花生赤霉素3-β-雙加氧酶(AhGA3ox)基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

李海芬 魯 清 劉 浩 溫世杰 王潤(rùn)風(fēng) 黃 璐 陳小平 洪彥彬 梁炫強(qiáng)

花生赤霉素3-β-雙加氧酶(AhGA3ox)基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

李海芬 魯 清 劉 浩 溫世杰 王潤(rùn)風(fēng) 黃 璐 陳小平 洪彥彬 梁炫強(qiáng)*

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/ 廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國(guó)家油料作物改良中心南方花生分中心, 廣東廣州 510640

赤霉素3-β-雙加氧酶(gibberellin 3-beta-dioxygenase, GA3ox)是參與赤霉素生物合成的關(guān)鍵酶之一, 可通過影響赤霉素的形成調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育, 目前在花生中尚無系統(tǒng)研究。本研究利用生物信息學(xué)方法在花生栽培種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選花生GA3ox家族基因, 對(duì)鑒定出的7個(gè)在栽培種花生基因組中的分布、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化特征、理化性質(zhì)、啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析, 并利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行花生組織結(jié)構(gòu)表達(dá)模式分析, 同時(shí)對(duì)AhGA3ox家族基因在不同莢果大小的2個(gè)花生品系中的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 7個(gè)基因分布在7條染色體上, 均由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成。花生AhGA3ox蛋白中均包含1個(gè)DIOX_N結(jié)構(gòu)域和1個(gè)2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域, 系統(tǒng)進(jìn)化分析表明與大豆的親緣關(guān)系較近, 在根、莖、葉、花、果針5個(gè)組織中呈現(xiàn)出不同表達(dá)模式, 不僅在花生果殼不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量不同, 在2個(gè)莢果大小不同的花生品系果殼相同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量也不相同, 但多數(shù)發(fā)育時(shí)期在大果品系中的表達(dá)量均顯著高于小果品系, 推測(cè)該家族基因的表達(dá)可能對(duì)莢果的形成具有促進(jìn)作用。

花生;; 表達(dá)分析; 生物信息學(xué); 功能分析

赤霉素(gibberellins, GAs)是一種廣泛存在于植物中的二萜類羧酸, 包括功能活性分子GA1、GA3、GA4、GA7, 以及非活性分子GA9、GA19、GA20、GA29、GA511。GAs具有多種生物學(xué)功能, 在植物的發(fā)育和生長(zhǎng)過程中起著重要的調(diào)控作用, 如枝條伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)張和形狀、開花、種子萌發(fā)和果實(shí)發(fā)育[1-5]。GA的生物合成和代謝由6種關(guān)鍵酶催化, 分別是: 古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase, CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase, KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯-19-氧化酶(ent-kaurene oxidase, KO)、內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase, KAO)、GA20-氧化酶(GA20ox)和GA3-氧化酶(GA3ox)以及催化活性GAs失活或GAs前體消耗的GA2-氧化酶(GA2ox)[1,5]。GA3ox則是將非活性赤霉素前體GA5/GA9/GA20/GA44催化生成有活性的GA3/GA4/GA1/GA38[5-6]。目前, 已在水稻[6]、小麥[7]、葡萄[8]、豌豆[9]、桃子[10]和擬南芥[11]等物種中克隆了部分基因。在大多數(shù)植物物種中, GA3ox由多基因家族編碼, 但目前尚不清楚每個(gè)基因組中存在多少基因, 其中在擬南芥中已鑒定出4個(gè)基因(～)[11-12], 殷小林等[12]以(LOC_Os05g08540)作為靶序列, 利用BlastP 在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到了24個(gè)同源基因, 同源性為80%～90%。He等[13]利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST軟件鑒定到6個(gè)基因。

研究發(fā)現(xiàn),在玉米[14]、水稻[6]、擬南芥[11]和苜蓿[15]中的突變均導(dǎo)致植株矮稈。Wei等[16]利用西瓜正常品系M08和矮稈品系N21的F2分離群體, 在9號(hào)染色體32.88 kb的區(qū)域內(nèi)精確定位了一個(gè)隱性矮稈等位基因(), 基因注釋顯示編碼赤霉素3β-羥基化酶的cl015407基因可能是的最佳候選基因。Hu等[17]通過基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一種有益的單倍型, 有助于提高種子重量, 并在大豆的遺傳轉(zhuǎn)化中得到了進(jìn)一步證實(shí)。但目前有關(guān)花生GA3ox家族基因的研究報(bào)道卻比較少, 本研究在花生栽培體基因組中對(duì)基因()進(jìn)行鑒定, 并系統(tǒng)分析了基因的結(jié)構(gòu)、染色體位置、保守基序、啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件、系統(tǒng)發(fā)育分類以及基因在不同組織器官和發(fā)育階段的表達(dá)譜, 分析了AhGA3ox與擬南芥()、野生豆()、大豆()同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 并對(duì)AhGA3ox家族基因在花生不同組織器官以及在2個(gè)莢果大小不同的花生品系不同發(fā)育時(shí)期的果殼中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析本研究結(jié)果將為下一步明確AhGA3ox家族基因的功能, 促進(jìn)其在作物遺傳改良中的應(yīng)用提供良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料種植

花生品系P92-1和P92是本課題組多年培育的重組自交系超大果和超小果品系, 種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云區(qū)試驗(yàn)基地。各品系按小區(qū)種植, 單粒播種, 每小區(qū)種植共4行, 每行播種5穴。株距20 cm, 行距23.3 cm。3次重復(fù)隨機(jī)種植, 大田常規(guī)種植管理。花生果針剛開始向地伸長(zhǎng)時(shí)系上標(biāo)記塑料線, 其中P92-1系紅色塑料線, P92系白色塑料線, 并在果針進(jìn)入土壤后第10 (S1)、17 (S2)、24 (S3)、31 (S4)和38 (S5)天, 選取大小一致的莢果, 取果殼備用。每個(gè)品系每個(gè)發(fā)育時(shí)期取50個(gè)莢果, 各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 AhGA3ox家族基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

本研究中花生GA3ox家族基因信息參考“伏花生”分析結(jié)果, 參考基因組信息從Peanutbase (https:// www.peanutbase.org/)下載; Pfam (http://pfam.xfam. org/)下載所有的結(jié)構(gòu)域的hmm格式文件, 基于TBtools[18]進(jìn)行Simple HMM搜索, 尋找候選蛋白; 使用NCBI保守結(jié)構(gòu)域庫(kù)(CDD: https://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd)和SMART (http://smart.embl-heidelberg. de/)進(jìn)行候選蛋白驗(yàn)證; 利用ExPASy的ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)GA3ox家族基因編碼的蛋白氨基酸序列、相對(duì)分子量(molecular weight, MW)、等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)、總平均親水性(grand average of hydrophilicity, GRAVY)等蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析; 利用在線軟件WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè); 使用MapChart分析AhGA3ox家族基因成員的染色體分布; 使用NCBI-Protein (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/)搜索其他物種包括大豆、水稻以及擬南芥GA3ox蛋白; 利用DNAMAN和BLAST檢索多重序列比對(duì)和同源性分析; 利用MEGA11.0軟件進(jìn)行鄰接法(Neighhbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹; 使用MEME (http://MEME.nbcr. net/MEME/cgibin/MEME.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析; 從花生栽培種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得基因編碼序列(coding sequence, CDS)上游2000 bp的基因組DNA序列, 利用PlantCARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域潛在的順式元件進(jìn)行分析。

1.3 花生AhGA3ox家族基因表達(dá)模式分析

分別提取大莢果材料P92-1和小莢果材料P92的根、莖、葉、花、果針5個(gè)不同組織的RNA, 進(jìn)行表達(dá)量分析; 同樣分別提取莢果膨大期5個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期(果針進(jìn)入土壤后10、17、24、31和38 d)的果殼RNA, 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析, 所用引物可見表1。其中, RNA提取和反轉(zhuǎn)錄分別參照TaKaRa公司RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行; qRT-PCR析在CFX96 (Bio-Rad)定量PCR儀中進(jìn)行, 采用EvaGreen試劑盒(Bio-Rad), 根據(jù)操作手冊(cè)進(jìn)行, 分析方法采用2–ΔΔCT, 每個(gè)樣本包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR所用引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

用SPSS19.0 (SPSS Institute, Inc., 美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, LSD法檢驗(yàn)各比較組之間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生AhGA3ox基因鑒定

利用DIOX_N (PF14226)和2OG-FeII_Oxy (PF03171)結(jié)構(gòu)域, 通過TBtools以及NCBI在線分析工具在花生四倍體栽培種“伏花生”全基因組中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因。這7個(gè)基因的CDS長(zhǎng)度在1047～1125 bp范圍, 以Ahy_A07g037374最長(zhǎng), 編碼產(chǎn)物含有375個(gè)氨基酸, 以Ahy_A06g030353, Ahy_ B06g085507最短, 編碼產(chǎn)物僅含有349個(gè)氨基酸; 這些蛋白的等電點(diǎn)范圍為5.53～8.11; 不穩(wěn)定參數(shù)為36.94～57.23; 脂溶指數(shù)為75.79～86.29; 親水性平均數(shù)–0.462～ –0.221; 帶正電荷殘基數(shù)目30～46; 帶負(fù)電荷殘基數(shù)目31～44。利用網(wǎng)站(https://wolfpsort. hgc.jp/)對(duì)7個(gè)AhGA3ox蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), 該蛋白最可能出現(xiàn)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(表2)。根據(jù)基因組注釋, 這7個(gè)分別分布在花生的7條染色體上, 包括A06、A07、A08、A09、B06、B08、B09染色體上(圖1)。為研究AhGA3ox的進(jìn)化關(guān)系, 利用其氨基酸序列構(gòu)建了AhGA3ox蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。AhGA3ox家族成員分為2支(圖2-A)。分支I由Ahy_A06g030353、Ahy_A08g040809、Ahy_ B06g085507、Ahy_B08g089553組成。分支II由Ahy_ A07g037374、Ahy_A09g046613、Ahy_B09g094759組成。

圖1 AhGA3ox基因家族的染色體分布

黑色代表染色體, AhGA3ox家族基因標(biāo)記在染色體右邊, 左側(cè)比例尺表示染色體長(zhǎng)度。

The black bars represent the chromosomes. GA3ox genes are marked to the right of the chromosomes. The scale bar on the left indicates the length of the chromosomes.

為分析家族基因的結(jié)構(gòu), 通過比較基因組DNA和轉(zhuǎn)錄組序列來分析內(nèi)含子和外顯子的組成。所有均包含2個(gè)外顯子(圖2-A)。結(jié)合基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越近的基因, 它們之間基因結(jié)構(gòu)越相似可能為花生A和B亞基因組的直系同源基因; 如Ahy_A06g030353與Ahy_ B06g085507、Ahy_A08g040809與Ahy_B08g089553、Ahy_A09g046613均含有2個(gè)內(nèi)含子, 且結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度、分布差異較小(圖2-B)。對(duì)AhGA3ox蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 所有的AhGA3ox蛋白的N端都含有一個(gè)DIOX_N結(jié)構(gòu)域, C端含有1個(gè)2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域(圖2-B)。其中DIOX_N結(jié)構(gòu)域是一個(gè)具有2-氧戊二酸/鐵(II)依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N端區(qū)域。2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域中2種組氨酸和1種天冬氨酸殘基催化結(jié)合金屬離子, 通常是鐵離子, 但在某些情況下, 另一種金屬直接參與催化。靠近C端部分的保守的精氨酸或賴氨酸殘基作為堿性殘基與酸性底物相互作用[12]。

2.2 AhGA3ox基因的系統(tǒng)發(fā)育分析、基因結(jié)構(gòu)和組成

為了解花生AhGA3ox家族各成員間親緣關(guān)系與生物學(xué)功能, 明確花生與其他物種的GA3ox異同, 本研究對(duì)鑒定到的7個(gè)花生AhGA3ox與來自擬南芥()、水稻()、大豆()、野生大豆()、野生四倍體花生()、野生二倍體花生(,)的64個(gè)GA3ox進(jìn)行多序列比對(duì), 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果表明GA3ox蛋白可分為4類(圖3), Class I類11個(gè)蛋白均來自擬南芥, Class II類的GA3ox成員最多, 共23個(gè), Class III類15個(gè), Class IV類22個(gè)。其中來自花生栽培種基因組的Ahy_B06g085507、Ahy_A06g030353、Ahy_A08g040809、Ahy_B08g089553屬于Class II, Ahy_A07g037374、Ahy_B09g094759、Ahy_ A09g046613則屬于Class IV, 這些基因均與花生四倍體野生種和二倍體野生種的距離較近。在不同的分支中, 擬南芥、水稻的GA3ox蛋白均分別成簇出現(xiàn), 可見花生與擬南芥、水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 與大豆的親緣關(guān)系較近。

表2 AhGA3ox家族基因蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

圖2 花生AhGA3ox家族基因及編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育與結(jié)構(gòu)分析

(A) 利用AhGA3ox的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。(B)基因的結(jié)構(gòu)。綠色矩形、黃色矩形和黑色線條分別代表UTR、CDS和內(nèi)含子。底部比例尺代表UTR、CDS和內(nèi)含子長(zhǎng)度。(C) AhGA3ox蛋白的結(jié)構(gòu)。藍(lán)色和紫色矩形表示DIOX_N結(jié)構(gòu)域, 2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域。底部比例尺表示結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度。

(A) phylogenetic tree is constructed with amino acid sequences of AhGA3ox; (B) the structure ofgenes. Green rectangles, yellow rectangles, and black line represent UTR, CDS, and introns; (C) the structure of AhGA3ox protein. Blue and purple rectangles represent DIOX_N and 2OG-FeII_Oxy domains.

為進(jìn)一步研究AhGA3ox蛋白的特性, 基于motif的序列分析工具M(jìn)EME對(duì)來自擬南芥、水稻、大豆、野生大豆和花生5個(gè)物種71個(gè)GA3ox蛋白進(jìn)行了在線分析(圖4), 共得到10種保守基序, 大部分基因包含所有基序。花生栽培體基因組中, Ahy_A09g0466135、Ahy_A07g037374、Ahy_A08g040809、Ahy_B08g089553中包含所有的基序, Ahy_A06g030353包含9個(gè)motif,缺失motif 10。Ahy_B09g094759缺失motif 9, 來自花生四倍體野生種的5個(gè)基因中EVM0006872.1僅有7個(gè)基序, 缺失motif 2、motif 5、motif 9。EVM0038100.1、EVM0025264.1缺失motif 10。來自花生二倍體野生種B基因組的2個(gè)基因中araip.Araip.SF6BV則是缺失motif 6, araip.Araip. DQI4G.1則具有所有基序。

圖3 GA3ox基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

淺藍(lán)色背景區(qū)域?yàn)樗谋扼w野生種花生(), 綠色區(qū)域?yàn)樵耘喾N大豆(), 藍(lán)色區(qū)域?yàn)樗?), 淺灰色區(qū)域?yàn)閿M南芥(), 黃色區(qū)域?yàn)锳基因組二倍體野生種花生(), 褐色區(qū)域?yàn)锽基因組二倍體野生花生(), 紫色區(qū)域?yàn)橐吧N大豆(), 紅色區(qū)域?yàn)樗谋扼w栽培種花生(L.)。花生、擬南芥、水稻、大豆、野生豆系統(tǒng)發(fā)育分析將71個(gè)GA3ox蛋白分為4類。利用MEGA-X軟件以GA3ox蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ), 采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap=1000。

The light blue background was tetraploid wild peanut (), the green area was cultivated soybean (), the blue area was rice (), the light gray area was(), the yellow area was A genomic diploid wild peanut (), the brown area was wild peanut with B genome diploid (), the purple area was wild soybean (), the red area was tetraploid cultivated peanut (L.). Phylogenetic relationships among 71 GA3ox proteins in peanut, arabidopsis, rice, soybean and wild soybean. GA3ox proteins were divided into 4 classes. The phylogenetic tree is built on the basis of the complete amino acid sequences of GA3ox proteins by MEGA-X with maximum likelihood method. Bootstrap=1000.

(圖4)

Motif分析通過MEME在線分析完成, 不同氨基酸的高度代表可重復(fù)性, 底部的比例尺表示基序長(zhǎng)度。左側(cè)為蛋白系列名稱, 右側(cè)不同顏色分別對(duì)應(yīng)不同的保守基序在系列上的位置。

Phantom analysis is performed by MEME program. The height of different amino acid represents repeatability. The scale bar at the bottom indicates the length of the motif protein sequence. On the left are the names of the protein series. The different colors on the right correspond to the positions of different conserved motifs on the series, respectively.

2.3 花生AhGA3ox順式元件分析

啟動(dòng)子活性在基因功能調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。為了解花生的遺傳功能、代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制, 對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)的順式元件進(jìn)行了分析。以的2000 bp上游序列作為假設(shè)的啟動(dòng)子, 利用PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域潛在的順式元件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示, 這些基因啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)順式元件, 主要有ABA (ABRE)、auxin (TGA-box)、MeJA (TGACG-motif, CGTCA-motif)、GA (GARE-motif, TATC-box, P-box)和SA (TCA-element) 5種植物激素的順式元件, 以及多個(gè)光響應(yīng)(GATA-motif, TCT-motif, G-Box等)順式作用元件(圖5)。其中, 多個(gè)光響應(yīng)元件在所有基因的啟動(dòng)子中都發(fā)現(xiàn), 表明可能會(huì)受到光調(diào)控。僅Ahy_A08g040809、Ahy_ B06g085507、Ahy_B08g089553、Ahy_B09g094759的啟動(dòng)子中有GA響應(yīng)元件, 表明這4個(gè)基因可能會(huì)由GA誘導(dǎo)產(chǎn)生。

2.4 AhGA3ox家族基因在花生各組織及果殼發(fā)育過程中的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步分析家族基因在花生發(fā)育過程中的表達(dá)情況及作用, 本研究選取了2個(gè)莢果大小不同的花生品系(農(nóng)藝性狀見表3), 并采用qRT-PCR技術(shù)分析了7個(gè)基因在花生植株不同組織器官中的表達(dá)量(圖6)。結(jié)果表明,家族基因在2個(gè)莢果大小不同的花生品系中表達(dá)模式基本相同, 但在不同組織間表達(dá)水平不同。除Ahy_ A08g040809外(針對(duì)此基因在序列的前、中、后區(qū)段各嘗試設(shè)計(jì)引物, 但均擴(kuò)增失敗), 其余6個(gè)基因在花生各個(gè)組織中均有表達(dá), 其中Ahy_B08g089553在花中的表達(dá)量最高, Ahy_A09g046613、Ahy_ B09g094759在莖中的表達(dá)量最高, Ahy_ A06g030353、Ahy_B06g085507在果針中表達(dá)量最高, Ahy_ A07g037374則在根中的表達(dá)量最高。

圖5 AhGA3ox家族基因啟動(dòng)子中的順式作用元件預(yù)測(cè)分析

不同顏色方框分別代表不同順式元件, 底部的比例尺表示啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度。

Different colored boxes represent different-elements, and the scale at the bottom represents the length of the promoter sequence.

表3 2個(gè)花生品系農(nóng)藝性狀比較

*和**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

*and**mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

對(duì)不同發(fā)育階段的果殼中家族基因的表達(dá)量進(jìn)行分析(圖7)發(fā)現(xiàn), 該家族基因不僅在不同時(shí)期的表達(dá)量不同, 在2個(gè)品系相同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量也不同, 例如Ahy_B08g089553和Ahy_B06g085507在發(fā)育S1期表達(dá)量最高, 且在大果品系P92-1的5個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量均大于小果品系P92, 其中Ahy_B08g089553在發(fā)育前4期差異顯著, Ahy_ B06g085507則在發(fā)育S1、S2、S4、S5期差異顯著; 其余4個(gè)家族基因則在發(fā)育S5期的表達(dá)量最高, 其中Ahy_B08g089553的表達(dá)量在大果品系P92-1的S2、S4、S5期顯著大于小果P92, Ahy_B06g085507的表達(dá)量在大果品系P92-1的S1、S4、S5期顯著大于小果P92; Ahy_B09g094759的表達(dá)量在大果品系P92-1的S2、S5期顯著大于小果P92, Ahy_A07g037374的表達(dá)量在大果品系P92-1的S4、S5期顯著大于小果P92。

圖6 6個(gè)AhGA3ox家族基因在花生品系P92及P92-1各組織中表達(dá)模式分析

不同小寫字母表示不同花生組織在0.05概率水平差異顯著。

Different lowercase letters means significant difference at the 0.05 probability level in peanut tissue.

3 討論

3.1 AhGA3ox家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

赤霉素是植物生長(zhǎng)的重要激素, 在整個(gè)生長(zhǎng)周期中發(fā)揮重要作用, 包括種子的萌發(fā)、下胚軸和莖的伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)張、毛狀體發(fā)育、花粉成熟、果實(shí)發(fā)育等[19]。GAs包括有生物活性的GA1、GA3、GA4、GA7, 以及非生物活性分子GA9、GA19、GA20、GA29和GA51。GA生物合成分為3個(gè)階段, 第1步是由牦牛兒基焦磷酸(GGPP)經(jīng)古巴焦磷酸合成酶(CPS)以及內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(KS)催化生成內(nèi)根-貝殼杉烯來完成的[1,20]。第2步反應(yīng)首先由內(nèi)根-貝殼杉烯經(jīng)內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(KO)催化生成內(nèi)根-貝殼杉烯酸。隨后內(nèi)根-貝殼杉烯酸于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(KAO)催化生成GA12[1,21]。最后由GA12作為前體物質(zhì), 經(jīng)GA20ox以及GA3ox的催化生成有生物活性的GA1、GA3、GA4和GA7[5,19]。GA3ox是一類依賴于2-楊戊二酸的雙加氧酶, 在赤霉素合成的第3個(gè)階段參與催化GA20生成GA1以及催化GA9生物合成GA4, 直接決定植物體內(nèi)生物活性GAs的水平[6,13]。在許多植物中,為多基因家族, 但各物種有多少個(gè)成員基因還不是很清楚。目前, 已在水稻[6]、擬南芥[14]、小麥[22]、紫花苜蓿[15]和西瓜[23]等物種中克隆了部分基因。

S1～S5分別表示果針進(jìn)入土壤后第10、17、24、31和38天。*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。

S1–S5 represents the 10th, 17th, 24th, 31st, and 38th day after the gynophore enters the soil, respectively. *, ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

本次研究在花生栽培種中共鑒定到7個(gè)基因。通過生物信息學(xué)方法對(duì)物理化學(xué)性質(zhì)、染色體分布、進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件以及花生各植物組織表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 這7個(gè)基因分別位于A06、B06、A07、A08、B08、A09、B09染色體上, 7個(gè)基因均包含2個(gè)外顯子, 且基因進(jìn)化關(guān)系相近的基因結(jié)構(gòu)相似, 其中4個(gè)基因包含所有保守基序, 另外3個(gè)基因分別缺失1個(gè)基序。與擬南芥、水稻、大豆、野生大豆和野生花生5個(gè)物種的遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn), 與花生四倍體野生種距離較近。啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件分析結(jié)果顯示, 這些基因啟動(dòng)子區(qū)都具有多個(gè)順式元件, 包括ABA (ABRE)、auxin (TGA-box)、MeJA (TGACG-motif、CGTCA-motif)、GA (GARE-motif、TATC-box、P-box)以及SA (TCA-element) 5種植物激素的順式元件, 以及多個(gè)光響應(yīng)(GATA-motif、TCT-motif、G-Box等)的順式作用元件, 表明這些基因除受GA調(diào)控外, 也受ABA、IAA、MeJA、光信號(hào)調(diào)控。另外, 分析發(fā)現(xiàn)這些基因雖屬于赤霉素氧化酶基因, 但部分基因如Ahy_A06g030353、Ahy_ A07g037374、Ahy_A09g046613啟動(dòng)子上并不含赤霉素相關(guān)作用元件, 原因可能是選取的啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度(上游2000 bp)較短, 或者是通過GA信號(hào)通路上的其他作用因子調(diào)控其響應(yīng)內(nèi)源GA含量變化, 從而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)GA水平[24]。

3.2 AhGA3ox基因在調(diào)節(jié)莢果長(zhǎng)度方面具有一定作用

有關(guān)GA3ox家族基因的研究已有很多。其中擬南芥的赤霉素3-氧化酶由至少4個(gè)成員組成的多基因家族編碼, 命名為到。擬南芥和在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期負(fù)責(zé)具有生物活性的GA合成, 能打破種子休眠和萌發(fā)、促進(jìn)莖尖伸長(zhǎng)和類囊體合成,和則在生殖階段中表達(dá), 促進(jìn)花、果莢等部位的形成[25], 而小麥能加快營(yíng)養(yǎng)器官生長(zhǎng)和開花[8]。水稻中,定位于第5染色體短臂, 主要在未開放的花中表達(dá);定位于第1染色體短臂, 在伸長(zhǎng)的葉片中高表達(dá), 這2個(gè)基因可能影響水稻花藥的發(fā)育[6,12]。葡萄中的3個(gè)基因分別在根, 花和胚珠中高表達(dá), 表現(xiàn)出顯著的組織特異性[13]。煙草中異源表達(dá)蘋果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)煙草在開花時(shí)間與對(duì)照存在差異, 證明主要在花中表達(dá)[26-27]。可見GA3ox基因存在顯著的組織特異性。本次研究的7個(gè)基因不僅在花生不同組織部位的表達(dá)量不同, 且在不同發(fā)育階段果殼中的表達(dá)量也不同, 表明不僅具有組織特異性, 還具有發(fā)育時(shí)期特異性。這可能與其不同的生物學(xué)功能有關(guān)。

目前已經(jīng)在玉米、水稻、擬南芥、紫花苜蓿和西瓜等植物中鑒定到的基因突變體, 均導(dǎo)致植株矮化[6,13-15,22-23]。而基因的過表達(dá)則可以促進(jìn)植株節(jié)間發(fā)育, 提高植物纖維素、木質(zhì)素等的合成。例如, Radi等報(bào)道, 在擬南芥中過表達(dá)南瓜導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于野生型植株下胚軸、節(jié)間和葉片生長(zhǎng)增加, 開花時(shí)間提前[28]。Reinecke等[29]在豌豆中過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株節(jié)間、卷須和果實(shí)更長(zhǎng), 托葉更大, 開花延遲, 頂端分生組織壽命增加, 維管發(fā)育改變。但在轉(zhuǎn)基因雜交白楊中的過表達(dá)并沒有導(dǎo)致樹木生長(zhǎng)或形態(tài)的增加[30]。在本研究中, 通過qRT-PCR分析花生家族基因在2個(gè)大小果花生品系不同發(fā)育階段的果殼中的表達(dá)量, 發(fā)現(xiàn)該家族基因不僅在果殼不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量不同, 在大小果2個(gè)不同品系間的表達(dá)量也不相同, 但多數(shù)發(fā)育時(shí)期在大果品系中的表達(dá)量均顯著大于小果品系,可見該家族基因的表達(dá)可能對(duì)莢果的形成具有促進(jìn)作用。此前Reinecke等[29]也發(fā)現(xiàn), 在豌豆中過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)更長(zhǎng)。

4 結(jié)論

利用隱馬可夫模型(HMM)在栽培種花生基因組中鑒定到7個(gè)AhGA3ox家族基因, 這些基因在花生7條染色體上呈不均勻分布。花生家族基因在花生根、莖、葉、花和果針5種組織中的表達(dá)量存在差異。另外, 花生家族基因在大果和小果花生品系中的表達(dá)也存在差異, 在多數(shù)發(fā)育時(shí)期中, 其在大果品系中的表達(dá)量均顯著大于小果品系, 推測(cè)該家族基因的表達(dá)可能對(duì)莢果的形成具有促進(jìn)作用。本研究將為后續(xù)解析花生莢果大小形成的分子機(jī)制及花生莢果大小的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

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Genome-wide identification and expression analysis of AhGA3ox gene family in peanut (L.)

LI Hai-Fen, LU Qing, LIU Hao, WEN Shi-Jie, WANG Run-Feng, HUANG Lu, CHEN Xiao-Ping, HONG Yan-Bin, and LIANG Xuan-Qiang*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / South China Peanut Sub-Center of National Center of Oilseed Crops Improvement / Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China

Gibberellin 3-beta-dioxygenase (GA3ox) is one of the key enzymes involved in gibberellin biosynthesis, which can regulate plant growth and development by affecting gibberellin formation. There were no systematic studies in peanut genome. In this study, AhGA3ox family genes were identified from the genome database of cultivated peanut species by bioinformatics, and the distribution, structure, evolutionary characteristics, physical and chemical properties, promoter cis-acting elements were also analyzed. The relative expression pattern ofin different peanut tissues was analyzed by qRT-PCR, and the relative expression level of in shell of two peanut lines with different pod size were also analyzedThe results showed that 7were distributed on 7 chromosomes of peanut, all of which were composed of 1 intron and 2 exons. All the AhGA3ox proteins contained 1 DIOX_N domain and 1 2OG-FeII_Oxy domain. Phylogenetic analysis showed that they were closely related to GA3ox proteins of soybean,. Theshowed obvious tissue expression specificity in root, stem, leaf, flower and peg. The expression levels ofwere not only different in different development stages of the peanut shell, but also different at the same development stage of the two lines. Interestingly, the relative expression levels in large pod lines were significantly higher than those in small pod lines at most development stages. Therefore, we predict that the gene expression of AhGA3oxgene family may promote the formation of large pod.

peanut;; the relative expression analysis; bioinformatics; functional analysis

10.3724/SP.J.1006.2024.34122

本研究由廣東省“十四五”農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新十大重點(diǎn)項(xiàng)目公開競(jìng)爭(zhēng)計(jì)劃(2022SDZG05), 廣東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃-現(xiàn)代種業(yè)(2020B020219003, 2022B0202060004), 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32001442, 32172051), 廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目(2021A1515010811, 2023A1515010098), 廣東省農(nóng)業(yè)和農(nóng)村廳科技專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2019KJ136-02), 廣東省海外名師計(jì)劃項(xiàng)目(207124505346)和廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(202104TD)資助。

This study was supported by the Open Competition Program of Top Ten Critical Priorities of Agricultural Science and Technology Innovation for the 14th Five-Year Plan in Guangdong Province (2022SDZG05), the Guangdong Provincial Key Research and Development Program- Modern Seed Industry (2020B020219003, 2022B0202060004), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-13), the National Natural Science Foundation of China (32001442, 32172051), the Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515010811, 2023A1515010098), the Technology Special Fund of Guangdong Province Agriculture and Rural Affairs Department (2019KJ136-02), the Guangdong Province Overseas Master Teacher Program (207124505346), and the Agricultural Competitive Industry Discipline Team Building Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences (202104TD).

梁炫強(qiáng), E-mail: Liangxuanqiang@gdaas.cn

E-mail: lihaifen@gdaas.cn

2023-07-14;

2023-10-23;

2023-11-14.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231110.1622.012

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