煙草葉片響應(yīng)鎘脅迫的差異表達(dá)基因鑒定及分析

張 慧 張欣雨 袁 旭 陳偉達(dá) 楊 婷

煙草葉片響應(yīng)鎘脅迫的差異表達(dá)基因鑒定及分析

張 慧 張欣雨 袁 旭 陳偉達(dá) 楊 婷*

江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢 430056

煙草具有超富集鎘的能力, 嚴(yán)重降低煙葉品質(zhì), 影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為了闡釋煙草響應(yīng)鎘脅迫的分子機(jī)制, 本研究采集了鎘濃度為0和500 μmol L–1培養(yǎng)條件下的煙草葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。共獲得76.94 Gb有效數(shù)據(jù)(Clean data), Q30 堿基百分比均達(dá)到95.43%以上; 在鎘脅迫的煙草葉片中, 共篩選出7735個(gè)差異表達(dá)基因, 其中4833個(gè)基因表達(dá)上調(diào), 2902個(gè)基因表達(dá)下調(diào), 并通過qRT-PCR分析驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。對(duì)差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO和KEGG富集分析, GO注釋表明差異基因涉及代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、催化活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等; KEGG富集分析表明上調(diào)差異基因主要富集在氨基酸的生物合成、碳代謝、氧化磷酸化和檸檬酸循環(huán)等通路, 下調(diào)差異基因則主要富集在光合作用、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、代謝途徑和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。進(jìn)一步分析植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn), 共有8條植物激素途徑以不同的表達(dá)方式參與煙草對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。激素噴施煙草的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 葉片通過調(diào)控赤霉素、油菜素內(nèi)酯和茉莉酸途徑以應(yīng)對(duì)鎘脅迫; 擬南芥激素信號(hào)缺失突變體驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明赤霉素、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸和乙烯途徑均響應(yīng)鎘脅迫。綜上所述, 本文以轉(zhuǎn)錄組分析探究了煙草葉片響應(yīng)鎘脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 以期為提高作物抗逆性的遺傳改良提供理論依據(jù)。

普通煙; 鎘脅迫; 轉(zhuǎn)錄組分析; 調(diào)控機(jī)制; 植物激素

目前, 全球的土壤普遍受到不同程度的重金屬污染[1], 鎘(Cd)是最具毒性的重金屬, 其毒害作用使得農(nóng)業(yè)Cd污染問題備受關(guān)注[2]。Cd易在植物中積累, 并通過食物鏈進(jìn)入人體而危害人類健康, 如腎損傷、心血管疾病和癌癥等[3], 已成為威脅世界糧食生產(chǎn)安全的重要元素。在中國(guó), 隨著工業(yè)的發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快, 含Cd礦源的開采與冶煉以及含Cd工業(yè)“三廢”的排放, 造成農(nóng)田土壤Cd污染問題日益嚴(yán)重[4]。因此, 深入研究植物響應(yīng)鎘脅迫的分子機(jī)制, 可為品種的遺傳改良提供理論依據(jù), 對(duì)治理鎘污染和保障糧食安全具有重要意義。

土壤中離子態(tài)的Cd極易被植物根部吸收, 而Cd的運(yùn)輸和分布則依賴于植物體內(nèi)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)、陽(yáng)離子交換體(cation exchanger, CAX)、重金屬ATP酶(heavy metal ATPase, HMA)、天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(natural resistance- associated macrophage proteins, NRAMP)和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體(oligopeptide transporter, OPT)等[5-6]。Cd進(jìn)入植物細(xì)胞后會(huì)誘導(dǎo)活性氧過量積累, 使得蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷, 甚至造成細(xì)胞壞死[7]。此外, Cd通過金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移到地上組織后, 不僅擾亂植物水分平衡、氣孔導(dǎo)度和CO2利用率以改變?nèi)~片的光合速率, 還會(huì)阻礙葉綠素色素與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合, 致使光系統(tǒng)、光收集復(fù)合物和光合酶失去原有功能, 破壞葉綠素的合成[8]。另有研究表明, 高濃度Cd誘導(dǎo)葉綠體內(nèi)淀粉粒體積和數(shù)量的增加, 破壞葉綠體結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致體內(nèi)干物質(zhì)大量減少, 而且Cd會(huì)抑制植物種子的萌發(fā), 嚴(yán)重降低作物的生產(chǎn)力[9-11]。

為了應(yīng)對(duì)不利的生存環(huán)境, 植物已經(jīng)進(jìn)化出一系列的響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制和防御策略, 包括對(duì)干旱、高溫和金屬的適應(yīng)。如, 在缺乏鐵元素的情況下, 水稻可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)赤霉素的含量減緩葉片鐵缺乏的癥狀[12]。鹽生植物對(duì)高鹽土壤的適應(yīng)則是通過脅迫感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑改變來(lái)實(shí)現(xiàn)[13]。油菜和小麥等農(nóng)作物為了應(yīng)對(duì)干旱脅迫, 通過促發(fā)糖酵解到醋酸合成的動(dòng)態(tài)代謝能量轉(zhuǎn)換以啟動(dòng)茉莉酸信號(hào)通路, 從而提高植物耐旱性[14]。為了減緩重金屬Cd的毒害作用, 植物利用激素合成通路和抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行抵御。擬南芥通過調(diào)節(jié)乙烯含量從而降低植物體內(nèi)超氧陰離子的積累, 以改善鎘脅迫下根系的發(fā)育[15], 植物體內(nèi)脯氨酸的積累可促進(jìn)糖和有機(jī)酸的合成, 減少氧化損傷并調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓, 維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[16]。龍葵通過誘導(dǎo)生長(zhǎng)素在根部的重新分布, 調(diào)控一氧化氮的積累量, 從而緩解鎘毒性[17]。大量報(bào)道關(guān)注植物根部對(duì)重金屬Cd的響應(yīng), 但對(duì)葉片響應(yīng)Cd脅迫的調(diào)控機(jī)制卻缺乏深入研究。

煙草(L.)作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物, 極易超富集Cd, 且煙草Cd含量的50%以上積累在葉片[18-19], 嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)。越來(lái)越多的研究表明, 吸煙已成為煙民身體中重金屬Cd的主要來(lái)源之一[20-21], 而非吸煙者則可能通過二手煙加劇Cd的吸入[22-23], 但關(guān)于煙草響應(yīng)鎘脅迫的分子機(jī)制尚待解析。因此, 本文以烤煙作為研究材料, 利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Cd脅迫和正常生長(zhǎng)的煙草葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq), 以獲得差異基因的功能注釋。此外, 通過外施激素和激素信號(hào)突變體明確激素對(duì)Cd的調(diào)控, 旨在揭示煙草葉片響應(yīng)Cd脅迫的分子機(jī)制, 進(jìn)一步豐富煙草對(duì)逆境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 為提高作物抗逆性的遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的煙草栽培品種NC89 (L. cv. NC89)。野生型擬南芥(, Col-0)和擬南芥油菜素內(nèi)酯信號(hào)缺失突變體由本實(shí)驗(yàn)室保存, 擬南芥其他激素信號(hào)缺失突變體、、、和由廣西民族大學(xué)豐景老師提供。

1.2 材料處理及生理參數(shù)的測(cè)定

煙草NC89種植在溫室, 溫室培養(yǎng)條件為相對(duì)濕度75%、光周期12 h光照/12 h黑暗、溫度24℃ ± 2℃。首先, 將煙草種子用水浸泡1 d, 隨后均勻播撒在營(yíng)養(yǎng)土中萌發(fā)生長(zhǎng)12～14 d, 將萌發(fā)的材料移栽至穴盤繼續(xù)培養(yǎng)13～17 d, 最后用清水洗凈幼苗的根部,并用海綿夾住下胚軸基部, 使其固定在KT板上進(jìn)行水培預(yù)培養(yǎng)(5 d)。最后, 將煙苗放置在Cd濃度為0 (對(duì)照, CK)和500 μmol L–1(Cd處理組)的1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行脅迫處理, 脅迫1周后的煙草用標(biāo)尺測(cè)量其葉長(zhǎng)、葉寬、根長(zhǎng), 并稱量地上部和根部的鮮重。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因文庫(kù)建立

脅迫1周后采集對(duì)照組(CK)和Cd處理組(Cd)同一葉位的2片煙草葉片, 立刻用液氮速凍研磨, 使用干冰運(yùn)輸至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每一個(gè)樣品由10棵煙草的葉肉組織混合組成, 并設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品(CK-1、CK-2、CK-3和Cd-1、Cd-2、Cd-3)。提取樣本的總RNA后, 采用Illumina Truseq RNA sample prep Kit方法將富集得到的RNA反轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA, 修復(fù)cDNA雙末端, 加上接頭, PCR擴(kuò)增后構(gòu)建文庫(kù)。使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢, 合格后利用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.4 差異基因的篩選和功能注釋

將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控, 去除接頭序列和低質(zhì)量序列, 以獲得高質(zhì)量的序列(Clean data)。利用HISAT2軟件, 并以煙草栽培品種K326的核酸序列為參考基因組對(duì)Clean data進(jìn)行比對(duì)分析[24]。利用FPKM法消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響, 將調(diào)整后的值(FDR < 0.05)和|log2(FC)|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn), 使用EdgeR軟件獲取Cd處理組與CK對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)。為了研究差異基因的生物學(xué)功能, 使用Goatools軟件進(jìn)行基因集富集。同時(shí)利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, 京都基因與基因組百科全書)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析, 以鑒定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或調(diào)控通路。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因的表達(dá)

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性, 隨機(jī)選擇7個(gè)差異基因(, NADH氧化酶基因;, 脂氧合酶基因;, AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因;, WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因;, 天線蛋白基因;, 核糖體蛋白基因;, 抗壞血酸過氧化物酶基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR), 并選用煙草轉(zhuǎn)錄延伸因子(,)作為內(nèi)參基因, 通過Primer Premier 5設(shè)計(jì)基因的特異性引物(表1)。使用Eastep Super總RNA提取試劑盒提取葉片RNA, 隨后采用Invitrogen SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)試劑盒(YESEN公司), 試驗(yàn)過程參照試劑盒的操作說(shuō)明。qRT-PCR的反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性20 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸30 s, 40個(gè)擴(kuò)增循環(huán); 在延伸階段采集熒光, 并插入溶解曲線。本試驗(yàn)包含3次生物學(xué)重復(fù), 以2-ΔΔCT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析[25]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控

將擬南芥種子(WT、、、、、和)用含1% Triton的75%乙醇溶液消毒20 min (旋轉(zhuǎn)), 在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)水乙醇清洗3次, 將其放在濾紙上晾干后, 均勻撒播在Cd濃度為0 (對(duì)照組)和50 μmol L–1的1/2 MS培養(yǎng)基中。隨后, 培養(yǎng)基平板置于黑暗條件下4℃培養(yǎng)3 d, 再將平板移至培養(yǎng)箱(溫度22～24℃, 光暗周期16 h光照/8 h黑暗, 相對(duì)濕度70%)生長(zhǎng), 觀察表型并測(cè)定生理參數(shù)。此外, 利用外源激素6-BA (細(xì)胞分裂素的一種, 40 μmol L–1)、BL (活性最高的一種BR, 10 μmol L–1)、GA3(赤霉素的一種, 100 μmol L–1)、MeJA (茉莉酸甲酯, 200 μmol L–1)噴施煙草, 水(Water)作為對(duì)照, 2 d后將煙草移至Cd濃度為0和500 μmol L–1的1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng), 觀察表型并測(cè)量相關(guān)生理參數(shù), 以確定激素響應(yīng)Cd脅迫的機(jī)制。

1.7 數(shù)據(jù)方差分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)處理均包含至少3組生物學(xué)重復(fù)。利用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素或雙因素方差分析并作圖,< 0.05表示差異顯著,< 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd抑制了煙草的生長(zhǎng)

為探究Cd脅迫對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響, 選取野生型煙草, 進(jìn)行Cd脅迫處理。如圖1-A所示, 在正常條件下(CK), 煙草葉片和根系均呈現(xiàn)生長(zhǎng)茂盛的情況, 葉片翠綠, 根系發(fā)達(dá)。但在Cd脅迫條件下(Cd), 煙草的生長(zhǎng)受到顯著的抑制, 葉片葉綠素降解明顯、黃化程度增加、葉面積減小, 而根系發(fā)育不良, 呈現(xiàn)為褐化狀態(tài)。進(jìn)一步對(duì)煙草葉寬、葉長(zhǎng)和根重、根長(zhǎng)以及地上部分的生物量進(jìn)行了測(cè)量, 結(jié)果表明Cd導(dǎo)致煙草葉片的長(zhǎng)度、寬度以及根重、根長(zhǎng)和地上部分的重量都受到顯著的抑制(圖1-B), 表明Cd抑制了煙草的生長(zhǎng)。

2.2 獲得高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

為了闡明煙草響應(yīng)鎘脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 我們采集生長(zhǎng)環(huán)境Cd濃度為0 (CK)和500 μmol L-1(Cd)的煙草葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示, 每個(gè)樣本的測(cè)序原始數(shù)據(jù)分別從78,412,514到78,412,514不等。經(jīng)過質(zhì)量過濾后, 每個(gè)樣本產(chǎn)生77,125,276～ 114,117,568干凈讀長(zhǎng), 有效堿基為11.09～16.28 Gb, 共獲得76.94 Gb有效數(shù)據(jù)(Clean data), 平均GC含量為46.38%, 有效序列的Q30均超過95.43% (表2)。采用Pearson方法進(jìn)行樣品間相關(guān)性檢驗(yàn), 結(jié)果表明同組生物學(xué)重復(fù)樣品間的表達(dá)模式高度一致, 相關(guān)系數(shù)均在0.98以上(圖2-A)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明了本次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的高質(zhì)量, 可用于后續(xù)分析。

為了確定對(duì)照組(CK)和實(shí)驗(yàn)組(Cd)之間基因表達(dá)的差異性, 根據(jù)EdgeR分析結(jié)果, 以<0.05和|log2FC|≥1作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。與對(duì)照組相比, 實(shí)驗(yàn)組共篩選出7735個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs), 其中有4833個(gè)基因(占總DEGs的62.5%)在Cd脅迫環(huán)境中的表達(dá)上調(diào), 2902個(gè)基因(占總DEGs的37.5%)在Cd脅迫環(huán)境中的表達(dá)下調(diào)(圖2-B)。

圖1 鎘抑制了煙草的生長(zhǎng)

A: Cd對(duì)煙草表型的影響; B: 定量分析煙草的生理參數(shù)。誤差線表示平均值?±?標(biāo)準(zhǔn)差。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異極顯著; 葉長(zhǎng)、葉寬和根長(zhǎng)的單位為cm; 鮮重單位為g。

A: phenotypic changes of tobacco under Cd stress conditions; B: measurements of physiological parameter. The error line represents the mean ± standard deviation; *:< 0.05; **:< 0.01. The unit of leaf length, leaf width, and root length is cm; The unit of fresh weight is g. CK: 0 μmol L–1Cd; Cd: 500 μmol L–1Cd.

表2 樣品測(cè)序輸出數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

圖2 樣品相關(guān)性及差異基因分析

A: 樣品相關(guān)性分析; B: 差異表達(dá)基因火山圖。

A: sample correlation analysis; B: volcano map of differentially expressed genes.

2.3 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性, 本研究以煙草作為內(nèi)參基因, 隨機(jī)篩選了在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有顯著變化的7個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。RNA-seq測(cè)序結(jié)果表明, Cd誘導(dǎo)了基因、、和的表達(dá), 但是會(huì)抑制基因、、的轉(zhuǎn)錄(表3)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)高度一致, 與對(duì)照組相比, Cd處理使得、、和分別上調(diào)了1.85、5.15、26.40, 3.47倍, 卻使、、分別下調(diào)至0.81、0.71和0.62 (圖3), 表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠。

表3 轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)基因

圖3 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

誤差線表示平均值?±?標(biāo)準(zhǔn)差。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異極顯著。

The error line represents the mean ± standard deviation; *:< 0.05; **:< 0.01.

2.4 鎘誘導(dǎo)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的差異表達(dá)

研究表明, 植物根部吸收的Cd通過金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移到地上組織, 使得作物葉片變黃, 生長(zhǎng)出現(xiàn)遲緩現(xiàn)象[26]。為了探究煙草葉片對(duì)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)的響應(yīng)機(jī)制, 本文對(duì)鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。在Cd脅迫條件下, 負(fù)責(zé)Cd長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)慕饘俎D(zhuǎn)運(yùn)蛋白和的基因表達(dá)量大部分上調(diào), 少部分基因表達(dá)量下調(diào); 負(fù)責(zé)將Cd轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡儲(chǔ)存以減緩植物毒害作用的和基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá); 此外, 為了維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài), 細(xì)胞質(zhì)膜上的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)將過量的Cd運(yùn)送至細(xì)胞外, 涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的表達(dá)水平多數(shù)提高, 個(gè)別表達(dá)水平受到抑制; 提高植物Cd抗性的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)量均上調(diào)(表4)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明, 鎘脅迫誘導(dǎo)葉片金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的差異表達(dá)。

表4 煙草葉片中鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的差異表達(dá)

(續(xù)表4)

2.5 差異表達(dá)基因GO功能注釋

為進(jìn)一步探究煙草對(duì)Cd的響應(yīng)過程, 本研究利用Goatools軟件對(duì)所有DEGs進(jìn)行GO分析, 發(fā)現(xiàn)共有2459個(gè)上調(diào)差異基因和1443個(gè)下調(diào)差異基因獲得了注釋, 根據(jù)基因數(shù)目篩選出36條最顯著的條目(圖4)。結(jié)果表明, Cd處理后煙草DEGs可分為3個(gè)主要功能類別, 分別是生物學(xué)過程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF), 特別是在生物學(xué)過程中高度集中。在生物學(xué)過程中, 差異基因主要分布在生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、多細(xì)胞生物過程(multicellular organismal process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)等條目。細(xì)胞組分功能模塊基因數(shù)目最多的條目為細(xì)胞內(nèi)(intracellular)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)體(cellular anatomical entity)。分子功能注釋的基因大部分集中在結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(transcription regulator activity)等條目。

圖4 差異表達(dá)基因 GO功能注釋

圖中左側(cè)縱坐標(biāo)表示注釋到某一GO term的基因數(shù)占所有GO注釋基因總數(shù)的比例, 右側(cè)縱坐標(biāo)表示注釋到某一GO term的基因個(gè)數(shù), 橫坐標(biāo)表示GO的每一詳細(xì)分類。

The left vertical axis in the figure represents the proportion of genes annotated to a certain GO term to the total number of genes annotated with GO, the right vertical axis represents the number of genes annotated to a certain GO term, and the horizontal axis represents each detailed classification of GO.

2.6 差異基因KEGG富集分析

根據(jù)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)開展通路富集分析, 通過解析差異表達(dá)基因?qū)Υx通路的影響, 進(jìn)一步揭示煙草響應(yīng)Cd脅迫的生理機(jī)制。Cd脅迫下煙草的差異基因成功地被富集到210條KEGG通路上, 其中共有4400個(gè)基因上調(diào), 1906個(gè)基因下調(diào)。上調(diào)基因富集途徑主要與氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、β-丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)等途徑相關(guān)。下調(diào)基因則主要富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、代謝途徑(metabolic pathways)、氰胺酸代謝(cyanoamino acid metabolism)、光合生物中的碳固定(carbon fixation in photosynthetic organisms)、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化(pentose and glucuronate interconversions)、光合作用(photosynthesis)等通路(圖5)。

2.7 植物激素信號(hào)通路的研究

植物激素信號(hào)分子廣泛存在于在生命體中, 不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控, 而且在幫助植物適應(yīng)不利的生存環(huán)境等方面起著至關(guān)重要的作用。由圖6可知, KEGG富集分析表明大量差異基因被富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 共有8種不同的植物激素信號(hào)通路參與煙草對(duì)Cd脅迫的響應(yīng), 包括生長(zhǎng)素(Auxin)、細(xì)胞分裂素(CTK)、乙烯(ET)、油菜素內(nèi)酯(BR)、茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)。Auxin與CTK主要調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)與發(fā)育, 在響應(yīng)Cd脅迫中, Auxin和CTK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的所有基因幾乎都被差異富集, 導(dǎo)致了煙草生長(zhǎng)狀態(tài)的差異。植物生物脅迫抗性激素JA和SA信號(hào)通路的也被差異富集。在調(diào)節(jié)植物非生物脅迫的ABA信號(hào)通路中, Cd 誘導(dǎo)基因的表達(dá), 抑制了和基因的表達(dá)。在GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,基因的表達(dá)被誘導(dǎo)了。ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因表達(dá)均上調(diào), 而BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因則主要是被下調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果表明激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與煙草對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)。

(圖5)

A: 上調(diào)差異基因前30條途徑的KEGG富集散點(diǎn)圖; B: 下調(diào)差異基因前30條途徑的KEGG富集散點(diǎn)圖。Y軸表示富集的KEGG途徑, X軸表示富集到KEGG通路DEG數(shù)量與DEGs總數(shù)的比率。

A: KEGG pathway up-regulated gene top 30 enrichment scatter plot; B: KEGG pathway down-regulated gene top 30 enrichment scatter plot. The Y-axis represents the enriched KEGG pathways, while the X-axis represents ratio of enriched DEGs in KEGG pathways to the total amount of DEGs.

2.8 植物激素通路響應(yīng)鎘脅迫

為了具體闡述植物激素對(duì)Cd脅迫的調(diào)控機(jī)制, 本研究使用外源激素噴施烤煙地上部分, 并利用擬南芥不同激素信號(hào)響應(yīng)途徑的缺失突變體進(jìn)行鎘暴露試驗(yàn), 以探究植物激素是否參與煙草對(duì)Cd的響應(yīng)。在植物噴施水(Water)的對(duì)照組中, Cd明顯抑制了煙草的生長(zhǎng); 在噴施6-BA (細(xì)胞分裂素)的處理組中, Cd仍然會(huì)抑制植物的生長(zhǎng), 并且在Cd暴露條件下, 6-BA處理組煙草地上部分的重量與對(duì)照組噴施水(Water)的煙草重量無(wú)明顯差別(圖-7A, B)。在噴施GA3(赤霉素)、BL (油菜素內(nèi)酯)和MeJA (茉莉酸甲酯)煙草的處理組中, 地上部分鮮重在正常生長(zhǎng)環(huán)境(CK)與Cd脅迫(Cd)條件下無(wú)顯著變化, 而在Cd條件下, 噴施GA3、BL和MeJA煙草的鮮重均明顯高于噴施水(Water)的煙草重量(圖-7A, B), 說(shuō)明赤霉素、油菜素內(nèi)酯和茉莉酸參與煙草對(duì)Cd的響應(yīng)。在擬南芥材料中, 與 CK相比, 在Cd脅迫條件下赤霉素缺失突變體()、乙烯缺失突變體()和油菜素內(nèi)酯缺失突變體()的鮮重和根長(zhǎng)都沒有發(fā)生顯著變化(圖7-C～E), 而野生型擬南芥(WT)、生長(zhǎng)素突變體()、水楊酸突變體()和脫落酸突變體()的鮮重和根長(zhǎng)都受到了顯著抑制, 說(shuō)明只有赤霉素、乙烯和油菜素內(nèi)酯途徑參與植物對(duì)Cd的響應(yīng)。綜上所述, 赤霉素、乙烯、油菜素內(nèi)酯和茉莉酸參與植物對(duì)Cd脅迫的調(diào)控。

3 討論

Cd是一種非必需且毒性很強(qiáng)的重金屬元素, 可通過與膜蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合進(jìn)入植物或動(dòng)物細(xì)胞[27-28]。Cd進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自由基引發(fā)活性氧的過量積累, 導(dǎo)致細(xì)胞器的功能紊亂和細(xì)胞氧化損傷[29]。當(dāng)煙草體內(nèi)的重金屬Cd累積到一定濃度后, 會(huì)出現(xiàn)一系列復(fù)雜的生理生化與分子水平的響應(yīng), 其直觀表現(xiàn)為: 植株生長(zhǎng)遲緩、葉片失綠萎蔫、根系壞死(圖1), 但是關(guān)于煙草對(duì)鎘的響應(yīng)機(jī)制還不清楚。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序具有檢測(cè)范圍廣、數(shù)據(jù)量大的特點(diǎn), 可提供高分辨率的基因表達(dá)譜來(lái)分析差異基因表達(dá)模式[30]。近年來(lái), 有研究利用RNA-Seq獲得煙草在冷脅迫和病蟲害侵染過程中的差異基因表達(dá)矩陣, 揭示了植物對(duì)脅迫的應(yīng)答機(jī)制[31-32]。因此, 本研究首次利用RNA-Seq技術(shù)篩選烤煙葉片響應(yīng)鎘脅迫的差異基因, 并進(jìn)行功能注釋, 獲得了特異性調(diào)控?zé)煵莸挚规k脅迫的激素代謝途徑, 最后利用植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體進(jìn)行驗(yàn)證, 闡述了煙草響應(yīng)鎘脅迫的分子機(jī)制。本文的研究結(jié)果不僅豐富了煙草對(duì)重金屬響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 而且還為提高作物抗性的遺傳改良提供了理論依據(jù)。

圖6 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖

圖中底色為紅色、黃色、藍(lán)色的基因均屬于差異表達(dá)基因, 其中紅色代表基因上調(diào)表達(dá), 黃色代表基因下調(diào)表達(dá), 藍(lán)色代表同時(shí)存在上調(diào)表達(dá)基因和下調(diào)表達(dá)基因。

The colors in the figure represent differentially significant genes. Red shows genes that are significantly up-regulated. Yellow shows genes that are significantly down-regulated. Blue indicates that there are both significantly up-regulated and down-regulated genes.

(圖7)

A: 不同激素對(duì)煙草表型的影響; B: 煙草地上部分的鮮重; C: 鎘對(duì)不同擬南芥突變體表型的影響; D: 擬南芥突變體根長(zhǎng)的變化; E: 擬南芥鮮重的變化。根長(zhǎng)的單位為cm; 擬南芥鮮重單位為mg; 煙草鮮重單位為g。誤差線表示平均值?±?標(biāo)準(zhǔn)差。*表示< 0.05水平差異顯著; **表示< 0.01水平差異極顯著。

A: the effects of hormone on tobacco phenotype under Cd stress conditions; B: the quantitative analysis of shoot biomass; C: the phenotypes ofmutants and wild-type plants under Cd stress conditions; D: the determination ofroot length; E: determination of Arabidopsis fresh weight. The error line represents the mean ± standard deviation; *:< 0.05; **:< 0.01. The unit of root length is cm; The fresh weight unit ofis mg, and the fresh weight unit of tobacco is g.

煙草葉片RNA-Seq數(shù)據(jù)表明鎘脅迫誘導(dǎo)植物大量基因的差異表達(dá)。金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控植物體內(nèi)Cd的運(yùn)輸與儲(chǔ)存, 為生物體維持重金屬元素的穩(wěn)態(tài)平衡做出重要貢獻(xiàn)[6]。本文發(fā)現(xiàn)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的表達(dá)水平差異顯著, 故煙草葉片出現(xiàn)了Cd的超富集 (表4)。研究表明, Cd會(huì)影響葉綠素的合成, 抑制光合速率, 減少干物質(zhì)的儲(chǔ)存[9-10,33]。本文通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析, 發(fā)現(xiàn)大量下調(diào)表達(dá)的差異基因富集在光合作用通路和碳固定通路中(圖4), 說(shuō)明Cd通過干擾光合作用, 影響光合生物的碳固定, 從而導(dǎo)致葉片面積減小, 煙草生物量降低。此外, 脂肪酸參與調(diào)節(jié)多種生命活動(dòng)和逆境脅迫應(yīng)答過程, 不僅可為植物儲(chǔ)備能量, 還能為細(xì)胞膜形成屏障[34]。植物鎘暴露五分鐘后, 其根部大量的差異基因富集在脂質(zhì)生物合成過程和脂肪酸生物合成過程[35]。在本研究中, 鎘脅迫條件下, 煙草葉片上調(diào)的差異表達(dá)基因富集在脂肪酸降解途徑, 說(shuō)明脂肪酸代謝過程參與了煙草對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)。此外, 有研究表明, 桂花樹可通過大幅度降低體內(nèi)脂肪酸含量以應(yīng)對(duì)環(huán)境的高溫脅迫[36]。因此, 當(dāng)煙草響應(yīng)Cd對(duì)植物光合作用的毒害作用時(shí), 葉片可能通過促進(jìn)脂肪酸的分解為生命代謝過程提供能量, 從而增強(qiáng)對(duì)重金屬的抗性。

為了適應(yīng)不利的生存環(huán)境, 植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中已獲得了一套復(fù)雜精細(xì)的調(diào)控機(jī)制以提高抗性。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn), 氨基酸的生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成等與植物抗性相關(guān)的通路均參與煙草對(duì)Cd的響應(yīng)。植物激素在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)生物脅迫及非生物脅迫的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[37-38]。茉莉酸提高了草莓對(duì)水澇脅迫的抗性, 脫落酸通過調(diào)控氣孔開關(guān), 增強(qiáng)植物抵抗干旱脅迫的能力[39]。Kaya等[40]證實(shí), 植物也可通過調(diào)控赤霉素來(lái)緩解鹽堿脅迫帶來(lái)的傷害。本文發(fā)現(xiàn)煙草葉片共有八種植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路響應(yīng)了Cd脅迫, 并且每種激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都富集了大量的差異表達(dá)基因, 說(shuō)明植物激素信號(hào)通路在煙草抵抗Cd脅迫的響應(yīng)中扮演重要角色。

近年來(lái), 越來(lái)越多的研究表明激素可以緩解重金屬對(duì)植物傷害, 外源生長(zhǎng)素促進(jìn)了芥菜在砷脅迫條件下的生長(zhǎng)[41-42], 在本研究中, 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺失突變體和外源激素噴施的煙草實(shí)驗(yàn)表明乙烯、油菜素內(nèi)酯、赤霉素和茉莉酸四種激素參與煙草對(duì)鎘脅迫的調(diào)控。在蠶豆響應(yīng)鎘脅迫時(shí), 茉莉酸通過改善滲透壓和抗氧化酶活性提高植物抗性。油菜素內(nèi)酯和乙烯可以提高植物抗氧化劑的表達(dá)水平以降低Cd的毒害作用[43-44]。赤霉素可以抑制Cd吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá), 增強(qiáng)生菜對(duì)鎘的抗性[45]。而脫落酸通過調(diào)控Cd脅迫相關(guān)基因的表達(dá), 促進(jìn)Cd在景天植物的積累[46]。表明乙烯、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸和赤霉素廣泛參與植物對(duì)Cd脅迫的調(diào)控機(jī)制, 而脫落酸則根據(jù)植物物種不同, 選擇性參與植物對(duì)Cd的響應(yīng), 生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、水楊酸不參與煙草葉片對(duì)Cd脅迫的調(diào)控作用, 但是否參與其他作物對(duì)Cd的響應(yīng)仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析了煙草葉片響應(yīng)Cd脅迫的差異表達(dá)基因, 發(fā)現(xiàn) Cd誘導(dǎo)煙草碳水化合物代謝途徑、氧化磷酸化途徑相關(guān)基因的表達(dá), 煙草通過調(diào)節(jié)抗氧化物質(zhì)代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑以抵抗重金屬Cd的毒害作用。激素信號(hào)缺失突變體和外施植物激素證明了煙草主要依賴乙烯、赤霉素、油菜素內(nèi)酯和茉莉酸調(diào)控對(duì)Cd脅迫的適應(yīng)機(jī)制。本研究闡述了煙草葉片響應(yīng)Cd脅迫的調(diào)控機(jī)制, 可為提高作物抗逆性的遺傳改良提供理論依據(jù)。

[1] 劉娟, 張乃明, 于泓, 張靖宇, 李芳艷, 于暢, 杜紅蝶. 重金屬污染對(duì)水稻土微生物及酶活性影響研究進(jìn)展. 土壤, 2021, 53: 1152–1159. Liu J, Zhang L M, Yu H, Zhang J Y, Li F Y, Yu C, Du H D. Effects of heavy metal pollution on microorganism and enzyme activity in paddy soil: a review., 2021, 53: 1152–1159 (in Chinese with English abstract).

[2] 蘇蕓蕓. 乙酰膽堿調(diào)節(jié)煙草Cd脅迫響應(yīng)的生理機(jī)制. 西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文, 陜西楊凌, 2021. Su Y Y. The Physiological Response Mechanism of Acetylcholine Regulating Cadmium Stress in Tobacco. PhD Dissertation of Northwest A＆F University, Yangling, Shaanxi, China, 2021 (in Chinese with English abstract).

[3] J?rup L, Akesson A. Current status of cadmium as an environmental health problem., 2009, 238: 201–208.

[4] Shifaw E. Review of heavy metals pollution in China in agricultural and urban soils., 2018, 8: 180607.

[5] Li D, He T, Saleem M, He G. Metalloprotein-specific or critical amino acid residues: perspectives on plant-precise detoxification and recognition mechanisms under cadmium stress., 2022, 23: 1734.

[6] Yang Z, Yang F, Liu J L, Wu H T, Yang H, Shi Y, Jie L, Zhang Y F, Luo Y R, Chen K M. Heavy metal transporters: functional mechanisms regulation and application in phytoremediation., 2022, 809: 151099.

[7] Haider F U, Cai L Q, Coulter J A, Cheema S A, Wu J, Zhang R Z, Ma W J, Farooq M. Cadmium toxicity in plants: Impacts and remediation strategies., 2021, 211: 111887.

[8] de Araújo R P, de Almeida A A F, Pereira L S, Mangabeira P A O, Souza J O, Pirovani C P, Ahnert D, Baligar V C. Photosynthetic, antioxidative, molecular and ultrastructural responses of young cacao plants to Cd toxicity in the soil., 2017, 144: 148–157.

[9] Dong X X, Yang F, Yang S P, Yan C Z. Subcellular distribution and tolerance of cadmium inL., 2019, 185: 109692.

[10] Guo L, Chen A, He N, Yang D, Liu M D. Exogenous silicon alleviates cadmium toxicity in rice seedlings in relation to Cd distribution and ultrastructure changes., 2018, 18: 1691–1700.

[11] Raza A, Habib M, Kakavand S N, Zahid Z, Zahra N, Sharif R. Hasanuzzaman M. Phytoremediation of cadmium: physiological, biochemical, and molecular mechanisms., 2020, 9: 177.

[12] Wang B, Wei H, Xue Z, Zhang W H. Gibberellins regulate iron deficiency response by influencing iron transport and translocation in rice seedlings ()., 2017, 119: 945–956.

[13] Kumari A, Das P, Parida A K, Agarwal P K. Proteomics, metabolomics, and ionomics perspectives of salinity tolerance in halophytes., 2015, 6: 537.

[14] Kim J M, To T K, Matsui A, Tanoi K, Kobayashi N I, Matsuda F, Habu Y, Ogawa D, Sakamoto T, Matsunaga S, Bashir1 K, Rasheed S, Ando M, Takeda H, Kawaura K, Kusano M, Fukushima A, Endo T A, Kuromori T, Ishida J, Morosawa T, Tanaka M, Torii C, Takebayashi Y, Sakakibara H, Ogihara Y, Saito K, Shinozaki K, Devoto A, Seki M. Acetate-mediated novel survival strategy against drought in plants., 2017, 3: 17097.

[15] Abozeid A, Ying Z, Lin Y, Liu J, Zhang Z, Tang Z. Ethylene improves root system development under cadmium stress by modulating superoxide anion concentration in., 2017, 8: 253.

[16] Borgo L, Rabêlo F H S, Budzinski I G F, Cataldi T R, Ramires T G, Schaker P D C, Ribas A F, Labate C A, Lavres J, Cuypers A, Azevedo R A. Proline exogenously supplied or endogenously overproduced induces different nutritional, metabolic, and antioxidative responses in transgenic tobacco exposed to cadmium., 2022, 41: 2846–2868.

[17] Xu J, Wang W Y, Sun J H, Zhang Y, Ge Q, Du L G, Yin H X, Liu X J. Involvement of auxin and nitric oxide in plant Cd-stress responses., 2011, 346: 107–119.

[18] Rosén K, Eriksson J, Vinichuk M. Uptake and translocation of 109Cd and stable Cd within tobacco plants ()., 2012, 113: 16–20.

[19] Liu H W, Wang H Y, Ma Y B, Wang H H, Shi Y. Role of transpiration and metabolism in translocation and accumulation of cadmium in tobacco plants (L.)., 2016, 144: 1960–1965.

[20] Bush P G, Mayhew T M, Abramovich D R, Aggett P J, Burke M D, Page K R. A quantitative study on the effects of maternal smoking on placental morphology and cadmium concentration., 2000, 21: 247–256.

[21] Li H Q, Wallin M, Barregard L, Sallsten G, Lundh T, Ohlsson C, Mellstr?m D, Andersson E M. Smoking-induced risk of osteoporosis is partly mediated by cadmium from tobacco smoke: the MrOS Sweden Study., 2020, 35: 1424–1429.

[22] Regassa G, Chandravanshi B S. Levels of heavy metals in the raw and processed Ethiopian tobacco leaves., 2016, 5: 232.

[23] Wang X K, Shi M, Hao P F, Zheng W T, Cao F B. Alleviation of cadmium toxicity by potassium supplementation involves various physiological and biochemical features inL., 2017, 39: 132.

[24] Edwards K D, Fernandez-Pozo N, Drake-Stowe K, Humphry M, Evans A D, Bombarely A, Allen F, Hurst R, White B, Kernodle S P, Bromley J R, Sanchez-Tamburrino J P, Lewis R S, Mueller L A. A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency., 2017, 18: 448.

[25] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCTmethod.s, 2001, 25: 402–408.

[26] Eissa M A. Phytoextraction mechanism of Cd by Atriplex lentiform is using some mobilizing agents., 2017, 108: 220–226.

[27] Hasan M K, Ahammed G J, Yin L L, Shi K, Xia X J, Zhou Y H, Zhou J. Melatonin mitigates cadmium phytotoxicity through modulation of phytochelatins biosynthesis, vacuolar sequestration, and antioxidant potential inL., 2015, 6: 601.

[28] Cao Z W, Fang Y L, Lu Y H, Tan D X, Du C H, Li Y M, Ma Q L, Yu J M, Chen M Y, Zhou C, Pei L P, Zhang L, Ran H Y, He M D, Yu Z P, Zhou Z. Melatonin alleviates cadmium induced liver injury by inhibiting the TXNIP-NLRP3 inflammasome., 2017, 62: 12389.

[29] Khanna K, Kohli S K, Ohri P, Bhardwaj R, Ahmad P. Agroecotoxicological aspect of Cd in soil-plant system: uptake, translocation and amelioration strategies., 2022, 29: 30908–30934.

[30] Soniya E V, Srinivasan A, Menon A, Kattupalli D. Transcriptomics in Response of Biotic Stress in Plants. Academic Press, San Diego, CA, USA, 2023. pp 285–303.

[31] Ghorbel M, Brini F, Sharma A, Landi M. Role of jasmonic acid in plants: the molecular point of view., 2021, 40: 1471–1494.

[32] Abozeid A, Ying Z J, Lin Y C, Liu J , Zhang Z H, Tang Z H. Ethylene improves root system development under cadmium stress by modulating superoxide anion concentration in., 2017, 8: 253.

[33] Gallego S M, Pena L B, Barcia R A, Azpilicueta C E, Iannone M F, Rosales E P, Zawoznik M S, Groppa M D, Benavides M P. Unravelling cadmium toxicity and tolerance in plants: insight into regulatory mechanisms., 2012, 83: 33–46.

[34] De Carvalho C C C R, Caramujo M J. The various roles of fatty acids., 2018, 23: 2583.

[35] Li C Y, Hong Y, Sun J H, Wang G P, Zhou H N, Xu L T, Wang L, Xu G Y. Temporal transcriptome analysis reveals several key pathways involve in cadmium stress response inL., 2023, 14: 1143349.

[36] 王俊宇, 王曉東, 馬元丹, 付璐成, 周歡歡, 王斌, 張汝敏, 高燕. ?波葉金桂’對(duì)干旱和高溫脅迫的生理生態(tài)響應(yīng). 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2018, 42: 681–691. Wang J Y, Wang X D, Ma Y D, Fu L C, Zhou H H, Wang P, Zhang R M, Gao Y. Physiological and ecological responses to drought and heat stresses in Osmanthus fragrans ‘Boyejingui’., 2018, 42: 681–691 (in Chinese with English abstract).

[37] Waadt R, Seller C A, Hsu P K, Takahashi Y, Munemasa S, Schroede J. Plant hormone regulation of abiotic stress responses., 2022, 23: 680–694.

[38] Yosefi A, Mozafari A, Javadi T. Jasmonic acid improved in vitro strawberry (×Duch.) resistance to PEG- induced water stress., 2020, 142: 549–558.

[39] Liu J, Shu D F, Tan Z L, Ma M, Gou N, Gao S, Duan G Y, Kuai B K, Hu Y X, Li S P, Cui D Y. TheIDD14 transcription factor interacts with bZIP-type ABFs/AREBs and cooperatively regulates ABA-mediated drought tolerance., 2022, 236: 929–942.

[40] Kaya C, Tuna A L, Yoka? I, Ashraf M, Ozturk M, Athar H R. The Role of Plant Hormones in Plants under Salinity Stress. In: Salinity and Water Stress. Dordrecht: Springer Netherlands, 2009. pp 45–50.

[41] Srivastava S, Srivastava A K, Suprasanna P, D’Souza S F. Identification and profiling of arsenic stress-induced miRNAs in., 2013, 64: 303–315.

[42] Hac-Wydro K, Sroka A, Jablonaka K. The impact of auxins used in assisted phytoextraction of metals from the contaminated environment on thea alterations caused by lead (II) ions in the organization of model lipid membranes., 2016, 143: 124–130.

[43] Chen H F, Zhang Q, Lv W, Yu X Y, Zhang Z H. Ethylene positively regulates Cd tolerance via reactive oxygen species scavenging and apoplastic transport barrier formation in rice., 2022, 302: 119063.

[44] Hayat S, Ali B, Hasan S A, Ahmad A. Brassinosteroid enhanced the level of antioxidants under cadmium stress in., 2007, 60: 33–41.

[45] Chen H, Yang R X, Zhang X, Chen Y H, Xia Y, Xu X M. Foliar application of gibberellin inhibits the cadmium uptake and xylem transport in lettuce (L.)., 2021, 288: 110410.

[46] Lu Q Y, Chen S M, Li Y Y, Zheng F H, He B, Gu M H. Exogenous abscisic acid (ABA) promotes cadmium (Cd) accumulation inHance by regulating the expression of Cd stress response genes., 2020, 27: 8719–8731.

Transcriptome analysis of tobacco in response to cadmium stress

ZHANG Hui, ZHANG Xin-Yu, YUAN Xu, CHEN Wei-Da, and YANG Ting*

College of Life Sciences, Jianghan University / Hubei Engineering Research Center for Protection and Utilization of Special Biological Resources in the Hanjiang River Basin, Wuhan 430056, Hubei, China

With the development of industrialization process in society, the problem of cadmium (Cd) pollution in soil is increasing. However,has a strong Cd enrichment capacity in leaves, which seriously affects its economic value. To investigate the mechanism by which tobacco responds to Cd stress, tobacco leaves were harvested from the culture solution with Cd concentrations of 0 μmol L-1and 500 μmol L-1for subsequent transcriptome sequencing. In this study, a total of 76.94 Gb clean data was obtained, with Q30 base percentage exceeding 95.43%. The results showed that 7735 differentially expressed genes (DEGs) were screened under Cd stress conditions, including 4833 up-regulated genes and 2902 down-regulated genes. The reliability of transcriptome data was verified by qRT-PCR analysis to detect the expression patterns of candidate gene. Gene ontology (GO) annotation as well as Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were performed on differentially expressed transcripts. GO functional enrichment revealed that the differentially expressed genes were mainly distributed in metabolic processes, response to stimulus, cellular anatomical entity, catalytic activity, and transcription regulator activity. Meanwhile, KEGG analysis showed that the up-regulated differentially expressed genes were mainly involved in biosynthesis of amino acids, carbon metabolism, oxidative phosphorylation, and citrate cycle. Down-regulated differentially expressed genes were primarily enriched in photosynthesis, biosynthesis of secondary metabolites, metabolic pathways, and plant hormone signal transduction. Further analysis of plant hormone signal transduction pathways revealed that there were eight plant hormone pathways involved in response to cadmium stress in tobacco, and the relative expression patterns of different hormone gene member were also different. Experimental results from plant hormone application on tobacco leaves demonstrated that the regulation of gibberellins, brassinosteroids, and jasmonic acid pathways played roles in tobacco’s response to cadmium stress. The experimental results ofhormone signal mutant showed that plants respond to cadmium stress by regulating ethylene, gibberellin, brassinosteroid, and jasmonic acid pathways. In conclusion, this study not only explores the regulatory network of tobacco resistance to Cd stress, but also lays a theoretical foundation for the genetic improvement of crop resistance.

; cadmium stress; transcriptome analysis; regulatory mechanism; plant hormone

10.3724/SP.J.1006.2024.34141

本研究由湖北省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(2022CFB909), 國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31900095)和江漢大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)重大專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(2023XKZ016)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Hubei Province of China (2022CFB909), the Youth Fund Project of the National Natural Science Foundation of China (31900095), and the First-Class Discipline Construction and Special Program of Jianghan University (2023XKZ016).

楊婷, E-mail: yangtingYT2016@163.com

E-mail: zhanghui313355@outlook.com

2023-08-15;

2023-10-23;

2023-11-15.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231115.1006.004

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).