水仙環(huán)素的抗腫瘤活性及機(jī)制研究進(jìn)展

楊 敏 ，林琪琪 ，劉丹丹 ，周宏宇

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500;2）昆明醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院，云南 昆明 650500）

據(jù)研究表明，在我國，每年有近300 萬人因惡性腫瘤而死亡，僅次于心腦血管疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，每年死于癌癥的人數(shù)超過800 萬，約占全球死亡總數(shù)的13%。據(jù)估計，未來幾十年內(nèi)，癌癥確診人數(shù)將持續(xù)上升[2]。但由于腫瘤細(xì)胞具有不同亞群，一些亞群憑借其異質(zhì)性，可以逃避靶向藥物的殺傷[3]；當(dāng)前的靶向藥物開發(fā)不夠；已開發(fā)的藥物選擇性差、副作用強(qiáng)，腫瘤的治療面臨多重困難。因此尋找更具選擇性的靶向腫瘤細(xì)胞的有效抗癌藥物極為重要。

水仙環(huán)素（narciclasine，NCS，圖1）[4]是一種天然植物生長抑制劑，存在于包括水仙在內(nèi)的石蒜科開花植物中。NCS 于1967 年首次從幾種水仙屬的球莖中分離出來[5]，已被證明具有抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抑制血管生成[8]和抗病毒[9]的活性。美國國家癌癥研究所（national cancer institute，NCI）在 60 種特定人類腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，NCS 對各種癌細(xì)胞系具有廣泛的細(xì)胞毒性[10]。另有研究顯示NCS 對腫瘤細(xì)胞顯示出較高的細(xì)胞毒性和選擇性。體內(nèi)抗腫瘤研究也顯示，口服或注射NCS 均能顯著抑制腫瘤生長，并提高荷瘤小鼠存活率[11]。

圖1 水仙環(huán)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4]Fig.1 Chemical structure of NCS

綜上所述，NCS 具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性，且相比于其它細(xì)胞毒類化合物，具有選擇性好、安全性高的特點(diǎn)[12-13]。NCS 主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖來實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用，目前這種選擇性的細(xì)胞毒作用在臨床腫瘤治療上是最為理想的[14]，因此，NCS 有望成為臨床上預(yù)防和治療癌癥的有效藥物。盡管NCS 的抗腫瘤作用顯著，但其潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)和機(jī)制仍然知之甚少。因此有必要對NCS 抗腫瘤活性與機(jī)制進(jìn)行深入研究，以發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤靶點(diǎn)，這對NCS 類抗腫瘤新藥的研究具有重要的意義。本文就NCS 近年來的抗腫瘤活性與機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

1 NCS 抑制乳腺癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

1.1 NCS 通過抑制蛋白質(zhì)合成抑制乳腺癌細(xì)胞生長

Ceriotti 等[5]的研究顯示，當(dāng)以低劑量皮下給藥時，NCS 對S-180 小鼠腹水瘤細(xì)胞顯示出有效的抗有絲分裂活性。馬德里生物學(xué)研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)，NCS 的抗腫瘤以及許多其它生物活性與NCS 對真核生物核糖體蛋白合成的有效抑制有關(guān)。另外，該研究人員進(jìn)一步評估了NCS 對HeLa 細(xì)胞生長以及對細(xì)胞DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成的影響，結(jié)果表明，NCS 對HeLa 細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的生長抑制活性，這是由于NCS 能抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA 合成，而RNA 合成不受影響，并且抑制蛋白質(zhì)合成所需的濃度范圍與完全抑制HeLa 細(xì)胞生長所需的最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值較為一致[15]。

1.2 NCS 通過調(diào)節(jié)AMPK-ULK1 信號軸以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬依賴性細(xì)胞凋亡

使用MTT 法測定NCS 對MCF-10A 乳腺細(xì)胞和一組乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-483、BT-549 以及 HCC1937）的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果顯示NCS 不影響MCF-10A 細(xì)胞的增殖，但可顯著抑制其它所有乳腺癌細(xì)胞的增殖，尤其是HCC-1937 和MDA-MB-231 細(xì)胞。這表明NCS 對乳腺癌細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒作用。另外，在HCC-1937 和MDA-MB-231 細(xì)胞中，NCS 能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[16]。

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是預(yù)后最差的乳腺癌亞型之一，具有對化療反應(yīng)差、侵襲性和轉(zhuǎn)移可能性高的特點(diǎn)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，NCS 以劑量依賴性方式抑制TNBC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡。體內(nèi)外研究結(jié)果表明，NCS 通過調(diào)節(jié)AMPK-ULK1 信號通路從而抑制TNBC 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)自噬依賴性細(xì)胞凋亡[16]。

1.3 NCS 通過靶向STAT3 抑制乳腺癌細(xì)胞

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）被認(rèn)為是一個潛在的抗腫瘤藥物治療靶點(diǎn)。研究顯示，在廣泛的人類惡性腫瘤中，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胰腺癌等，STAT3 被持續(xù)或過度激活，并且與不良的臨床預(yù)后有關(guān)[17-18]。研究顯示，NCS 可以靶向MCF-7 細(xì)胞中STAT3 并抑制其磷酸化，而不影響STAT3 的總蛋白。然而，在他莫昔芬耐藥的MCF-7/TR 細(xì)胞中，NCS 不僅抑制STAT3 的磷酸化，而且還通過蛋白酶體途徑降解STAT3 總蛋白，顯示出更好的細(xì)胞毒性。此外，另有研究揭示NCS 靶向STAT3 并抑制其在MCF-7 細(xì)胞中的磷酸化和活化，并通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）依賴性蛋白酶體途徑促進(jìn)STAT3 總蛋白降解[19]。

1.4 NCS 通過下調(diào)CDC2 表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）是細(xì)胞分裂周期基因（cell division cycle gene 2，CDC2）的表達(dá)產(chǎn)物，通過與細(xì)胞周期蛋白Cyclin B 結(jié)合從而激活自身的激酶活性。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，CDK1 與周期蛋白Cyclin B 結(jié)合形成有絲分裂促進(jìn)因子（mitosis-promoting factor，MPF）發(fā)揮蛋白激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞周期的G2-M 期的轉(zhuǎn)換。研究結(jié)果表明，NCS 對人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用是通過抑制CDC2 的表達(dá)并阻滯細(xì)胞周期于G2/M 期實(shí)現(xiàn)的[20]。

1.5 NCS 通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase，Topo）Ⅰ抑制乳腺癌細(xì)胞

DNA 復(fù)制過程中雙鏈被分離，這種分離導(dǎo)致在復(fù)制叉之前形成DNA 正超螺旋，并在其后面形成子鏈DNA 相互纏繞[21-22]。如果形成的正超螺旋得不到松弛，復(fù)制叉的進(jìn)展將受到阻礙，而未能重新連接的子鏈則會阻止細(xì)胞分裂的必要條件-基因組分離[23]。Topo 是負(fù)責(zé)控制DNA 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的重要蛋白質(zhì)，它不僅能有效地解決DNA 的拓?fù)鋯栴}，釋放DNA 正負(fù)超螺旋的堿基張力，還能讓DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等細(xì)胞的基本生命活動順利進(jìn)行。有研究結(jié)果表明NCS 可與細(xì)胞Topo I的酶活性中心Ⅲ區(qū)域結(jié)合，阻礙Topo I 與DNA 結(jié)合，繼而作為阻遏劑抑制Topo I 功能，導(dǎo)致DNA損傷[20]。

2 NCS 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

NCS 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附與侵襲。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）中MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9 和MMP-13是結(jié)腸癌預(yù)后不良的標(biāo)志物[24]。這些蛋白質(zhì)中的每一種都消化細(xì)胞外基質(zhì)的一種成分，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)滲和外滲[25-26]。具體來說，MMP-1 和MMP-13 是膠原酶，MMP-2 是明膠酶，MMP-7消化多種蛋白質(zhì)，包括膠原蛋白、明膠、層粘連蛋白、蛋白聚糖、纖連蛋白和彈性蛋白等。MMP-1 還會誘導(dǎo)與EMT 和轉(zhuǎn)移相關(guān)的PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)[27]。研究顯示，NCS（0.08μM）顯著減少了兩種細(xì)胞系（HCT-116 和LoVo 細(xì)胞）中MMP-1，MMP-2 和MMP-7 的分泌[28]。

細(xì)胞因子水平是結(jié)直腸癌患者總體或無病生存的預(yù)測因子，特別是白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2），白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6），白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8），趨化因子配體-4（chemokine ligand-4，CCL-4），趨化因子配體-22（chemokine ligand-22，CCL-22），F(xiàn)ms 相關(guān)酪氨酸激酶3 配體（fms-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)LT3L），γ 干擾素（interferon-γ，IFNγ），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和五聚蛋白3（Pentraxin 3）。重要的是，除了腫瘤微環(huán)境和炎癥外，IL-6 和IL-8 在促進(jìn)結(jié)直腸癌遷移和轉(zhuǎn)移過程中也起著至關(guān)重要的作用[29-31]。數(shù)據(jù)表明，NCS 會減少與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)蛋白Pentraxin 3 和VEGF 的表達(dá)。

3 NCS 抑制胃癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

為了研究NCS 對胃癌細(xì)胞的影響，有學(xué)者[32]對中等和低分化型的BGC-823 和SGC-7901 胃癌細(xì)胞株，高度分化的MGC-803 和MKN28 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NCS 可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，并顯示劑量和時間依賴性的特點(diǎn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，其促進(jìn)自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ），自噬相關(guān)蛋白-5（autophagy related protein-5，Atg-5）和Beclin-1 的水平，降低了自噬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白p62 的表達(dá)，并增加了自噬流[32]。

細(xì)胞自噬是在自噬相關(guān)基因控制下使用溶酶體降解受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，這是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制[33-34]。一方面，自噬可以更好地幫助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)外部壓力并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲以及增強(qiáng)其耐藥性[35-36]。另一方面，當(dāng)自噬持續(xù)激活時，它可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬死亡[37-38]。研究表明，Akt/mTOR 信號傳導(dǎo)通路與自噬密切相關(guān)[39-40]。NCS 能顯著抑制胃癌細(xì)胞中AKT 和mTOR 的磷酸化，但不影響Akt 和mTOR總蛋白的表達(dá)水平；并且NCS 是通過抑制胃癌細(xì)胞中Akt/mTOR 通路從而誘導(dǎo)自噬、促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，最終抑制胃癌細(xì)胞增殖[32]。

4 NCS 抑制黑色素瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

因?yàn)楹谏亓鰧Υ俚蛲龃碳び袃?nèi)在的抵抗力，所以對輔助治療的反應(yīng)率很低。有研究表明[41]，NCS 通過靶向真核翻譯延伸因子（eukaryotic translation elongation factor 1A，eEF1A），可以部分地克服這種抗性。在黑色素瘤細(xì)胞系中，NCS 對細(xì)胞生長抑制的IC50值在30～100 nm 之間，但對正常的非癌細(xì)胞的生長影響較小。在無毒劑量下，NCS 可顯著提高大腦中攜帶轉(zhuǎn)移性抗凋亡黑色素瘤異種移植物的小鼠的存活率。50 nM 的NCS 靶向eEF1A 誘導(dǎo)明顯的肌動蛋白細(xì)胞骨架解體，導(dǎo)致胞質(zhì)分裂受損和蛋白質(zhì)合成受損（延伸和啟動步驟）[41]。

5 NCS 抑制多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

有研究發(fā)現(xiàn)，NCS 對人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞抑制作用，這種抑制作用與NCS 對有絲分裂率的明顯抑制以及有絲分裂持續(xù)時間顯著增加有關(guān)[42]。

研究表明，NCS 處理可增加細(xì)胞質(zhì)中含肌動蛋白的應(yīng)激纖維的數(shù)量和厚度。各項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)NCS 處理后的絲切蛋白（Cofilin），其磷酸化的增加至少維持了3 h。Cofilin，是主要LIM 結(jié)構(gòu)域激酶（lim kinase，LIMK）的底物[43-44]，不僅是Rho激酶（rho-associated kinase 1，ROCK1）也是磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的下游效應(yīng)器。最近的研究表明，Cofilin 途徑的總體活性決定了腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性表型[45]。蛋白印跡結(jié)果表明，100 nmol/L NCS 可顯著并迅速增加GL19 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、ROCK1 以及磷酸化LIMK1/2 的表達(dá)。瞬時激活RhoA 后，可誘導(dǎo)細(xì)胞中應(yīng)力纖維和粘附復(fù)合物的形成，而各種Rho 亞型也與細(xì)胞遷移有關(guān)[46]。Rho GTP 酶家族還參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周期控制和基因表達(dá)[47]。因此，通過評估NCS 對RhoA 的影響，發(fā)現(xiàn)它明顯增加了RhoA 在人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的活性。

以上研究證明，NCS 對人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞抑制作用是由于NCS 對Rho/ROCK/LIMK/cofilin 信號通路的調(diào)節(jié)導(dǎo)致肌動蛋白應(yīng)激纖維穩(wěn)定性和增殖灶粘附的增加[42]。

6 NCS 抑制口腔癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

NCS 可抑制人口腔癌細(xì)胞的運(yùn)動，NCS 處理24 h 后的3 種細(xì)胞系（SAS、SCC-47、SCC-9）的運(yùn)動能力降低是呈劑量依賴性的，并且NCS 對SAS和SCC-47 細(xì)胞系的影響大于SCC-9 細(xì)胞系。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過NCS 的處理，細(xì)胞上皮標(biāo)志物ZO-1 升高，但間充質(zhì)標(biāo)志物β-連環(huán)蛋白和N-鈣粘蛋白減少。該研究證明了NCS 通過調(diào)節(jié)EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）從而抑制口腔癌細(xì)胞的遷移以及侵襲[48]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑是將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的關(guān)鍵信號級聯(lián)。MAPK 相關(guān)蛋白參與細(xì)胞凋亡、增殖、自噬和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)[49]。有研究發(fā)現(xiàn)，在SAS 和SCC-47 細(xì)胞中，用高劑量的NCS 處理后，口腔癌細(xì)胞中磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）下調(diào)，而用不同劑量的NCS 處理后，磷酸化p38和磷酸化c-Jun 氨基端激酶（c-jun n-terminal kinase，JNK）則上調(diào)。為研究ERK、p38 和JNK與NCS 抑制細(xì)胞遷移之間的相關(guān)性，該研究在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中使用ERK 抑制劑（U0126）、p38 抑制劑（SB203580）和 JNK 抑制劑（SP600125）。結(jié)果表明，U0126 而非 SB203580 或 SP600125 可與NCS 聯(lián)合對抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。以上研究表明，NCS可通過抑制ERK 信號通路從而抑制口腔癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。同時該研究還發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶（Cathepsin，CTSB）參與NCS 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的抗轉(zhuǎn)移作用[48]。

7 NCS 抑制原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）是一種侵襲性疾病，屬于非霍奇金淋巴瘤的一種亞型，用常規(guī)化療治療時預(yù)后極差。Gopalakrishnan R 等[50]發(fā)現(xiàn)NCS 在低納摩爾濃度下對PEL 表現(xiàn)出選擇性細(xì)胞毒性，并且伴隨著多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adp-ribose polymerase，PARP）的裂解、半胱氨酸蛋白酶-3/7（caspase-3/7）的激活和膜聯(lián)蛋白表面表達(dá)的增加，NCS 在G1 期阻止細(xì)胞周期進(jìn)程并在PEL 中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NCS 處理既不誘導(dǎo)PEL 中KAPOSI 氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）反式激活因子RTA（ORF50 ）蛋白（KSHVRTA/ORF50）的表達(dá)，也不誘導(dǎo)PEL 中感染性KSHV 病毒粒子的產(chǎn)生。MYC 基因是一種屬于編碼核蛋白的癌基因，調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活動，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、增殖、分化和凋亡。MYC 在許多癌癥中失調(diào)，并且與幾乎三分之一的癌癥有關(guān)[51]。盡管細(xì)胞中MYC 基因組位點(diǎn)在PEL 中結(jié)構(gòu)完整，卻存在MYC 的過度表達(dá)。有研究已經(jīng)證明下調(diào) MYC 表達(dá)的化合物對PEL 有效且具有選擇性[52]。在Gopalakrishnan R 等[50]的研究中測試了NCS 及其結(jié)構(gòu)類似物對包含5 種血液惡性腫瘤的一組細(xì)胞系（BC-1、BC-3、BCBL-1、JSC-1、BCP-1、VG-1、APK-1、UMPEL-1、UMPEL-3、DG-75、L428、L1236、MM1S、U266、RS4-11）的影響，結(jié)果表明，雖然以上所有癌細(xì)胞系都對NCS 及其結(jié)構(gòu)類似物敏感，但PEL 衍生細(xì)胞系（BC-1、BC-3、BCBL-1、JSC-1、BCP-1、VG-1、APK-1、UMPEL-1、UMPEL-3）對NCS 及其結(jié)構(gòu)類似物更加敏感。該研究還進(jìn)一步證明了NCS 對PEL 的抑制活性與其下調(diào) MYC 的能力有關(guān)。

8 小結(jié)

作為一種體外強(qiáng)效抗腫瘤藥物，NCS 具有選擇性高、作用廣泛的特點(diǎn)，是理想的抗腫瘤候選藥物。在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，NCS 能阻滯腫瘤細(xì)胞周期，同時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬，并且抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。其抗腫瘤效果是多方面多路徑協(xié)同作用的，然而NCS 影響各通路的相關(guān)性并未明確闡述。同時，目前其體內(nèi)抗腫瘤活性及確切的作用靶點(diǎn)還有待深入研究。對NCS抗腫瘤的不同機(jī)制以及作用靶點(diǎn)的探索將有利于開拓抗腫瘤藥物研發(fā)的新方向。

綜上所述，NCS 具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性，具備一定的臨床應(yīng)用價值和潛力，但根據(jù)國內(nèi)外有關(guān)NCS 的研究，其體內(nèi)研究不夠深入。因此，目前仍然需要更多的研究考察NCS 的體內(nèi)抗腫瘤活性以及安全性。