土鱉蟲雌雄蟲對外傷血瘀證大鼠模型的作用差異研究?

趙江鵬,張 敏,張明生

(1.北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100007;2. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所,北京 100700)

土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉EupolyphagasinensisWalker或冀地鱉Steleophagaplancyi(Boleny)雌蟲的全體,具有破血逐瘀、續筋接骨的作用,為傷科要藥,其入藥首載于《神農本草經》[1]。當前以土鱉蟲為原料的成藥產品日益增多,對野生地鱉資源構成了較大的威脅。2020版《中華人民共和國藥典》中明確指出以其雌蟲干燥體入藥[2],雄地鱉是否由于功效作用異于雌蟲而不被采用未見報道。因此,比較二者療效差異對規范臨床用藥以及擴展藥用資源相關工作的開展具有重要意義。

外傷所致的血瘀證為一系列急性發病過程,現代研究認為其發生機制是以血管內皮細胞損傷的血管病變為始動因素,進而出現血小板聚集與炎性因子釋放[3-4]。研究證實,血清一氧化氮(nitricoxide,NO)水平反映了血管內皮細胞合成及釋放NO的功能狀態,是維持血管舒張的重要物質[5]。內皮素(endothelin, ET)-1為血管內皮細胞損傷的特異性標志物之一[6-7]。血栓素(thromboxane, TX)B2在收縮血管及促血小板聚集、促進凝血及血栓形成方面具有重要作用。6-酮-前列腺素(6-Keto-protaglandin, 6-K-PG)F1α能夠舒張血管及抗血小板聚集、抑制凝血及血栓形成。因此,NO、ET-1、TXB2與6-K-PGF1α可以作為評價外傷所致血瘀證的可靠指標[3-4,8-11]。

本研究采用重物墜落法制備外傷血瘀證模型,通過檢測大鼠瘀腫處腿徑以及血清中NO、ET-1、TXB2和6-K-PGF1α的水平,評價并比較土鱉蟲雌蟲和雄蟲對外傷血瘀證的干預作用,闡明二者的功效作用差異,為土鱉蟲的臨床用藥以及藥用資源的合理開發提供實驗依據。本研究已通過北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,批件編號:BUCM-2010031001-1001。

1 材料

1.1 動物

清潔級Wistar雄性大鼠50只,體質量180～200 g,購自北京海淀興旺實驗動物養殖場,動物許可證號:SCXK(京)2009-0 017。大鼠飼養于北京中醫藥大學動物實驗室,環境溫度20～21 ℃,相對濕度50%～70%,維持明-暗每次各12 h交替循環,自由飲水及進食。

1.2 中藥與試劑

土鱉蟲,購自天津市鑫茂土元養殖基地,經鑒定為冀地鱉Steleophagaplancyi(Boleny) 的成蟲干燥體。NO試劑盒(貨號:100716002),南京建成生物工程研究所;ET-1試劑盒(貨號:100626005)、TXB2試劑盒(貨號:10626009)、6-K-PGFlα試劑盒(貨號:100622101),解放軍總醫院科技開發中心放免所。

1.3 儀器

GMJ型全自動放射免疫γ計數器,江蘇省醫療電子研究所;HZ-9221 K型恒溫振蕩器,太倉科教儀器廠;721A型分光光度計,上海第三分析儀器制造廠。

2 方法

2.1 分組與造模

除正常組外,將造模動物分為模型組、雌蟲組、雄蟲組、雌雄蟲組,每組各10只。Wistar大鼠先適應性飼養1周,造模當日將大鼠右后腿脫毛,固定,于右后小腿中部外側做好標記,將1 kg鈍頭鐵杵對準標記處,自25 cm垂直高度自由落下,擊中標記處軟組織及骨部,擊打1次,即可造成明顯皮下出血及腫脹的非開放性軟組織損傷模型[12-13]。

2.2 給藥

取土鱉蟲雌蟲50 g、雄蟲50 g、雌雄蟲各25 g混合,分別加入10倍量水煎煮1 h,共煎煮2次,合并煎煮液,減壓濃縮至濃度為0.1 g生藥/mL的雌蟲水煎液、雄蟲水煎液以及雌雄蟲混合水煎液。正常組和模型組大鼠每天給予等體積純凈水灌胃,藥物干預組給予1 g生藥/kg的相應藥物,于外傷后第1天開始每天灌胃給藥1次,連續灌胃5 d。

2.3 處死與取材

末次給藥后各組大鼠禁食8 h,以4 mL/kg劑量的25%烏拉坦腹腔注射進行麻醉,麻醉后固定于手術臺上,打開腹腔,暴露腹主動脈,負壓管取血至血清管中,4 ℃低溫離心,分離血清。

2.4 指標檢測

2.4.1 腿徑測量 于造模前及造模后的第1、2、3、4、5 天分別測量大鼠右后小腿中部標記處瘀腫的腿徑,重復測量3次,取平均值。

2.4.2 血清實驗室指標檢測 硝酸還原法(比色法)檢測血清中NO含量;放射免疫法測定血清中ET-1、TXB2和6-K-PGF1α含量。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 土鱉蟲雌雄蟲對外傷血瘀證大鼠瘀腫處腿徑的作用

通過比較土鱉蟲雌雄蟲干預前后外傷血瘀證大鼠瘀腫處腿徑可見,造模后1 d,與正常組比較,模型組大鼠瘀腫處腿徑明顯增加(P<0.05),說明外傷血瘀證造模成功。造模后5 d,與模型組比較,雌蟲組、雄蟲組和雌雄蟲組大鼠瘀腫處腿徑減小,差異均有統計學意義(P<0.05),表明各藥物干預對外傷血瘀證大鼠腿部瘀腫具有一定的改善作用,且雌蟲組、雄蟲組、雌雄蟲組組間比較差異無統計學意義(P>0.05),同時提示大鼠的自愈表現不及用藥干預效果,見表1。

表1 土鱉蟲雌雄蟲對外傷血瘀證大鼠瘀腫處腿徑的作用

3.2 土鱉蟲雌雄蟲對外傷血瘀證大鼠血清NO、ET-1、TXB2、6-K-PGF1α的作用

與正常組比較,模型組大鼠血清NO和6-K-PGFlα水平顯著下降,ET-1和TXB2水平顯著升高,差異均有統計學意義(P<0.05),表明外傷血瘀證模型制備成功。經土鱉蟲藥物干預5 d后,與模型組比較,雌蟲組、雄蟲組和雌雄蟲組大鼠血清NO、6-K-PGFlα水平顯著上升,ET-1、TXB2α水平顯著下降(P<0.05)。雌蟲組、雄蟲組和雌雄蟲組之間比較,各指標水平差異均無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 土鱉蟲雌雄蟲對外傷血瘀證大鼠血清NO、ET-1、TXB2、6-K-PGF1α的作用

4 討論

土鱉蟲又稱“地鱉”“土鱉”“簸箕蟲”等,是臨床常用的中藥材,為治療傷科疾病的要藥,被廣泛應用于治療各種外傷疾患及血瘀證相關疾病,具有非常好的破血逐瘀、續筋接骨功效,正如《長沙藥解》曰“本品善化瘀血,最補損傷”[14]。土鱉蟲是諸多治療外傷疾病中成藥的重要組方藥物,如舒筋活血丸、接骨七厘散[15]等。有學者通過實驗研究對比5種動物類活血化瘀藥,發現在蟲類活血化瘀藥中土鱉蟲的作用最優[16];臨床研究亦證實土鱉蟲內服可以促進外傷血腫吸收、骨折愈合[17-18]。

《古今醫鑒》有云“大凡打仆損墜墮,或刀斧所傷,皮未破而內損者,必有瘀血停積,先宜逐去瘀血”[19]。中醫學認為血瘀證離經之血不能消散,阻遏于經脈之內,或瘀積于臟腑及組織內[20]。外傷所致的血瘀證為一系列急性發病過程,最為關鍵的發病機制為外傷所致溢血內留,而出現局部血流不暢、淤紫、腫脹、疼痛等表現[21]。本實驗研究采用重物墜落法制作外傷血瘀證模型,模擬外傷的形成過程。大鼠外傷后,局部病理改變的最直接表現是局部骨質破壞及血管受損,骨質破壞后最開始的24 h內骨折端以典型的炎癥反應、組織細胞壞死以及局部血流量增加為主,局部血流量增加最直接的影響為血管收縮調節功能的變化,其中炎癥反應和組織細胞壞死與外傷血瘀證相關性不大,而血管受損與血瘀證有非常密切的關系[8-11]。血管受損的直接表現是血管內皮損傷及血管收縮平衡失調,NO、ET-1、TXB2、6-K-PGF1α是目前血瘀證最常用的觀察指標。作為反映血管內皮細胞損傷特異性標志之一的ET,是迄今發現的作用最強、維持最久的縮血管物質,能反映血管內皮細胞的功能[22],誘導血小板聚集和血栓形成作用而造成血管損害[5]。外傷后,體內NO、ET-1失調,可以誘導急性血瘀證的發生發展。前列環素(prostaglandin I2, PGI2)具有很好的舒張血管及抗血小板聚集、抑制凝血及血栓形成作用,而血栓素 ( thromboxane ,TXA) A2具有收縮血管及促血小板聚集、促進凝血及血栓形成作用。因此PGI2和TXA2是一對調節血管舒張和收縮功能的重要活性物質,但因為此兩項活性物質半衰期很短,實驗中可以通過檢測其代謝產物TXB2和6-K-PGFlα,間接反映PGI2和TXA2水平[23]。

2020版《中華人民共和國藥典》規定土鱉蟲以雌蟲干燥體入藥,但從《本草經集注》《新修本草》《本草疏證》等諸多古籍記載可悉,入藥土鱉蟲具有“不能飛”的特征。雄性地鱉成熟后具有羽化的生物特性,而未羽化前的雄地鱉個體偏小,外形與雌地鱉相似,可見古代所用的“不能飛”土鱉蟲不完全代表雌蟲,因此為了更加嚴謹和科學地探究雌雄蟲對外傷血瘀證的作用差異,本研究選用土鱉蟲雌性和雄性的成蟲,雄蟲已經完全羽化,可避免雌蟲混入。本實驗研究結果表明,造模后大鼠受擊打處瘀腫明顯,經土鱉蟲水煎劑干預后,雌蟲組、雄蟲組和雌雄蟲組大鼠瘀腫處腿徑均較模型組明顯減小,大鼠血清NO、ET-1、TXB2和6-K-PGF1α水平顯著回調,說明土鱉蟲具有很好的活血化瘀、續筋接骨、促進外傷愈合、調節受傷局部微循環條件等作用。但治療組各組間比較無差異,提示土鱉蟲雌雄蟲干燥體在干預外傷所致血瘀證的療效上近似。有學者對土鱉蟲雄蟲不同分子量物質進行活性測定并得到最強活性片段,進一步證實雄蟲具有溶栓抗凝活性[24],故能起到活血化瘀等作用。也有學者通過實驗推測雌蟲可能通過促進血管內皮生長因子的表達進而誘導大鼠骨髓間充質干細胞的成骨分化[25-26]。王羿、常淮陽等對雌、雄蟲進行營養成分研究,指出羽化后的雄蟲銅離子含量顯著高于幼蟲和雌蟲,而銅離子有助于成骨細胞增殖,可以間接促進骨髓間充質干細胞的成骨和成脂分化[27-28]。此外雄蟲的蛋白質與氨基酸含量也被證明顯著優于雌蟲,可見雄土鱉蟲具有一定的生物活性,具有資源開發的潛質。有研究表明雄蟲不能入藥的原因在于灰分和滲出物含量與2020版《中華人民共和國藥典》不符[28],相信在克服灰分和滲出物含量對藥物臨床應用干擾的前提下,雄性土鱉蟲的資源開發將大大有益于中藥資源的合理保護以及中藥材經濟效益的提升。