靈武長棗干腐病病原菌的分離鑒定及生物學特性研究

馬喬女 賈慧 顧欣 趙巖 王新譜

摘 要 為明確靈武長棗干腐病病原菌的種類及其生物學特性，通過對靈武長棗干腐病發病枝條采樣，采用組織分離法進行病原菌分離，柯赫氏法則驗證和形態學、分子生物學鑒定。結果表明：分離獲得3株疑似病原菌，經柯赫氏法則驗證確定GF1菌株為靈武長棗干腐病病原菌。依據形態學和分子生物學鑒定，確定GF1菌株為木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）。GF1菌株菌絲生長的最適溫度為25～30? ℃，最適pH為6；孢子萌發的最適溫度為28? ℃，最適pH為7；光照條件有利于孢子萌發；孢子致死條件為55? ℃/20 min和60? ℃/ ?10 min及以上處理。

關鍵詞 靈武長棗；干腐病；病原菌；木賊鐮孢菌

靈武長棗（Ziziphus jujuba Mill. cv. Lingwuchangzao）是寧夏特色經濟林優良品種，原產地為寧夏靈武市。靈武長棗果實大、汁液多、質地酥脆，可食率達94%［1］，具有顯著的生態、社會與經濟效益。該產業已成為當地農民增收致富的主要途徑之一。

近年來，靈武長棗的設施栽培技術快速發展，但管理不當常引起果樹病害。其中，靈武長棗干腐病已在靈武市多處設施溫棚中出現。寧夏大學農業微生物資源開發與植物保護團隊觀察發現，該病害多發于樹勢較弱的果樹，在枝干基部、接近嫁接口的部位最先發病。發病初期，枝條皮孔明顯增大并向外突起，表皮變得粗糙，枝干上呈現淡紫色病斑，并逐漸沿枝干縱向擴展，直至整枝干枯。病斑處稍凹陷，嚴重時出現龜裂。病部與健部之間存在明顯的界線。發病后期，病斑變為黑褐色，且表面密生黑色小點。干腐病病情較嚴重的樹木，其木質部發生離層，皮層內側呈褐色。因為病部發生腐爛干縮，疏導組織阻斷，使地上部分呈現病態，如樹勢衰弱，樹木無法正常萌發，不能正常開花坐果，葉片黃化、果實萎蔫且提早脫落。當病害嚴重時，會形成環繞樹干莖部的病斑，疏導組織完全破壞，導致全樹枯死。該病害已嚴重影響靈武長棗果樹的生長和產量。

目前，棗樹干腐病研究僅見山西棗樹干腐病的相關報道［2-3］。山西省棗樹干腐病的病原菌為殼梭孢屬的七葉樹殼梭孢菌（Fusicoccum aesculi）［2］，其在發病后期，病斑為淺灰色，表皮皮孔無異常。在靈武長棗干腐病的發病后期，病斑呈灰黑色，表面密生黑色小點，皮孔突起。研究表明，病害的發生與作物品種特性、地域氣候和栽培管理方式等有關，不同品種的棗樹對同種病原菌的易感性具有差異，不同病原菌也可能導致植株表現出相似的病狀［4-6］。因此，有必要明確靈武長棗干腐病的致病菌。目前，對該病害采用化學藥劑進行防治，主要有世高、凱潤和多菌靈等藥［7］。馮慧靜等［8］通過ISSR（inter- simple sequence repeat）技術對棗干腐病病原菌的群體組成進行研究，結果表明該群體具有豐富的遺傳多樣性，群體內多樣性大于群體間多樣性。這不僅有利于棗樹抗性育種工作的順利開展，同時也可以為更深入地了解病害發生規律和制定高效的病害防治策略奠定基礎。

本研究擬對靈武長棗干腐病的病原菌進行分離與純化，經柯赫氏法則確定致病菌，繼而采用形態學和分子生物學技術對病原菌進行分類鑒定，并探明其基本生物學特性，為靈武長棗干腐病的科學防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 靈武長棗干腐病發病枝條和健康枝條均采集于靈武市棗園設施溫棚（東經 106°34′14″，北緯 38°127′34″，海拔高度1 113 m）。2021年3月，從具有干腐病病征（發病后期）的棗樹上采集發病枝條樣本20份，同時于未發病溫棚采集健康枝條20份。用無菌密封袋密封，盡快帶回試驗室開展病原菌的分離。

1.1.2 主要儀器和供試培養基 LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠），SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），RQX-250智能人工氣候箱（浙江托普儀器有限公司），HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州潤華電器有限公司），HeMa9600基因擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）。馬鈴薯葡萄糖培養基（potato dextrose agar，PDA），用于菌株的分離、純化、活化、保存及生物學特性研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 疑似病原菌的分離純化 將發病枝條先用無菌水沖洗3～4次，再用體積分數75%酒精擦拭1～2次，使用無菌刀片將發病組織切成小塊（0.5 cm×0.5 cm），在體積分數3%次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min進行消毒，取出后再用無菌水沖洗3～5次。將處理好的病枝組織置于PDA平板中央，28? ℃，相對濕度（relative humidity，RH）85%，黑暗條件下培養5 d。用無菌接種針挑取菌落邊緣的菌絲，轉接至新PDA平板，如此進行 ?3～5次純化培養，獲得分離菌株的純培養物。菌株活化條件為PDA培養基，28? ℃，RH 85%，光照培養。將活化培養5 d的菌株置于4? ℃保存。

1.2.2 孢子懸液的制備 按“1.2.1”方法活化疑似病原菌，于28? ℃，RH 85%，光照條件下培養 ?7 d，待菌落產生大量孢子。先用無菌接種針刮掉平板中的菌絲，再用少量無菌水沖洗平板3 次，收集沖洗液并補加無菌水至總體積為100 mL。室溫條件下充分振蕩（190 r·min-1，80 min）使孢子團分散，經8層無菌紗布過濾，用血球計數板確定孢子濃度，制備1×106 CFU·mL-1的孢子懸液。

1.2.3 致病性測定 依據柯赫法則，將疑似病原菌回接至健康枝條培養觀察并與田間發病癥狀比較，再從具有典型發病癥狀的枝條病變部位分離菌株，分離菌株的方法同“1.2.1”，以確定致病菌株。分別采用實驗室離體接種和田間活體接種兩種方法對疑似病原菌進行致病性測定。

離體接種試驗：選取新鮮健康、3 a～5 a生、生長狀況相似的枝條，用無菌剪刀剪取12～ ?15 cm表皮光滑無傷的枝條，先用體積分數75%乙醇擦拭2～3次，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙將表面水分吸干。將直徑5 mm圓形濾紙片進行高溫滅菌。每張濾紙片上滴加孢子懸液0.05 mL制成帶菌濾紙片。枝條打孔接種處理。用無菌打孔器（直徑5 mm）在枝條上打孔，打孔的深度到木質部。將帶菌濾紙片接種孢子的一面粘貼在枝條接種區上。在500 mL錐形瓶底部鋪一層濾紙，下置脫脂棉經高壓蒸汽滅菌處理。將無菌水注入脫脂棉，達到飽和狀態；濾紙全部濕潤，用于保持環境濕度。將接種后的枝條縱向置于錐形瓶內，提前用石蠟對枝條兩頭密封，可避免枝條與水直接接觸而造成局部濕度過大，用透氣封口膜扎緊燒杯口。以等量無菌水代替孢子懸液作對照。每處理10個重復。將試驗裝置置于28? ℃，RH 85%的恒溫光照培養箱，12 L/12 D（12 h? light/ ?12 h? darkness）培養14 d，觀察枝條的發病情況。

田間活體接種試驗：6-7月份，在田間選用健康的3 a～5 a生、生長狀況相似的枝條，在枝條上選取20 cm的一段，先后用酒精擦洗2～3次，用無菌水沖洗2～3次。接種區打孔及接種方式同離體接種試驗。接種后用保鮮膜包好接種區，防止雜菌的影響。以等量無菌水代替孢子懸液作對照。每個處理10個枝條，接種后第14 天觀察、統計接種棗樹枝條的發病情況。

依據離體接種試驗和田間接種試驗的結果，以枝條發病情況與棗干腐病病狀相同的菌株為高度疑似病原菌，繼而采用“1.2.1”的方法對回接發病的病枝進行病原菌的分離、純化，通過與原接種的菌株比較，確定病原菌菌株。

1.2.4 病原菌的鑒定 形態學鑒定：活化純培養菌株，條件同“1.2.1”。用平板培養法測定病原菌菌落的生長速度，以及菌落形態特征的觀察。采用普通光學顯微鏡觀察菌絲、分生孢子、分生孢子堆等形態特征并對其進行測量。依據《菌物字典》［9］和《中國真菌志》［10］對病原菌進行形態學鑒定。

分子鑒定：將病原菌接種在PDA培養基上，在28? ℃，RH 85%，光照條件下培養5 d收集菌絲體。將菌絲體溶解于50 mmol·L-1 NaOH溶液中，沸水浴15 min，恢復至室溫，提取病原菌DNA。采用通用引物ITS引物，擴增體系有2 ×TsingKE Master Mix 25 μL，Forward primer（10? μmol·L-1）1.0 μL，Reverse Primer（10?? ?μmol·L-1）1.0 μL和dH2O 22 μL，反應程序為94? ℃ 10 min；94? ℃ 30 s，55? ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環。PCR擴增反應完畢后，取2? μL進行瓊脂糖凝膠（質量體積分數為1%）電泳。經過PCR產物純化，收集DNA，送至廣州賽哲生物科技有限公司進行測序［11-13］。測序結果經BLAST比對和同源性分析，采用NJ法構建系統發育樹。

1.2.5 培養溫度對病原菌菌絲生長與孢子萌發的影響 利用無菌打孔器（直徑5 mm）在培養 ?7 d的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種至PDA平板中央，將平板分別置于15、20、25、30、35、40? ℃的恒溫箱中保濕（RH 85%）光照培養，每個處理重復3次。記錄菌落生長情況，以菌絲生長最快的培養溫度為基準，選取臨近溫度再次培養病原菌，根據菌絲的生長速度變化，最終確定菌絲的最適生長溫度范圍。采用凹玻片培養法，在無菌凹玻片中注入0.01 mL病原菌孢子懸液，采用15、20、25、30、35、40? ℃的條件培養24、48 h后依次進行顯微計數。每個凹玻片統計200個孢子中萌發的孢子數量。每處理3重復。孢子萌發率計算公式如下：

孢子萌發率=萌發孢子數/200×100%

1.2.6 培養基pH對病原菌菌絲生長與孢子萌發的影響 制備pH分別為4、5、6、7、8的PDA平板，按“1.2.4”方法接種病原菌菌餅并培養7 d，記錄菌落生長情況。分別用1 mol·L-1的NaCl和NaOH試劑調節孢子懸液pH為4、5、6、7、8，按“1.2.4”方法進行凹玻片培養，統計孢子萌發率。每處理3次重復。

1.2.7 光照時間對病原菌菌絲生長與孢子萌發的影響 設置3種光照條件，分別為24 L（24 h? light）、12 L/12 D（12 h? light/12 h darkness）、 ?24 D （24 h darkness），其他方法同“1.2.4”，培養 ?7 d，記錄PDA平板上菌落的生長情況，統計病原菌的孢子萌發率。每處理3個重復。

1.2.8 病原菌分生孢子致死溫度和時間的測定 在無菌試管內加入1 mL病原菌孢子懸液，分別置于40、45、50、55、60? ℃的恒溫水浴鍋中，分別處理5、10、15、20、25、30 min后迅速水浴冷卻至室溫。取0.01 mL處理后的孢子懸液滴于凹玻片上，28? ℃，光照條件下，保濕培養48 h，統計孢子萌發率。

1.3 數據處理

采用SPSS 25.0軟件進行方差分析與差異顯著性檢驗（Duncans新復極差法），Microsoft excel 2010進行繪圖與制表，MEGA 7.0建立菌株系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與致病性測定

分離獲得疑似病原真菌3株，分別編號為GF1、GF2、GF3。在離體接種試驗中，接種10～14 d，接種GF1菌株的枝條全部發病，癥狀與田間自然發病癥狀（圖1-A、1-B）相似，即枝條表皮呈黑色，表面出現黑色小點，為病原菌的分生孢子堆（如圖2-C）；組織干枯，木質部產生離層，木質部和韌皮部分離，皮層內側變褐（1-C、1-D）。GF2接種10～14 d后，接種部位出現磚紅色病斑，病斑邊緣有黑色的暈圈，木質部上出現淺褐色水漬狀病斑，與田間自然發病癥狀不同，如圖1-E。GF3菌株接種10～14 d后，接種部位無發病現象，接種部位的邊緣僅出現黑圈，木質部沒有發生病變，如圖1-F。對照未發病。

在田間活體接種試驗中，接種GF1的棗樹有發病現象，發病率為60.00%，接種枝條的發病癥狀與自然發病癥狀相似，至14 d 可觀察到典型病癥（1-G）。GF2、GF3在田間無明顯發病癥狀（1-H、1-I）。對接種GF1發病的枝條進行再次進行微生物的分離和鑒定，獲得與GF1形態特征一致的菌株。

2.2 病原菌的形態學鑒定

GF1菌株在PDA培養基上，28? ℃，RH 85%，光照條件下的生長速度為12.86? ?mm·d-1。氣生菌絲呈棉絮狀。培養初期，菌落正反面均為白色；培養4～5 d，菌落表現呈黃褐色（圖2-A），背面為深棕色（圖2-B）。菌絲為光滑、透明的有隔菌絲，出現大孢子堆（圖2-C）。培養期間，未觀察到病原菌的小型分生孢子（圖2-D）。大型分生孢子呈鐮刀狀，略微向內彎曲，兩端呈錐形，基孢有足，有3～6個隔膜，孢子大小（6.52～ ?16.50） μm×（2.42～5.39） μm。經形態學鑒定，初步判斷GF1菌株為鐮孢菌屬（Fusarium sp.）真菌。

2.3 病原菌的分子鑒定

將GF1菌株的測序結果錄入NCBI，獲得Genbank編號MT348611。根據BLAST結果，構建GFI菌株的系統發育樹，如圖3。分析可知，GF1菌株的測序結果與Fusarium equiseti（Genbank編號：MK621018、MN243680、MK370633等）序列相似性達100%，通過CABI databases（http：//www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp）數據庫對比分析，初步確定該菌分類地位為子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycete）、肉座菌目（Hypocreales）、叢赤殼菌科（Nectriaceae）、鐮孢菌屬（Fusarium）、木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）。

2.4 培養溫度對病原菌菌絲生長和孢子萌發的影響

由表1可知，GF1菌絲在10 ℃～35? ℃環境中均可生長，其最適生長溫度為25 ℃～30? ℃。培養3 d和5 d，25? ℃和30? ℃處理的菌落直徑顯著大于其他處理（P＜0.05）。培養至第7 天， ?25? ℃和30? ℃處理的菌落直徑無顯著差異 ?（P＞0.05）。低于25? ℃，菌落直徑顯著降低 ?（P＜0.05），說明溫度對菌絲生長具有顯著影響 ?（P＜0.05）。溫度對GF1的分生孢子萌發率影響較大，適宜萌發的溫度為25 ℃～30? ℃。

2.5 培養基pH對病原菌菌絲生長和孢子萌發的影響

如表2， GF1菌株在pH為4～8的PDA培養基上均可生長。在pH為6和7處理中，培養 ?7 d的菌落直徑達90.00 mm，顯著高于其他處理（P＜0.05），說明pH為6～7最適合菌絲生長。在pH為7的PDA中培養48 h，GF1的孢子萌發率達96.00 %，顯著高于其他處理（P＜0.05），說明孢子萌發的培養基最適pH為7。

2.6 光照對病原菌菌絲生長和孢子萌發的影響

光照有利于GF1的菌絲生長和孢子萌發（表3）。培養至第3天和第5天，24 L的菌落直徑顯著高于其他處理（P＜0.05），說明其最有利于菌絲生長。至第7天，各處理的菌落直徑無顯著差異（p＞0.05）。光照條件對GF1的孢子萌發影響較大。培養24 h，24 L和12 L/12 D的孢子萌發率顯著高于24 D（P＜0.05）。培養48 h，24 L處理的孢子萌發率為87.00 %，顯著高于其他處理（P＜0.05）。說明，24 L的光照條件最有利于分生孢子的萌發。

2.7 病原菌分生孢子的致死溫度和時間

由表4可知，隨著溫度和高溫處理時間的增加，孢子萌發率呈下降趨勢。處理15～25 min時，60? ℃處理的孢子萌發率為零，50? ℃和55? ℃處理的孢子萌發率顯著低于45? ℃和40? ℃（P＜0.05）；處理30 min時，60? ℃、55? ℃的孢子萌發率為0，50? ℃處理的孢子萌發率顯著低于45? ℃和40? ℃（P＜0.05）。因此，GF1菌株分生孢子致死溫度和時間為55? ℃/20 min和60? ℃/10 min。

3 討? 論

據報道，多種鐮孢菌可導致棗樹病害，如茄腐鐮孢菌（F. solani）引起棗樹枯死病、尖鐮孢菌（F. oxysporum）引起新疆棗根腐病等，以上病害的癥狀均與靈武長棗干腐病有較大差異［14-16］。木賊鐮孢菌是一種常見的植物致病菌，可導致橡膠樹基腐病［17］、柑橘樹根腐病［18］、蘋果樹根系病害等［19］。本研究首次發現，木賊鐮孢菌侵染靈武長棗導致其形成干腐癥狀。不同的是，山西省的棗樹干腐病主要為害5 a～6 a生的駿棗、灰棗、酸棗、雞心棗和梨棗的枝條，病原菌為七葉樹殼梭孢菌［20］。靈武長棗干腐病主要發病于設施溫棚栽培的、 ?3 a～5 a生的靈武長棗枝條，病原菌為木賊鐮孢菌。因此，二者在致病菌和發病植物種類、栽培環境等各方面均具有差異。有關靈武長棗干腐病的發病機理及患病棗樹生理特征變化規律有待進一步探索。

研究表明，木賊鐮孢菌菌絲生長的最適溫度為25? ℃，最適pH為6；24 h光照條件下菌絲生長速度最快，孢子萌發率最高［20］。本研究表明，GF1菌株的菌絲生長、孢子萌發的最適溫度范圍均為25～30? ℃；菌絲生長最適pH為6～7，孢子萌發最適pH為7，均接近或呈中性；24 h光照有利于GF1的菌絲生長和孢子萌發。木賊鐮孢菌的致死溫度為60? ℃/10 min［21］。本試驗測得孢子的致死溫度為55? ℃/20 min或60? ℃/10 min，與前人研究結果相同或相近。

在回接試驗中，與溫室自然發病癥狀比較，離體接種的枝條發病癥狀與其吻合，而田間接種的發病癥狀與其具有差異。田間活體接種的發病癥狀與自然發病癥狀相比，病斑較小，顏色更深，生長速度較慢，表皮皮孔并未突起，黑色小點數量較少。分析原因，一是溫室發病時間為3月中旬，光照周期短，光線經塑料薄膜反射和折射，溫室內的光照強度較弱。田間回接在6-7月，光照周期較長，光照強度較強，對病原菌的侵染具有不同影響；二是溫室通風較差，屬高溫高濕環境。在試驗室模擬溫室的溫濕條件，枝條表皮變得粗糙，皮孔變大、突起，可為孢子和菌絲提供良好的依附場所和侵染條件，獲得與田間典型病征相似的結果。而田間回接試驗為6-7月，夜晚溫度較低，降雨量較少，通風良好，溫濕度均遠低于溫室。溫度和濕度的變化不僅影響真菌病原體的侵染狀況，高溫高濕還會促使果樹皮孔的增大和突起。因此，菌株的生物學特性、寄主種類、自然環境與氣候等都會影響木賊鐮孢菌的環境適應性及其對植物的侵染［22］。未來，綜合運用環境調節措施和其他病害防治技術在溫室中防控靈武長棗干腐病，并闡明其調控機理，將成為下一步的研究方向。

4 結? 論

本研究從靈武長棗干腐病發病枝條上分離獲得病原菌，經柯赫氏法則驗證，形態學和分子生物學鑒定，確定GF1菌株為木賊鐮孢菌。不同溫度、pH和光照條件對GF1菌株的菌絲生長和孢子萌發具有不同影響。GF1的菌絲在10～ ?35? ℃均可生長，菌絲生長和孢子萌發的最適溫度均為25～30? ℃；菌絲生長和孢子萌發的最適pH分別為6～7和7；24 h光照有利于菌絲生長和孢子萌發；分生孢子的致死溫度和時間為55? ℃/20 min和60? ℃/10 min及以上。本研究結論為溫室中靈武長棗干腐病的防治研究提供了理論依據。

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Isolation，Identification and Biological Characteristics of? Pathogens of Dry Rot of Lingwuchangzao Jujube

Abstract In order to determine the species and understand the biological characteristics of the pathogenic bacteria causing dry rot in Lingwuchangzao jujube，tissue isolation was used to isolate the pathogenic bacteria，and their pathogenicity was confirmed following Kochs? postulate. The causal agents were identified based on the morphological characteristics and molecular biology. The results showed that three different morphological characteristics（GF1，GF2 and GF3） were isolated and purified and strain GF1 was confirmed to be pathogenic to the dry rot of Lingwuchangzao jujube according to Kochs? postulate. GF1 was identified as Fusarium equiseti by morphological characteristics and molecular biology. Optimal conditions for hyphae growth of strain GF1 were observed at temperatures between 25 ℃ and 30 ℃，with a pH of six. Spore germination is most favorable at 28 ℃，with a pH of seve.Light conditions are conducive to spore germination; however，exposure to temperatures of 55 ℃ for 20 min? and 60 ℃ for 10 min? and beyond inhibite spore germination.

Key words Lingwuchangzao? jujube; Dry rot; Pathogen; Fusarium equise