智力障礙兒童遺傳學病因篩查與分析

李 翠,王曉巖,劉小剛,趙明剛,李萍萍,李 旭,薛 梅

(西安交通大學第一附屬醫院1.轉化醫學中心;2.檢驗科,陜西 西安 710061)

智力障礙(intellectual disorder,ID)是兒童期常見的神經系統疾病,發病率為1%～3%[1-2]。ID病因復雜,其中遺傳因素約占其發病病因的50%。遺傳因素主要包括染色體異常、拷貝數變異和單基因/多基因變異等[3]。據報道,已有近2 000個基因與ID相關,但仍有50%左右的患者得不到明確診斷[4-6]。近些年,隨著高通量測序技術發展及全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES)技術廣泛應用,越來越多ID的新致病基因被不斷挖掘。有研究者建議將WES技術作為一線診斷技術應用于ID患者,以便于準確診斷,及時采取治療或預防措施,并可對患者及其家庭成員遺傳咨詢和后代再發風險進行評估[7]。本研究對5例ID患兒進行染色體核型分析和WES檢測,擬明確遺傳學病因,為患兒后續臨床診療及家系成員遺傳咨詢提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月至2021年1月在西安交通大學第一附屬醫院診斷為智力發育障礙的5例患兒為研究對象,平均年齡8.8歲,其中患兒P2是患兒P3的哥哥。所有患者及家屬檢測前均接受遺傳咨詢,簽署相應知情同意書。

1.2 染色體核型分析

抽取患兒肝素鈉抗凝外周血3mL,細胞培養、制片及G顯帶染色。核型分析命名根據人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN 2020)標準,每例計數30個核型,分析5個核型。

1.3 WES檢測及數據分析

抽取患兒EDTA抗凝外周血2mL,采用血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA(QIAGEN,德國),NanoWES探針進行DNA雜交捕獲,構建文庫。通過Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行測序分析,評估目標區域覆蓋度及測序質量后,利用Verita TrekkerR和EnlivenR系統對數據進行分析和解讀。通過查詢相關疾病數據庫及文獻,結合臨床表型篩選與智力障礙相關的候選基因變異位點,在神州基因組數據庫1 000 Genome、ExAC和gnomAD數據庫查找相關變異位點報道情況,并按照美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南對變異位點進行致病分級。

1.4 Sanger測序驗證

應用Primer Premier 5軟件對候選基因變異位點設計引物,ATP2C2 c.2096G>A引物序列為ATP2C2-2096F:5′-TCGCCCAATTCCCACAGC-3′,ATP2C2-2096R:5′-TCCACAGTAGCAGGTTCCAGG-3′;ATP2C2 c.2644_2655del引物序列為ATP2C2-2644F:5′-CTGCCCGCAGCATTGAGC-3′,ATP2C2-2644R:5′-TCGTTCCCGTCCCCACCA-3′,PCR擴增后,進行Sanger測序分析。

1.5 統計學方法

使用Ugene軟件對變異位點保守性進行分析,Swiss PDB Viewer軟件對ATP2C2三維蛋白結構進行預測。

2 結果

2.1 5例ID患兒臨床資料

染色體核型分析發現P1患兒為46,XY,del(18)(q22q23)。WES結果顯示P2患兒和P3患兒為ATP2C2基因c.2096G>A和c.2644_2655 del變異,為復合雜合變異,其余患者核型分析和WES未發現異常,見表1。

表1 5例ID患兒臨床資料

2.2 P1患兒家系圖譜及染色體核型結果

P1患兒為46,XY,del(18)(q22q23),對其父母進行外周血染色體分析,結果未見異常,見圖1。

注:A為P1患兒家系圖譜(黑色箭頭所指為先證者);B為P1患兒染色體核型結果(紅色箭頭所指為異常染色體)

2.3 ATP2C2基因變異位點Sanger測序分析結果

對P2和P3家系進行變異位點一代測序發現,母親為ATP2C2基因c.2096G>A雜合變異攜帶者,父親為ATP2C2基因c.2644_2655 del雜合變異攜帶者,見圖2。

注:A為P2和P3患兒家系圖譜;B為P2和P3患兒家系ATP2C2(2096G>A) Sanger測序圖(家系中第一個孩子夭折,未行遺傳學檢測,變異位點情況未知);C為P2和P3患兒家系ATP2C2(2644_2655 del)Sanger測序圖;紅色箭頭所指為變異位點。

注:A為ATP2C2 p.Ser699Asn和p.Ser882_Gly885del保守性分析;B為ATP2C2 p.Ser699Asn變異導致氫鍵發生改變;C為ATP2C2 p.Ser882_Gly885de變異對蛋白結構的影響;紅色箭頭所指為變異位點,黑色箭頭指示蛋白結構的改變。

2.4 ATP2C2基因變異位點詳情及致病性預測

P2和P3均為ATP2C2基因c.2096G>A和c.2644_2655 del復合雜合變異。

ATP2C2 c.2644_2655 del變異發生于C末端的Cation-transporting P-type ATPase功能結構域(PM1)。該變異在神州基因組數據庫和1000 Genome數據庫中沒有發現,在ExAC和gnomAD數據庫中的頻率分別為8.28788808035936e-06和8.82846e-06(PM2)。該變異為缺失變異,導致蛋白長度改變,但未引起開放閱讀框的改變(PM4)。根據ACMG指南此變異評級為可能致病(likely pathogenic)變異,致病性證據為PM1+PM2+PM4,見表2。

表2 ATP2C2基因變異位點詳情及致病性評級

ATP2C2 c.2096G>A發生在P-type ATPase HAD功能結構域(PM1)。該變異在神州基因組數據庫1000 Genome、ExAC和gnomAD數據庫中均未見報道(PM2)。根據ACMG指南此變異評級為意義未明(uncertain significance)變異,致病性證據為PM1+PM2,見表2。

2.5 ATP2C2基因變異位點保守性分析及其對蛋白結構的影響

經過對不同物種ATP2C2基因轉錄本進行氨基酸序列比對分析,ATP2C2 p.Ser699Asn和p.Ser882_Gly885del變異在不同物種中蛋白序列較為保守。對蛋白結構預測分析發現,ATP2C2 p.Ser699Asn變異造成699位絲氨酸被天冬酰胺取代導致SER699和THR696之間氫鍵減少,同時SER699和GLY675之間形成一個新的氫鍵。ATP2C2 p.Ser882_Gly885del缺失導致變異位點所在的α螺旋區域(882到885位氨基酸)缺失。

3 討論

3.1 ID臨床表現及檢測技術

ID具有廣泛基因型和表型異質性,患者可表現為智力發育遲緩,認知能力障礙,行為異常、伴或不伴癲癇等。ID傳統遺傳學檢測方法包括染色體核型分析、熒光原位雜交、Sanger測序及基因組拷貝數變異檢測等,但診斷耗時相對較長,價格昂貴,通常得不到明確診斷結果。研究發現全外顯子組測序技術具有高通量和高靈敏度等優點,能夠顯著提高智力障礙患者診斷率[7-8]。

3.2 18q22.2q23患兒臨床特征分析

本研究對5例ID患兒進行染色體核型分析,發現1例患兒存在染色體結構異常,為46,XY,del(18)(q22q23)。文獻報道,18q22.2q23區域主要包含了發育遲緩、身材矮小、腭裂、張力減退,聽力損傷等相關基因,18q22.3q23缺失患者主要臨床表現為身材矮小、智力障礙、聽力減退或聽力障礙、發育遲緩、腦白質發育異常及先天性心臟病等[9-11]。本例患兒僅表現為智力障礙和發育遲緩,語言發育落后。臨床表型和文獻中報道有差異可能和18號染色體缺失片段大小有關。理論上,缺失片段越大,包含的基因數目越多,其臨床表型可能越復雜。且由于本研究中患兒年齡尚小,可能有些臨床表型暫時沒有表現出來,后期將長期隨訪患兒生長及發育情況。患兒父母染色體核型正常,但無法排除生殖腺嵌合的可能,再次生育時,建議進行產前診斷,防止染色體缺陷兒的出生。

3.3 ATP2C2 基因c.2096G>A和c.2644_2655 del復合雜合變異位點分析

本研究還發現2例患兒為ATP2C2基因c.2096G>A和c.2644_2655 del復合雜合變異,家系驗證分析發現變異位點分別遺傳自表型正常的父母,其遺傳模式符合常染色體隱性遺傳。已有多項研究發現ATP2C2基因缺失或變異與特殊型語言障礙(specific language impairment,SLI)有關,16q24.1缺失159 kb,包括ATP2C2基因,可導致語言學習障礙[12]。ATP2C2基因錯義變異可以導致語言障礙和閱讀受損[13-14]。此外,對152個神經發育障礙的患者進行全外顯子組測序,分析發現ATP2C2基因純合變異會導致嚴重的ID、肌張力減退及發育不全等[15]。ATP2C2基因(OMIM 613082)位于16q24.1,共3 374bp,包含27個外顯子,其編碼高爾基體分泌途徑Ca2+/Mn2+-ATP 酶蛋白 2(SPCA2)。ATP2C2基因與 P 型鈣轉運蛋白活性和 P型錳轉運蛋白活性相關,可能參與鈣離子跨膜轉運、細胞鈣離子穩態和錳離子傳輸[16-17]。鈣離子參與調控神經元突起,包括工作記憶與突觸可塑性,鈣離子和錳離子調節異常與神經紊亂相關,如癲癇等[18]。有文獻報道ATP2C2基因在新生大鼠海馬神經元及成年人大腦中均有所表達,這表明其在維持神經元離子穩態中扮演著重要角色。本研究中兩患兒主要表現為智力障礙、語言發育遲緩伴癲癇等,可能與ATP2C2基因c.2096G>A和c.2644_2655 del復合雜合變異有關,推測此變異會影響鈣離子跨膜轉運和錳離子傳輸,導致工作記憶和突觸可塑性受損,從而導致患兒出現ID和癲癇等神經發育障礙癥狀。

本研究還有兩個患兒遺傳學診斷不明確,可能和非遺傳因素如胎兒期的感染等有關。此外,由于ID遺傳學病因復雜,可從染色體異常到單個堿基變異,甚至表觀遺傳學改變。本研究主要采用兩種方法,由于檢測方法本身的局限性,無法檢測到所有類型的遺傳學改變。因此,后續可以采取動態突變檢測、基因芯片或全基因組測序等方法進行完善。

綜上,本研究通過傳統的染色體核型分析技術聯合WES檢測對ID患兒及其家系進行遺傳學病因研究,可在細胞遺傳學和分子遺傳學層面揭示ID患兒的遺傳學病因,并對可能致病機制進行初步探討,為患兒提供了明確的遺傳學診斷,對遺傳咨詢及再生育指導提供了幫助。但本研究尚未對基因變異致病機制進行功能實驗研究,尚無法明確是否有其他調控機制參與,后續將進一步研究。