維生素D受體單核苷酸多態性與妊娠期高血壓疾病易感性的相關性分析

鹿 莎,李瑞華,陳雪蓉,初正敏,孟海云

(昆明市延安醫院產科,云南 昆明 650000)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders of pregnancy,HDP)是一組妊娠與高血壓共存的疾病[1-2]。該病隱匿或突發,常發現于孕婦產檢時,且病情迅速進展,易誘發子癇、胎兒生長受限等,嚴重影響母嬰健康。我國妊娠期女性中HDP發病率占6%～8%,是孕婦和新生兒死亡的主要原因之一[3]。目前,HDP病因和發病機制尚不明確,可能由多種因素、機制和通路共同參與,包括胎盤缺血、氧化應激反應、某些遺傳基因等[4-5]。

維生素D(vitamin D,VitD)因在鈣、磷代謝中的作用而廣為人知,其主要以25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D,25-(OH)-D]的形式與維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)特異性結合來發揮免疫調節功能[6]。目前,有很多關于VitD缺乏與各類疾病的相關研究[7],如妊娠期高血壓(gestational hypertension,GH)、糖尿病、慢性鼻竇炎、子癇前期(preeclampsia,PE)等,尚缺乏VDR單核苷酸多態性(single nucleotide polymorhism,SNP)與HDP易感性的相關性分析。因此,本研究選擇HDP孕婦為研究對象,分析VDR基因多態性與HDP易感性的關系,以期為臨床有效干預提供更多的理論依據,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年9月至2022年10月于昆明市延安醫院就診的122例HDP孕婦為研究對象(HDP組)。納入標準:①符合HDP診斷標準[8];②于本院進行規范化產檢;③初產婦、單胎;④孕周≥30周。排除標準:①合并肝炎、肺結核、腫瘤;②合并妊娠期糖尿病;③伴有免疫功能障礙、遺傳性疾病;④孕前具有高血壓病史。另選同期同院正常妊娠的122例孕婦為對照組。HDP組年齡20～40歲,平均(29.54±6.13)歲;孕周34～40周,平均(36.40±1.88)周;GH 55例,PE 67例。對照組年齡21～38歲,平均(28.71±6.08)歲;孕周36～40周,平均(39.17±1.85)周。本研究經院醫學倫理委員會審核批準,孕婦及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料收集

年齡、孕周、孕前體質量指數(body mass index,BMI)、初潮年齡、新生兒體重、流產次數、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)等資料經醫院病歷收集。

1.2.2基因分型檢測

取靜脈血2mL置于EDTA抗凝管中,保存于-80℃冰箱中,用于基因組DNA的提取;用采血管采集全血2mL,分離血清,測定血清VitD水平。嚴格按提取試劑盒(Qiagen,中國上海)說明書提取全血標本DNA。通過TaqMan熒光探針(美國Therom Fisher Scientific公司)及ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司),進行rs11568820、rs2228570及rs1544410的SNP測定。PCR擴增所需引物及探針由Applied Biosystems公司提供。

rs11568820引物序列:上游5′-ACCCATAATAAGAAATAAGTTTTTA-3′,下游5′-TGTGACCTAGTTTACTCAGGAATAT-3′;rs2228570引物序列:上游5′-GGAAGTGCTGGCCGCCATTGCCTCC-3′,下游5′-TCCCTGTAAGAACAGCAAGCAGGCC-3′;rs1544410引物序列:上游5′-GAGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATG-3′,下游5′-GCAGGCCTGTCTGTGGCCCCAGGAA-3′。

PCR擴增:95℃下3min,95℃下45次循環15s,60℃下1min,對于每個周期,測定來自參比基因循環數(visit gene cycle count,VIC)或羧基熒光素(carboxynuorescein,FAM)標記探針的熒光信號。PCR基因分型采用Bio-Rad CFX manager 3.0軟件分析(美國Bio-Rad Laboratories公司)。

1.2.3實驗室指標檢測

通過BC-5800全自動血液細胞分析儀(邁瑞,深圳)檢測甘油三酯(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、丙氨酸轉氨酶(alanine amino-transferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)及1,25-(OH)2D3水平。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 三個基因型的SNP分析

VDR基因rs11568820、rs2228570及rs1544410的基因型,經比對,分型結果與測序結果一致,見圖1～3。

圖1 rs11568820基因CC型和TT型

圖2 rs2228570基因GG型和AA型

圖3 rs1544410基因CC型和TT型

2.2 SNP的LD分析

將r2>0.80視為強LD,軟件計算結果顯示,rs11568820、rs2228570和rs1544410三個位點間不存在強連鎖現象,見圖4。

注:各SNP間r2值如方塊中數字(%)所示,數字越大表示LD越強。

2.3 兩組孕婦的基因型及等位基因分布情況比較

各SNP位點的基因型分布均符合HWE(P>0.05),表明研究對象具有群體代表性。與對照組相比,HDP組rs2228570基因GG型及G等位基因的比例均更高,差異有統計學意義(χ2值分別為6.799、4.066,P<0.05);rs2228570 G等位基因使HDP患病風險增加1.348倍;而rs11568820及rs1544410基因均與HDP風險無關,差異無統計學意義(P>0.05),見表1和表2。

表1 兩組孕婦的基因型分布情況比較 [n(%)]

表2 兩組孕婦的等位基因分布情況比較 [n(%)]

2.4 兩組孕婦的臨床資料比較

與對照組相比,HDP組孕婦的孕周、新生兒體重及1,25-(OH)2D3水平更低,TG、ALT、AST、BUN、Cr、SBP及DBP水平更高,差異均有統計學意義(t值介于6.056～19.644之間,P<0.05);兩組孕婦的其余指標均無顯著差異(P>0.05),見表3。

表3 兩組孕婦的臨床資料比較

2.5 分層分析rs2228570位點多態性與HDP易感性

進一步分層分析了rs2228570位點與HDP發病之間的關系,結果顯示與AG/AA基因型相比,GG基因型組TG≥3.82mmol/L、1,25-(OH)2D3<20.18nmol/L及Cr≥68.78μmol/L的孕婦比例均更高,其OR值及95%CI分別為1.555(1.320～1.927)、2.402(1.215～2.734)、1.902(1.267～2.303),P<0.05,見表4。

表4 分層分析rs2228570位點多態性與HDP易感性 [n(%)]

3 討論

3.1 VitD的存在形式、主要作用及與妊娠期疾病的關系

在體內,VitD主要以VitD2和VitD3的形式存在,并參與各種免疫細胞功能調節,影響細胞因子和抗微生物肽的分泌,以維持細胞生長和分化,對人體健康有益[9]。在肝臟內,VitD發生酶促反應轉化為25-(OH)-D的活性形式,與VDR結合來調節各種生理、病理活動,如胚胎著床、妊娠激素合成、支持胎兒生長等,并發揮免疫調節作用,如鈣平衡、細胞增殖等[10]。相關研究發現,VitD缺乏與PE和GH發病有關,孕早期VitD缺乏可增加發病風險[11]。

3.2 VDR基因三個SNP位點與HDP風險的關系

位于12號染色體長臂1區3帶處的VDR基因具有多個SNP位點,極易發生基因多態性突變,從而影響VitD水平發生結構異常,與多種疾病的發生發展過程密切相關[12]。rs11568820位于VDR啟動區,其多態性影響VDR基因表達;rs2228570位于VDR第2外顯子上,其多態性直接改變VDR分子結構;rs1544410位于VDR第8內含子上,其多態性會影響VDR基因轉錄效率及mRNA穩定性。因此,本研究選擇了上述三個功能位點進行基因分型,即FokI(rs2228570),Cdx2(rs11568820)和BsmI(rs1544410),以評估它們與HDP風險的關系。

本研究結果顯示,與對照組相比,HDP組rs2228570位點GG基因型及G等位基因的比例均更高,且rs2228570位點G等位基因使HDP患病風險增加1.348倍。Zhan等[13]人的研究結果表明,rs2228570位點G等位基因與PE發病有關。李祥雯等[14]人的研究結果表明,孕婦發生PE與VitD水平和BsmI、FokI位點相關。rs2228570位點G等位基因是HDP發病的危險因素,這表明VDR基因rs2228570位點多態性可能與HDP患病具有一定關系,其中GG基因型可能是易感基因,這可能是由于VDR基因突變后與VitD結合,造成胎盤和子宮內血管壁炎癥增加,從而導致孕婦患病風險相對增加。此外,攜帶GG基因型孕婦的1,25-(OH)2D3水平更低,提示VDR基因多態性突變可能是通過影響1,25-(OH)2D3水平發生結構異常,進而在疾病發生發展過程中發揮重要作用,具體機制有待深入研究。

同時,與rs2228570位點AG/AA基因型相比,GG基因型TG≥3.82mmol/L及Cr≥68.78μmol/L的孕婦比例均更高。人體的脂肪成分TG是機體存儲能量的主要形式。有研究顯示,多數妊娠期并發癥與血脂水平異常升高密切相關,可表現為不同程度的血壓、血糖、血脂升高等癥狀[15]。正常妊娠需要旺盛的血脂代謝來支撐,且隨著妊娠進程發展,激素水平不斷變化,脂肪合成代謝來不及分解,易出現高血脂癥。此外,血脂水平異常可增強機體氧化應激反應,氧自由基無法被及時清除,造成細胞功能紊亂和損傷,從而導致HDP發生。相關研究表明,在妊娠期間血壓升高,大多數情況下會影響腎功能穩定性,影響生活質量[16]。Cr水平可作為反映腎小球濾過功能的良好指標,主要反映腎功能是否正常,Cr水平偏高或上升有可能是腎功能損傷,病情加重[17]。此外,本研究中還發現,rs11568820和rs1544410與HDP易感性無關。Rezavand等[18]的研究結果亦表明,VDR TaqI和BsmI均與PE風險無關。

3.3 HDP的不良影響及各因素的變化

HDP多發于妊娠20周后,臨床主要表現為高血壓、蛋白尿、水腫等,嚴重者還會并發機體各器官功能損傷,易發生胎盤早剝、死胎等不良妊娠結局,對母嬰健康的近、遠期傷害較高。因此對于HDP孕婦血清相關指標水平的檢測十分重要,有利于早期防治。本研究中,HDP組孕婦的血清TG、ALT、AST、BUN及Cr水平均顯著高于對照組。相關研究結果顯示,HDP的發病機制非常復雜,而其中脂代謝異常具有十分重要的作用[19]。既往研究發現,ALT和AST均與高血壓呈正相關[20]。肝胰島素抵抗使大量TG于肝臟沉積,以致肝損傷,引起轉氨酶水平升高[21]。全身胰島素抵抗使得脂代謝異常更嚴重,導致形成動脈粥樣硬化,進而血壓升高。BUN和Cr主要通過腎臟排泄。在正常妊娠期間,由于腎小球血流總量與濾過率增加,使得BUN和Cr排泄增多,進而血清中二者水平降低[22];但若伴隨HDP,就會發生腎小動脈痙攣,進而動脈壓升高,循環血流量減少,腎臟供血不足以致BUN和Cr排泄減少,導致血清中BUN和Cr水平升高。另外,HDP組孕婦孕周較短,新生兒體重較低,這可能是由于HDP孕婦通常需要提前終止妊娠以緩解臨床癥狀,繼而發生早產。

本研究也存在一定的不足。一方面,納入研究的樣本數量較少;另一方面,未檢測VDR蛋白數量和活性。盡管存在一些局限性,但本研究為VDR多態性與HDP易感性之間的關聯提供了參考證據。未來需要在更大的樣本量中進行驗證及功能分析,以闡明潛在機制。

綜上所述,rs2228570位點多態性與HDP易感性,以及HDP孕婦高TG、Cr水平和低1,25-(OH)2D3水平密切相關,而與rs11568820和rs1544410無關。rs2228570位點攜帶G等位基因會增加HDP患病風險。