茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量全基因組關聯分析及候選基因預測

張力嵐 楊 軍 王讓劍,*

茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量全基因組關聯分析及候選基因預測

張力嵐1,2楊 軍1,2王讓劍1,2,*

1福建省農業科學院茶葉研究所, 福建福州 350013;2國家茶樹改良中心福建分中心, 福建福州 350013

橙花叔醇與芳樟醇是廣泛分布于植物中的揮發性萜烯醇類化合物, 在茶樹新梢中主要以櫻草糖苷形式存在, 提高其含量對茶葉香氣品質改良具有重要意義。為揭示茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷的遺傳機制, 本研究以169個茶樹自然雜交后代單株為關聯群體, 利用均勻分布在茶樹染色體上的675,245個SNP標記, 對3個年份下茶樹新梢中橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量進行全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)。結果表明, 橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量的表型變異系數為60.83%～80.08%, 廣義遺傳力分別為51.29%與61.87%, 基本符合正態分布, 具有典型的數量性狀遺傳特征。全基因組關聯分析共檢測到50個顯著關聯位點, 各位點分別對橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量變化的貢獻率均超過20%, 其中橙花叔醇櫻草糖苷含量(nerolidol primeveroside content, NPC)變化位點最大貢獻率為38.73%, 芳樟醇櫻草糖苷含量(linalool primeveroside content, LPC)變化位點最大貢獻率為39.07%。通過等位變異效應分析, 鑒定出4個主效SNP位點及其優異等位變異, 并發現1個可同時調控NPC和LPC的一因多效位點。結合已有的文獻報道和基因的功能注釋, 篩選出每個顯著位點置信區間內最有可能的候選基因共59個, 主要涉及茶樹的糖類代謝、轉錄調控、萜烯類生物合成等多個生物學過程, 其中26個基因在適制綠茶品種和適制烏龍茶品種單芽中的表達水平存在顯著差異。本研究為深入解析茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量的遺傳機制提供了新的信息, 為加速培育高香型優異茶樹新品種提供了重要的基因資源。

茶樹; 橙花叔醇櫻草糖苷; 芳樟醇櫻草糖苷; 全基因組關聯分析; 候選基因

茶樹是世界上最重要的經濟作物之一, 2021年在全球的種植面積約為525萬公頃, 產量達到2819萬噸(http://faostat.fao.org/)。香氣是茶樹重要的感官品質之一, 很大程度影響茶葉的市場價值和大眾消費者的購買欲望。因此, 香氣品質的優劣一直都是茶樹育種工作者最關注的性狀之一。闡明茶樹香氣品質相關性狀的合成調控機理, 對提高茶樹育種的效率和準確性、推動茶產業高質量發展具有重要的研究意義。

橙花叔醇屬于倍半萜烯醇, 有水果百合、花木香和木香的香韻。芳樟醇又名沉香醇, 屬單萜烯醇類, 有玉蘭或百合花的香氣。橙花叔醇與芳樟醇在茶樹體內主要以櫻草糖苷(二糖糖苷)的形式存在, 且二者均為茶葉中極具代表性的香氣成分, 對茶葉香氣的形成有重要的作用[1]。Liu等[2]通過揭示茶樹中橙花叔醇與芳樟醇的生物合成調控機制, 為改善茶葉香氣品質提供了新的研究思路。Wei等[3]基于高通量SNP芯片, 定位到一個與綠茶特征香氣成分(E)-異丁香酚生物合成相關的強選擇位點。茶葉中關鍵呈香成分生物合成及其調控機制的研究報道, 為茶葉香氣品質的提升提供了重要的研究基礎和科學依據。近年來, 利用全基因組關聯分析(genome wide association analysis, GWAS)技術進行位點和基因挖掘已經廣泛應用在各類植物的香氣性狀研究中。在桃樹中, 對256份種質資源成熟果實中的揮發性化合物進行了測定, 基于全基因組關聯分析定位到一個編碼萜烯合成酶的基因, 該基因位于已報道的數量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)區域內, 且與芳樟醇的生物合成有關[4]。在西瓜中, 利用包括GWAS在內的多組學技術, 在4號染色體上挖掘到一個類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid clea-vage dioxygenase, CCD)基因, 該基因已被證實參與萜類揮發性有機物(volatile organic compounds, VOCs)的合成與代謝[5]。在藍莓中, 研究人員對886份個體的17種VOCs進行了測定, 通過GWAS關聯到6個與芳樟醇有關的基因, 8個與桉葉醇有關的基因[6]。

茶樹性狀遺傳背景十分復雜, 與香氣品質相關的基礎研究一直是茶樹遺傳育種的難點和重點。迄今, 有關茶樹橙花叔醇櫻草糖苷含量(nerolidol primeveroside content, NPC)和芳樟醇櫻草糖苷含量(linalool primeveroside content, LPC)全基因組關聯分析的研究報道較少, 遺傳機制尚不明晰。已經定位克隆的位點或基因, 并不能完全解釋茶樹香氣品質相關性狀的遺傳變異, 其復雜的分子機制尚需進一步研究。

本研究以169個不同遺傳背景的茶樹自然雜交后代單株作為關聯群體, 結合包含675,245個SNP標記的簡化基因組測序數據, 對NPC和LPC性狀展開全基因組關聯分析, 挖掘茶樹群體中調控NPC和LPC的重要位點及候選基因, 為解析茶樹橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量的遺傳機制, 推進高香型茶樹新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為包含169個茶樹種質的關聯群體, 為福建省農業科學院茶葉研究所構建的高香型優異茶樹種質FT516、FT104的自然雜交后代單株, 保存于福建省烏龍茶種質資源圃內(27°13′40″N, 119°32′11″E) (附表1)。其中FT516為黃觀音(♀)×鐵觀音(♂)雜交后代, FT104為毛蟹(♀)自然雜交后代。沙培從母樹上獲得的成熟種子, 2015年3月單株種植于田間, 株距0.5 m, 行距1.5 m, 每份種質材料為單株種植, 田間管理措施相對一致。取相同生長環境下的已推廣品種‘福云6號’與‘悅茗香’的健康無損傷單芽, 通過轉錄組測序, 輔助篩選候選基因。其中, ‘福云6號’為適制綠茶品種, 新梢單芽中NPC和LPC較低, ‘悅茗香’為適制烏龍茶的高香型品種, 新梢單芽中NPC和LPC較高。

1.2 表型數據測定與分析

2018、2019和2020連續3年分別采摘群體內各種質春季新梢健康無損傷單芽, 每份材料確保有3個生物學重復, 用于測定橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷的含量。

稱取2 g嫩芽置于50 mL塑料離心管中(精確至0.01 g), 加入20 mL甲醇, 10,000轉 min-1均質2 min, 超聲20 min, 1960′離心5 min, 移取上清液過0.22 μm有機濾膜進樣。

色譜條件: 流速0.3 mL min–1; 柱溫40℃; 樣品盤溫度15℃; 進樣量2 μL; 流動相A為0.1% (v/v)甲酸水溶液, 流動相B為乙腈; 梯度洗脫條件為: 0～3 min, 10%B; 3～9 min, 25%B; 9～11 min, 40%B; 11～12 min, 90%B; 12.0～12.1 min, 90%B; 12.1～ 16.0 min, 10%B。

質譜條件: 離子源為電噴霧離子源ESI; 負離子模式; 檢測方式為多反應監測; 大氣壓電離(API)氣體為氮氣(純度>95%, 壓力600～900 kPa); 碰撞氣體為高純氬; 界面電壓3.0 kV; 界面溫度300℃; 脫溶劑溫度250℃; 干燥氣10 L min–1, 霧化氣3 L min–1, 加熱氣10 L min–1, 熱塊溫度400℃。

稱取橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷標準品各10 mg, 用甲醇溶解并定容至10 mL, 即為1 mg mL–1的單標儲備液, –20℃下貯存于密封的棕色玻璃瓶中, 用其配制成不同濃度梯度的橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷標準溶液待用。將標準溶液進樣, 以標準溶液質量濃度為橫坐標, 定量離子峰面積為縱坐標, 繪制標準曲線并分別對待測種質橙花叔醇櫻草糖苷與芳樟醇櫻草糖苷進行定量。

采用Microsoft Excel 2021, 對關聯群體的表型數據進行整理。利用軟件SPSS 26.0, 進行表型性狀的統計描述以及廣義遺傳力(2)的計算[7]。采用皮爾遜(Pearson)相關分析, 計算不同年份間茶樹新梢中各糖苷含量間的相關系數。

1.3 全基因組關聯分析

經過III酶切茶樹的基因組DNA、酶切片段3￠端加A處理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴增純化以及目的片段文庫質檢等一系列主要流程, 對待測群體的種質資源進行SLAF-seq測序(specific locus amplified fragment sequencing)。以上工作基于北京百邁客生物科技有限公司的Illumina HiSeq測序平臺完成。以舒茶早品種基因組序列[8]作參考, 對獲得的10,802,426個SNP標記進行質控篩選, 根據最小等位基因頻率(MAF)≥0.05, 缺失率(miss)≤0.2的標準進行過濾, 保留675,245個SNP標記用于后續分析[9]。

利用過濾質控后的高質量SNP標記, 對關聯材料的群體結構(值)和親緣關系(值)進行了分析。使用軟件TASSEL 5.0的混合線性模型(mixed linear model, MLM), 以Q和K作協變量, 對橙花叔醇和芳樟醇櫻草糖苷含量在單一年份下的表型值進行全基因組關聯分析。顯著性閾值設置為:<1.48×10–6[=(10)–1,為使用標記的總數], 因此–log10()≥6.0時, 認為該標記與目的性狀顯著關聯。

1.4 等位變異分析

利用重要SNP位點對供試群體進行基因分型, 計算不同等位變異對應表型的均值, 單因素方差分析比較不同等位變異間糖苷含量的差異。利用數據分析平臺SangerBox繪制箱線圖, 展示位點的等位變異效應。

1.5 候選基因的篩選

以關聯群體連鎖不平衡的衰減距離(100 kb)為連鎖區間, 基于數據庫TeaGVD[10](http://www.teaplant. top/teagvd)、NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及舒茶早品種參考基因組[8]的注釋信息, 在顯著關聯位點上下游各100 kb的范圍內, 初步篩選候選基因。利用eggNOG-mapper (http://eggnog-mapper. embl.de/)數據庫, 對關聯基因的功能進行預測與注釋, 輔助候選基因的篩選。基于TPIA[8](http://tpia. teaplants.cn/)數據庫, 檢索候選基因在茶樹8個代表性組織(頂芽、花、果、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖)中的表達數據。取已推廣的栽培品種‘福云6號’與‘悅茗香’的春梢單芽作為樣品, 在北京百邁客生物科技有限公司(Biomarker Technologies)進行轉錄組測序, 每個樣品確保3個生物學重復。利用百邁客云分析平臺(https://international.biocloud.net/)完成2個品種間差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選, 將已獲得的GWAS候選基因在DEGs中搜索, 最終得到基因表達存在差異的GWAS候選基因。

2 結果與分析

2.1 表型描述統計分析

對3個年份下(E2018、E2019及E2020)共169份材料NPC與LPC的表型值進行統計分析發現, 該群體材料的NPC和LPC在不同年份間均存在明顯的差異(圖1)。

圖1 關聯群體在不同年份下表型值的箱線圖

對于NPC, 3個年份下的均值在0.0049～0.0144 μg mL–1之間, 表型變異范圍在0.0013～0.0508 μg mL–1之間, 變異系數在72.55%～80.08%; 對于LPC, 3個年份下的均值在0.0073～0.0139 μg mL–1之間, 表型變異范圍在0.0014～0.0500 μg mL–1之間, 變異系數在60.83%～66.71% (表1)。NPC和LPC在3個年份下的變異系數均大于60%, 說明該關聯群體在2個目標性狀中存在豐富的表型變異。NPC與LPC的峰度和偏度值在0.77～2.81之間, 均小于3, 近似正態分布, 屬于較典型的數量性狀, 符合關聯分析的基本要求。相關性分析結果表明, NPC與LPC在不同年份間均存在極顯著的正相關(＜0.01), NPC的相關系數在0.58～0.76之間, LPC的相關系數在0.59～0.78之間(圖2)。計算NPC和LPC的廣義遺傳力分別為51.29%和61.87% (表1)。以上結果表明, 這2個性狀的遺傳效應主要受基因控制, 但在一定程度上也會受到環境因素的影響。

表1 不同年份間橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量的描述統計分析

圖2 不同年份間橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量的相關性分析

A: 橙花叔醇櫻草糖苷含量(NPC); B: 芳樟醇櫻草糖苷含量(LPC)。**表示在0.01概率水平差異顯著。

A: nerolidol primeveroside content (NPC); B: linalool primeveroside content (LPC).** represents significant difference at the 0.01 probability level.

2.2 全基因組關聯分析

本研究基于混合線性模型, 利用675,245個SNP標記對NPC和LPC進行全基因組關聯分析, 篩選到顯著SNP位點共50個(表2)。在6次獨立的關聯事件中,共有28個位點被檢測到2次及其以上, 4個位點(SNP_2、SNP_3、SNP_39和SNP_40)被檢測到3次, 可將其視為穩定的高可信度標記位點, 可能含有控制茶樹NPC和LPC的保守基因。其中, NPC共檢測到39個顯著SNP, 貢獻率在21.06%～38.73%之間,值最小的位點為SNP_2, 在E2018檢測到的SNP位點有4個, E2019與E2020分別為23個和35個, 有21個被檢測到2次及其以上, 2個被檢測到3次。LPC共檢測到12個顯著SNP, 貢獻率在24.98%～39.07%之間,值最低的位點為SNP_40, 在E2018檢測到的SNP位點有3個, E2019與E2020分別為7個和10個, 有7個被檢測到2次及其以上, 1個被檢測到3次(表2)。SNP_39 (Sca.1970:1955068)與NPC和LPC均為顯著關聯, 說明該位點附近可能存在一因多效。

表2 橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷含量顯著關聯的SNP位點

(續表2)

a: 括號中的數字代表在每個鑒定年份中檢測到的SNP的–log10()值;1):2為在多個年份間檢測的最高值。NPC: 橙花叔醇櫻草糖苷含量; LPC: 芳樟醇櫻草糖苷含量。

a: the numbers in parentheses represent the –log10() values of SNP detected in each test years;1): only the highest value of2detected in multiple years was showed. NPC: nerolidol primeveroside content; LPC: linalool primeveroside content.

2.3 重要位點等位變異鑒定及效應分析

結合表型數據分析發現, NPC和LPC共有4個主效SNP位點的等位變異在3年間均可導致其表型差異呈極顯著水平(圖3)。位點SNP_2 (Sca.2168:1897613)的基因型CC可使NPC提高0.0031～0.0068 μg mL–1, 因此CC為優異等位變異; 位點SNP_3 (Sca.2542:459511)的基因型CC可使NPC提高0.0003～0.0126 μg mL–1, 因此CC為優異等位變異; 位點SNP_49 (Sca.2268: 2160703)的基因型TT可使LPC提高0.0031～0.0070 μg mL–1, 因此TT為優異等位變異。

(圖3)

NPC: 橙花叔醇櫻草糖苷含量; LPC: 芳樟醇櫻草糖苷含量。NPC: nerolidol primeveroside content; LPC: linalool primeveroside content.

此外, 與NPC和LPC共同關聯的位點SNP_39 (Sca.1970:1955068)在2個性狀中的有利等位基因是相同的, 均為AA。該等位變異可導致E2018、E2019和E2020年份的平均NPC比等位變異TT分別提高0.0086、0.0068和0.0072 μg mL–1, LPC則分別提高0.0102、0.0072和0.0074 μg mL–1, 其差異均呈極顯著水平(圖3)。該主效SNP位點對茶樹NPC和LPC均具備顯著的調控效應, 其周圍區域可能存在對茶樹NPC和LPC具有重要調控作用的基因, 是茶樹香氣品質遺傳改良的潛在重要區域。

2.4 候選基因的挖掘

以LD衰減距離100 kb[9]作為SNP位點上下游的候選區間, 基于茶樹基因組的物理位置, 在舒茶早基因組上對50個候選區間進行基因掃描。根據SNP位點注釋信息、基因表達水平以及相關研究報道, 最終篩選出59個與NPC和LPC相關的候選基因, 其中47個與NPC的變化有關, 13個與LPC的變化有關(附圖1)。這些基因主要涉及編碼萜烯合成、糖基化以及糖苷水解等多種類型, 其中還包括了一些重要的轉錄因子, 如WRKY、MYB、NAC。

在5個編碼萜烯類化合物生物合成的基因中,編碼ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase, CPS)蛋白,與編碼α-萜品醇合酶蛋白,編碼萜烯合成酶(terpene synthase, TPS)蛋白, 而編碼的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)是萜烯合成2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl- D-erythritol-4-phosphate, MEP)途徑的關鍵酶之一, 其中與在頂芽與嫩葉中的表達量較高(附圖1)。

在4個主效SNP位點中, SNP_49關聯區域的候選基因為編碼糖基轉移酶的, SNP_2的候選基因為編碼β-甘露糖苷酶的, 而SNP_3上的2個候選基因與均編碼細胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)蛋白。其中,雖在不同茶樹組織中均有表達, 但在老葉與成熟葉片中的表達量更高, 而與的表達水平則在頂芽與嫩葉中較高(附圖1)。基因位于與NPC和LPC同時關聯的標記SNP_39 (Sca.1970:1955068)的候選區間上, 編碼BAHD酰基轉移酶蛋白, 只在幼嫩葉片組織中特異性表達(附圖1), 參與植物次生代謝產物如揮發性芳香化合物合成修飾的重要過程[11]。

進一步分析發現, 59個GWAS候選基因中有26個基因的表達水平在綠茶品種‘福云6號’與烏龍茶品種‘悅茗香’的新梢單芽中存在顯著差異(表3和圖4)。其中, 8個候選基因編碼催化萜類生物合成的CYP450活性蛋白, 分別為、、、、、、和; 3個編碼糖苷水解酶活性蛋白, 分別為、和; 12個編碼糖基轉移酶活性蛋白, 分別為、、、、、、、、、、和; 2個WRKY轉錄因子和, 以及1個NAC轉錄因子。

表3 候選基因鑒定

(續表3)

NPC: 橙花叔醇櫻草糖苷含量; LPC: 芳樟醇櫻草糖苷含量。NPC: nerolidol primeveroside content; LPC: linalool primeveroside content.

圖4 轉錄組與GWAS篩選共有基因的表達水平熱圖

Fuyun 6_1、Fuyun 6_2、Fuyun 6_3: 候選基因在綠茶品種‘福云6號’單芽中的表達水平; Yuemingxiang_1、Yuemingxiang_2、Yuemingxiang_3: 候選基因在烏龍茶品種‘悅茗香’單芽中的表達水平。

Fuyun 6_1, Fuyun 6_2, Fuyun 6_3: expression level of candidate genes in buds of green tea variety ‘Fuyun 6’; Yuemingxiang_1, Yue-mingxiang_2, Yuemingxiang_3: the relative expression level of candidate genes in buds of oolong tea variety ‘Yuemingxiang’.

這26個基因與茶樹新梢中橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷合成積累相關, 并且在不同適制性茶樹品種之間顯著差異表達, 進一步說明這些基因對不同適制性茶樹品種香氣品質的形成具有重要作用, 可初步視為茶樹橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷合成積累的候選基因。基于候選基因注釋結果與前人的研究進展, 繪制出茶樹橙花叔醇與芳樟醇櫻草糖苷合成積累的調控模型示意圖(圖5)。

TFs: 轉錄因子; TPS: 萜烯合成酶; CYP450: 細胞色素P450; GHs: 糖苷水解酶; GTs: 糖基轉移酶。

TFs: transcription factors; TPS: terpene synthase; CYP450: cytochrome P450; GHs: glycoside hydrolases; GTs: glycosyltransferases.

3 討論

3.1 香氣品質性狀遺傳特征分析

本研究結果顯示, 3個年份中169份參試材料NPC和LPC性狀的平均值基本符合正態分布, 這與之前Fang等[12]、Hazra等[13]、Huang等[14]以及Yamashita等[15]對其他品質性狀的研究結果一致。基于相關性分析, 發現NPC與LPC在不同年份間均存在極顯著的正相關(<0.01), 說明目標性狀主要受遺傳因素影響, 遺傳改良前景可觀。2018年NPC和LPC均顯著高于其他年份, 但顯著關聯位點較少。

通過對表型性狀的統計及其全基因組關聯分析,發現2018年NPC和LPC均顯著高于其他兩年, 但關聯到的顯著位點卻較少。這可能是因為, 2018年春季實驗材料取樣點所在茶區遭受嚴重晚霜凍害, 促使茶樹體內NPC和LPC大量積累, 進而起到抵御寒冷的作用, 而2019年與2020年NPC和LPC表型值的區分度更好, 故檢測到的顯著位點更多。通過比較SNP在茶樹基因組上的物理位置, 可發現在不同年份間穩定遺傳的位點。如, 3年間NPC均可檢測到2個顯著的SNP位點(SNP_2和SNP_3), 而LPC也可檢測到一個顯著SNP (SNP_40)。這些結果表明, 雖然香氣品質相關性狀的遺傳基礎較為復雜, 但利用多年份鑒定的方法仍可以有效挖掘到穩定遺傳的基因位點。

前人研究表明, 香氣品質通常由多基因控制, 是受遺傳因素及環境互作等多方面影響的數量性狀[16]。全基因組關聯分析可以有效地鑒定出調控性狀的關鍵位點和候選基因, 具有較高的分辨率, 為研究復雜農藝性狀的遺傳機制提供了更多線索[17-18]。基于GWAS, 從305份草莓群體中確定了62個與揮發性香氣物質有關的信號簇, 并對其物理位置和亞基因組信息進行了基本闡述, 通過開發相對應的分子標記, 可進行輔助選擇, 達到改善草莓風味的效果[19]。對321份番茄群體中的結構變異(structural variations, SVs)進行基因分型, 基于GWAS在10號染色體上發現一個347 bp的缺失變異, 該變異與番茄果實中香葉酮的含量密切相關[20]。Wang等[21]通過多組學相結合的方式, 在萜類合成酶的基因中發現了結構變異, 并對烏龍茶高香氣特征的遺傳基礎進行了剖析。本研究利用169個茶樹自然雜交后代單株進行NPC與LPC的全基因組關聯分析, 共檢測到顯著關聯位點50個, 其中共定位SNP位點1個, 說明NPC與LPC間的調控機制可能存在較大的差異。

3.2 香氣品質相關性狀候選基因預測

基于混合線性模型、位點注釋信息及相關文獻報道, 本研究挖掘出位于SNP位點連鎖區間內最可能的候選基因, 共59個。這些基因包括糖基轉移酶蛋白、糖苷水解酶蛋白、CYP450蛋白、BAHD酰基轉移酶蛋白、MYB轉錄因子、NAC轉錄因子、WRKY轉錄因子以及參與萜類化合物生物合成途徑的關鍵酶基因。植物的香味通常與游離的揮發性物質有關, 在糖基轉移酶(glycosyltransferases, GTs)的作用下以糖苷形式在植物中貯存[22]。在葡萄中, 糖基轉移酶基因VvGT7和VvGT14編碼的蛋白酶以香葉醇、芳樟醇等萜類香氣成分做底物, 2個基因的表達水平與果實中糖苷的積累量相關[23]。糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)是茶葉的一種內源酶, 通常位于細胞質中, 能水解糖苷類香氣前體物質, 是釋放茶葉香氣物質的有效工具[24]。由此推測, 糖基轉移酶和糖苷水解酶蛋白可通過控制萜烯類糖苷的合成與水解, 從而調控游離態橙花叔醇和芳樟醇的貯存與釋放, 最終影響茶葉香氣品質。

與可可和咖啡相比, 茶樹中存在著發生了快速擴張的基因家族, 其中TPS被認為是與茶葉香氣有關的一種重要酶, 其家族成員的擴張有利于提高茶葉的香氣品質[25]。有研究發現, TPS基因在葡萄的果實中表達, 與葡萄成熟過程中香氣物質的合成積累有關[26]。擬南芥萜類合酶與細胞色素P450編碼的基因與在花器官形成以及開花期緊密共表達,可激活, 而則可產生多種萜烯類揮發性香氣物質[27]。在雞蛋花中, 基因編碼的細胞色素P450家族蛋白, 可催化多種VOCs的生物合成, 在煙草花中過表達亦可導致VOCs的大量釋放[28]。由此推測, CYP450可通過激活TPS基因的表達, 進而催化橙花叔醇與芳樟醇的生物合成與大量釋放。

目前, 越來越多的研究表明, WRKY、MYB、NAC等轉錄因子參與植物次級代謝產物萜類物質的合成代謝調控, 在植物揮發性香氣物質的研究中發揮著重要的作用。如番茄WRKY轉錄因子過表達, 可顯著提高萜烯合成MEP途徑中相關基因的表達水平, 而CRISPR/Cas9-slwrky35基因敲除的番茄果實中, MEP途徑相關基因的表達水平及其萜類物質的合成顯著降低[29]。果實成熟過程中, 芳香物質的合成會受轉錄因子NAC的調控, 且該分子機制在番茄、桃子、蘋果以及獼猴桃等多種植物中保守存在[30-32]。而MYB轉錄因子則與蝴蝶蘭[33]、蕙蘭[34]以及草莓果實[35]的香氣形成有關, 可通過激活下游合成途徑中關鍵結構基因的啟動子表達, 促進香氣物質的生物合成。由此推測, 茶樹WRKY、MYB、NAC等轉錄因子有可能通過激活VOCs合成基因啟動子元件的方式調控其合成基因的轉錄和表達。

此外, 本研究還發現了一個一因多效位點SNP_ 39, 該位點優異等位變異可顯著提高NPC與LPC, 故挖掘該位點連鎖區域的候選基因對茶樹香氣類型的改良具有重要意義。該位點候選基因編碼植物特有的BAHD酰基轉移酶, 是參與多種次生代謝物如萜類、花青素等合成修飾的重要酶類之一[36]。薔薇科水果梨的BAHD酰基轉移酶家族成員與其果實的香氣生物合成密切相關[11]; 擬南芥BAHD酰基轉移酶基因與參與萜類化合物的合成修飾[37]。由此推測,可能通過調控萜類化合物的合成修飾從而影響茶樹的香氣品質, 其具體的調控機制尚有待進一步的證實。綜上所述, 本研究挖掘到的與香氣性狀相關的候選基因, 為后續基因的精細定位、基因克隆以及香氣性狀遺傳機理的解析提供了參考。

3.3 分子標記輔助選擇在未來育種中的應用

分子標記輔助選擇能夠加速育種進程, 提高選擇效率, 是植物育種技術的有力工具[38]。Eggink等[39]基于感官評價與代謝分析, 在辣椒的種間回交群體中定位了果實的萜類化合物QTL位點, 對培育獨特風味的辣椒新品種起理論指導意義。通過全基因組關聯分析可以挖掘到與目標性狀顯著關聯的標記位點, 有助于分子標記的開發與利用。本研究所選群體的母本材料FT516與FT104是高香型的優異種質, 研究結果可應用于FT516與FT104自然雜交后代的群體改良與品種選育。對主效位點進行有利等位變異分析, 發現與NPC和LPC同時關聯的位點SNP_39 (Sca.1970: 1955068)的有利等位基因型均為AA, 且不同基因型間的表型差異達到極顯著水平, 基于該變異開發與NPC和LPC相關的分子標記, 或可達到多性狀同時改良的效果。

此外, 針對該類有利等位變異開發分子標記, 還可在實際的選育工作中進行有利等位基因的選擇或累加[40]。本研究對主效位點深入分析發現, 4個優異等位變異位點對茶樹NPC和LPC皆具有顯著調控效應, 有較大的應用前景, 可作為茶樹香氣品質遺傳改良的重要位點。例如SNP_3在不同年份間均與NPC關聯且表型貢獻率較高, 其有利等位變異的基因型為CC, 在育種實踐中可定向選擇該基因型達到提高NPC的效果。

4 結論

本研究以169個茶樹自然雜交后代單株作為關聯群體, 利用個675,245個SNP標記, 采用MLM模型針對NPC和LPC進行全基因組關聯分析, 共檢測到50個顯著關聯的SNP位點, 其中在2個及其以上環境中被穩定檢測到的有28個。針對2個目標性狀, 共鑒定出4個主效SNP位點, 其中1個為可同時調控NPC和LPC的一因多效位點。在顯著SNP位點上下游各100 kb的區間內, 篩選出最可能的候選基因共59個, 主要涉及茶樹的糖類代謝、轉錄調控、萜烯類生物合成等多個生物學過程, 其中26個基因在綠茶品種‘福云6號’與烏龍茶品種‘悅茗香’中的表達水平存在顯著差異。本研究結果可為進一步揭示茶樹NPC和LPC的遺傳機制, 以及高香型茶樹新品種選育提供參考。

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附表1 169份茶樹自然雜交后代單株名稱及其信息來源

Table S1 Names and origin information of 169 natural hybrid progenies

序號No.名稱Name母本來源Maternal parent序號No.名稱Name母本來源Maternal parent 104-1FT104(♀)8616-15FT516(♀) 204-10FT104(♀)8716-16FT516(♀) 304-11FT104(♀)8816-17FT516(♀) 404-12FT104(♀)8916-18FT516(♀) 504-13FT104(♀)9016-19FT516(♀) 604-14FT104(♀)9116-2FT516(♀) 704-15FT104(♀)9216-20FT516(♀) 804-16FT104(♀)9316-21FT516(♀) 904-17FT104(♀)9416-22FT516(♀) 1004-18FT104(♀)9516-23FT516(♀) 1104-19FT104(♀)9616-24FT516(♀) 1204-2FT104(♀)9716-25FT516(♀) 1304-20FT104(♀)9816-26FT516(♀) 1404-21FT104(♀)9916-27FT516(♀) 1504-22FT104(♀)10016-28FT516(♀) 1604-23FT104(♀)10116-29FT516(♀) 1704-24FT104(♀)10216-3FT516(♀) 1804-25FT104(♀)10316-30FT516(♀) 1904-26FT104(♀)10416-31FT516(♀) 2004-27FT104(♀)10516-32FT516(♀) 2104-28FT104(♀)10616-33FT516(♀) 2204-29FT104(♀)10716-34FT516(♀) 2304-3FT104(♀)10816-35FT516(♀) 2404-30FT104(♀)10916-36FT516(♀) 2504-31FT104(♀)11016-37FT516(♀) 2604-32FT104(♀)11116-38FT516(♀) 2704-33FT104(♀)11216-39FT516(♀) 2804-34FT104(♀)11316-4FT516(♀) 2904-35FT104(♀)11416-40FT516(♀) 3004-36FT104(♀)11516-41FT516(♀) 3104-37FT104(♀)11616-42FT516(♀) 3204-38FT104(♀)11716-43FT516(♀) 3304-39FT104(♀)11816-44FT516(♀) 3404-4FT104(♀)11916-45FT516(♀) 3504-40FT104(♀)12016-46FT516(♀) 3604-41FT104(♀)12116-47FT516(♀) 3704-42FT104(♀)12216-48FT516(♀) 3804-43FT104(♀)12316-49FT516(♀) 3904-44FT104(♀)12416-5FT516(♀) 4004-45FT104(♀)12516-50FT516(♀) 4104-46FT104(♀)12616-51FT516(♀) 4204-47FT104(♀)12716-52FT516(♀) 4304-48FT104(♀)12816-53FT516(♀) 4404-49FT104(♀)12916-54FT516(♀)

(續附表1)

序號No.名稱Name母本來源Maternal parent序號No.名稱Name母本來源Maternal parent 4504-5FT104(♀)13016-55FT516(♀) 4604-50FT104(♀)13116-56FT516(♀) 4704-51FT104(♀)13216-57FT516(♀) 4804-52FT104(♀)13316-58FT516(♀) 4904-53FT104(♀)13416-59FT516(♀) 5004-54FT104(♀)13516-6FT516(♀) 5104-55FT104(♀)13616-60FT516(♀) 5204-56FT104(♀)13716-61FT516(♀) 5304-57FT104(♀)13816-62FT516(♀) 5404-58FT104(♀)13916-63FT516(♀) 5504-59FT104(♀)14016-64FT516(♀) 5604-6FT104(♀)14116-65FT516(♀) 5704-60FT104(♀)14216-66FT516(♀) 5804-61FT104(♀)14316-67FT516(♀) 5904-62FT104(♀)14416-68FT516(♀) 6004-63FT104(♀)14516-69FT516(♀) 6104-64FT104(♀)14616-7FT516(♀) 6204-65FT104(♀)14716-70FT516(♀) 6304-66FT104(♀)14816-71FT516(♀) 6404-67FT104(♀)14916-72FT516(♀) 6504-68FT104(♀)15016-73FT516(♀) 6604-69FT104(♀)15116-74FT516(♀) 6704-7FT104(♀)15216-75FT516(♀) 6804-70FT104(♀)15316-76FT516(♀) 6904-71FT104(♀)15416-77FT516(♀) 7004-72FT104(♀)15516-78FT516(♀) 7104-73FT104(♀)15616-79FT516(♀) 7204-74FT104(♀)15716-8FT516(♀) 7304-75FT104(♀)15816-80FT516(♀) 7404-76FT104(♀)15916-81FT516(♀) 7504-77FT104(♀)16016-82FT516(♀) 7604-78FT104(♀)16116-83FT516(♀) 7704-79FT104(♀)16216-84FT516(♀) 7804-8FT104(♀)16316-85FT516(♀) 7904-9FT104(♀)16416-86FT516(♀) 8016-1FT516(♀)16516-87FT516(♀) 8116-10FT516(♀)16616-88FT516(♀) 8216-11FT516(♀)16716-89FT516(♀) 8316-12FT516(♀)16816-9FT516(♀) 8416-13FT516(♀)16916-90FT516(♀) 8516-14FT516(♀)

FT516、FT104是“十二五”國家科技支撐計劃項目課題任務“福建茶樹種質鑒定評價與新品種選育(2011BAD01B01-FJCKS)”鑒定的10個優異種質中制茶品質得分居前2位的高香型優異種質。

FT516 and FT104 are the top 2 high aroma excellent tea varieties among the 10 excellent germplasm identified in the “Fujian Tea Germplasm Identification and Evaluation and New Variety Selection (2011BAD01B01-FJCKS)” project of the National Science and Technology Support Plan for the 12th Five-Year Plan.

附圖1 GWAS候選基因在茶樹各組織中的表達

Fig. S1 Expression profiles of candidate genes in different tissues of tea by GWAS

Genome-wide association study and candidate gene prediction of nerolidol and linalool primeveroside content in tea plants

ZHANG Li-Lan1,2, YANG Jun1,2, and WANG Rang-Jian1,2,*

1Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, Fujian, China;2Fujian Branch, National Center for Tea Improvement, Fuzhou 350013, Fujian, China

Nerolidol and linalool are volatile terpene alcohols compounds widely distributed in plants. They are mainly existing in the form of primeveroside in tea plant tender shoots, and increasing their content is of great significance for improving the aroma quality of tea. The objective of this study is to reveal the genetic mechanism of nerolidol and linalool primeveroside in tea plants. 169 natural hybrid progenies were used as associated populations, and the contents of nerolidol and linalool primeveroside in tea plant tender shoots in three years were analyzed by using 675,245 single nucleotide polymorphism (SNP) markers evenly distri-buted uniformly on the chromosomes of tea genome. The results showed that the phenotypic variation of nerolidol and linalool primeveroside content were 60.83%–80.08%, and the broad-sense heritability were 51.29% and 61.87% respectively. Nerolidol and linalool primeveroside content were in normal distribution, suggesting that the traits have typical genetic characteristics of quantitative traits. A total of 50 significantly associated loci were detected by GWAS, and each locus contributed more than 20% to the variations of nerolidol and linalool primeveroside content, of which the maximum contribution rate of nerolidol primeveroside content (NPC) variation site was 38.73%, and the maximum contribution rate of linalool primeveroside content (LPC) variation site was 39.07%. Furthermore, the elite alles of the four major SNPs was identified by allelic variation effect analysis, among which one locus that could affected NPC and LPC simultaneously. Finally, a total of 59 genes were annotated in the confidence intervals of each significantly associated loci, and the most likely candidate genes were predicted according to the comparison with previous reports and gene functional annotations. These candidate genes were mainly involved in multiple biological processes such as sugar metabolism, transcriptional regulation, terpene biosynthesis. Among them, there were significant differences in the relative expression levels of 26 genes between green tea varieties and oolong tea varieties. This study provides new information for further dissecting the genetic mechanism of nerolidol and linalool primeveroside content in tea plants, and provides important gene resources for accelerating the breeding of new tea varieties with high quality.

; nerolidol primeveroside; linalool primeveroside; genome-wide association study; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2024.34124

本研究由福建省科技計劃項目(2023R1090)和福建省農業科學院科技專項(ZYTS202408)資助。

This study was supported by the Technology Plan Project of Fujian Province (2023R1090) and the Science and Technology Specific Project of Fujian Academy of Agricultural Science (ZYTS202408).

王讓劍, E-mail: wangrj@faas.cn

E-mail: lilanzhang0114@foxmail.com

2023-07-18;

2023-10-23;

20213-11-13.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231110.0856.004

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