子的作用下，中性粒細胞表現為抗腫瘤的N1型或促進腫瘤的N2型［5］。鈣衛蛋白作為中性粒細胞的主要蛋白，由S100A8和S100A9形成異二聚體，占胞質蛋白的45%。在炎癥過程中，中性粒細胞釋放鈣衛蛋白，上調活性氧類的合成，誘導腫瘤的發生，同時鈣衛蛋白可與Toll樣受體4（TLR4）等受體結合，活化NF-κB，刺激多種炎癥細胞因子、趨化因子等的表達，導致炎癥誘導腫瘤的發生發展［6-8］。此外，研究［7］表明，在腺癌組織中鈣衛蛋白表達增加，相反，在鱗狀細胞癌組織中鈣衛蛋白表達降低，提示鈣衛蛋白的組織分布及功能具有高度的異質性。膽管癌組織中鈣衛蛋白亞基S100A8表達水平增高，與膽管癌嚴重程度和不良預后相關［9］。

由于膽汁中存在膽管細胞和炎癥細胞的分泌物，并且膽汁較膽管癌組織病理更易獲得，膽汁中生物標志物水平可能更準確反映膽管組織的病理生理狀態。因此，本研究通過收集膽管癌和膽總管結石患者膽汁進行鈣衛蛋白等指標的檢測，探討膽汁鈣衛蛋白等在膽管癌診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2021年5月—2022年9月在本院行ERCP診治的膽道疾病患者，分為膽管癌組和膽總管結石組。收集患者臨床資料，包括性別、年齡、血常規、CRP、肝功能、腫瘤指標，同時獲取ERCP患者膽汁進行膽汁常規、生化、鈣衛蛋白、血紅蛋白、乳鐵蛋白檢測。采用ERCP下刷檢或活檢方式獲取細胞或病理組織，膽管癌的診斷符合2019版中國臨床腫瘤學會膽道系統腫瘤診斷治療專家共識［10］，膽總管結石的診斷滿足CT、MRI和超聲內鏡中任意兩項。兩組患者均排除急性膽管炎、原發性硬化性膽管炎和急性胰腺炎等。

1.2 主要試劑 鈣衛蛋白、乳鐵蛋白和血紅蛋白測定試劑盒均由安徽桐康醫療科技股份有限公司提供（批號分別為：20211101、20211103、20220801）。

1.3 檢測方法 （1）患者均于ERCP術前留取空腹靜脈血行血常規、CRP、肝功能、腫瘤指標檢測，術中ERCP插管成功時經括約肌切開刀內的鉗道抽吸5 mL膽汁棄去，再抽取10 mL膽汁，部分立即送檢膽汁常規生化，剩余膽汁置于-80 ℃冰箱保存備測。（2）膽汁鈣衛蛋白、血紅蛋白、乳鐵蛋白水平檢測：膽汁樣本3 000 r/min離心10 min，取上清，采用熒光免疫層析法檢測膽汁鈣衛蛋白、血紅蛋白、乳鐵蛋白水平。

1.4 統計學方法 使用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8、MedCalc軟件進行統計分析，對于計量資料，符合正態分布時以表示，不符合正態分布時以M（P25～P75）表示，兩組間數據不符合方差齊性條件，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。相關分析采用Spearman相關性檢驗。繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），計算約登指數、最佳預測截斷值、ROC曲線下面積（AUC），使用DeLong檢驗分析不同AUC的差異［11］。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的臨床資料比較 共納入112例患者，其中膽管癌組34例，膽總管結石組78例。兩組年齡、血常規部分指標（WBC、NEU、血紅蛋白）、肝功能（Alb、TBil、ALT、AST、ALP）、腫瘤指標（CEA、CA19-9）水平比較，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 膽管癌組與膽總管結石組患者臨床資料比較Table 1 Clinical data of patients with cholangiocarcinoma and cholangiolithiasis

2.2 兩組患者膽汁常規和生化水平比較 與膽總管結石組比較，膽管癌組患者膽汁氯化物水平偏高（P＜0.05）（表2）。

表2 膽管癌組與膽總管結石組患者膽汁常規和生化檢查結果Table 2 Routine and biochemical examination of bile in patients with cholangiocarcinoma and cholangiolithiasis

2.3 兩組患者膽汁中鈣衛蛋白、血紅蛋白、乳鐵蛋白水平的比較 與膽總管結石組比較，膽管癌組患者膽汁鈣衛蛋白水平增高（P＜0.05）（表3）。本研究未納入肝內膽管癌患者，因此，進一步將膽管癌分為高位膽管癌（11例）和低位膽管癌（23例），鈣衛蛋白水平在高位膽管癌組為3 867.71（2 235.66～26 407.40）ng/mL，低位膽管癌組為4 795.50（2 361.15～13 070.53）ng/mL，兩組比較差異無統計學意義（Z=0.129，P=0.897）。

表3 膽管癌組與膽總管結石組患者膽汁鈣衛蛋白等水平檢測Table 3 Determination of calprotectin and other substances in bile of cholangiocarcinoma and cholangiolithiasis patients

2.4 兩組患者膽汁中鈣衛蛋白水平與膽汁檢測指標的相關性分析 膽汁鈣衛蛋白水平與膽汁有關檢測指標結果顯示，膽汁鈣衛蛋白與膽汁白細胞計數、血紅蛋白、乳鐵蛋白水平具有相關性（r值分別為0.316、0.353、0.464，P值均＜0.05）。

2.5 膽管癌患者膽汁中鈣衛蛋白等指標的預測作用ROC曲線分析僅納入膽汁中3種特殊蛋白（鈣衛蛋白、血紅蛋白、乳鐵蛋白）和血CA19-9水平，結果顯示膽汁中鈣衛蛋白、血CA19-9水平以及兩者聯合對診斷膽管癌具有較高的敏感性和特異性，但3者之間AUC比較差異均無統計學意義（P值均＞0.05）（圖1，表4）。

圖1 膽管癌患者膽汁中鈣衛蛋白等指標的預測作用Figure 1 Predictive effect of calprotectin level in bile of patients with cholangiocarcinoma

表4 膽管癌患者膽汁中鈣衛蛋白等指標的預測作用Table 4 Predictive effect of calprotectin level in bile of patients with cholangiocarcinoma

3 討論

膽管癌的早期診斷缺乏特異的生物學標志物，肝功能異常提示膽道梗阻，但對病因診斷無特異性，血CA19-9水平常用于臨床篩查。膽管癌診斷需要組織病理或細胞學結果，ERCP常用于獲取組織細胞病理診斷，特異度較高（100%），但靈敏度較差（46%～73%）［12］。由于膽汁獲取相對簡單，并且膽汁由肝細胞分泌，經免疫細胞修飾，膽汁中含有大量生物標志物，可能有助于膽管癌的診斷。本研究通過對34例膽管癌和78例膽總管結石患者膽汁進行檢測，發現膽管癌組膽汁鈣衛蛋白水平高于膽總管結石組，同時進一步比較高位和低位膽管癌膽汁鈣衛蛋白水平未見明顯差異，提示膽汁鈣衛蛋白水平與膽管癌有關，但與膽管癌的部位無關。同時發現膽汁鈣衛蛋白水平與膽汁白細胞計數、血紅蛋白、乳鐵蛋白水平呈正相關。進一步分析發現，當膽汁鈣衛蛋白截斷值為1 977.17 ng/mL時，診斷膽管癌的敏感度為79.4%，特異度為75.6%，陰性預測值達89.4%，但陽性預測值偏低。對膽汁鈣衛蛋白和血CA19-9聯合，發現可提高診斷的敏感性，但膽汁鈣衛蛋白、血CA19-9以及兩者聯合的AUC比較差異無統計學意義（P值均＞0.05）。

既往研究［13-14］表明膽管癌組織中的中性粒細胞水平高于鄰近組織，并且高中性粒細胞水平患者總生存期較短。膽管癌中趨化因子CXCL5通過PI3K-Akt和ERK1/2-MAPK誘導中性粒細胞募集并促進腫瘤進展［15］。同時，研究［16-17］指出肝細胞癌的癌組織內中性粒細胞水平與術后不良預后相關。腫瘤微環境中的中性粒細胞通過產生活性氧類、表皮生長因子、促血管生長因子、中性粒細胞細胞外陷阱等誘導DNA損傷、上皮癌變，并促進腫瘤生長、血管生成及腫瘤轉移［18-19］。鈣衛蛋白是由中性粒細胞分泌的主要蛋白，臨床常用糞便鈣衛蛋白檢測炎癥性腸病的疾病活動度，腹水鈣衛蛋白協助自發性細菌性腹膜炎的診斷，膽汁鈣衛蛋白預測原發性硬化性膽管炎患者的預后等［20-21］。研究表明，鈣衛蛋白與腫瘤的慢性炎癥和腫瘤的侵襲轉移相關［8］，腫瘤中鈣衛蛋白水平增高，鈣衛蛋白通過與細胞表面的EMMPRIN受體、TLR4、晚期糖基化終產物受體結合，激活MAPK通路，導致NF-κB核易位，刺激細胞表達抗凋亡蛋白、TNF-α等，在腫瘤的發生中發揮重要作用［22］。研究發現膽管癌組織中鈣衛蛋白亞基和乳鐵蛋白水平增加［20，23-24］，這與本研究一致。Voigtl?nder等［20］研究膽汁和血清鈣衛蛋白對原發性硬化性膽管炎的預測作用，發現膽管癌患者膽汁鈣衛蛋白水平較膽總管結石患者升高，但由于樣本量偏少，兩組膽汁鈣衛蛋白水平的統計學差異并不顯著。因此，鈣衛蛋白在膽管癌中的作用機制需進一步探索。

綜上所述，本研究從臨床角度證實膽汁鈣衛蛋白水平對膽管癌診斷的預測作用，未來或可常規檢測膽汁鈣衛蛋白水平協助膽管癌的診斷。

倫理學聲明：本研究于2019年10月15日經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批號：PJ2018-12-17），入組患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：計婷婷、白冰清負責課題設計，資料分析，撰寫論文；崔喻芳、汪少飛、洪江龍、李揚、鮑峻峻參與收集數據，修改論文；梅俏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。