HK2 和VDAC1 在二乙酰嗎啡致心肌細(xì)胞凋亡中的作用

肖錦玲 ，管雅玲 ，朱森森 ，莊夢(mèng)婕 ，蘇麗萍 ，蒲紅偉

（1）新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830011;2）新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;3）學(xué)科建設(shè)科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830011）

目前，藥物濫用仍然是一個(gè)全球性的問(wèn)題。二乙酰嗎啡是一種阿片類激動(dòng)劑，因其止痛效果和欣快感而經(jīng)常被濫用[1]。研究表明，凋亡過(guò)度可引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂及功能障礙[2]。吸食或注射二乙酰嗎啡會(huì)損傷心血管系統(tǒng)，使心臟正常生理功能發(fā)生障礙，其機(jī)制可能與心肌凋亡有關(guān)[3]。

己糖激酶（hexokinase，HKs）是一種進(jìn)化上保守的酶，可以磷酸化六碳糖。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是HKs 之一，主要存在于脂肪、骨骼肌和心肌等胰島素敏感組織中[4]，其功能之一是直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是防止細(xì)胞器損傷和維持細(xì)胞凋亡后活力的潛在靶點(diǎn)[5]。電壓依賴性陰離子通道1（voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）是已鑒定的三種哺乳動(dòng)物亞型中最豐富的，它不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，還介導(dǎo)Ca2+和ROS 等離子在線粒體和細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移[6]，并可釋放凋亡相關(guān)因子進(jìn)入胞漿，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。Fan 等[8]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的重要成員HK2 可以通過(guò)與VDAC1 結(jié)合并保持其開(kāi)放構(gòu)象來(lái)交換ATP/ADP，從而維持mPTP 的完整性，防止細(xì)胞凋亡，提示HK2 和VDAC1 存在相互作用關(guān)系。目前HK2 和VDAC1 在腫瘤中得到廣泛研究，而在二乙酰嗎啡致心肌細(xì)胞凋亡中的作用仍不清楚。本研究初步探討HK2 和VDACl 在二乙酰嗎啡致大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用，為進(jìn)一步探索二乙酰嗎啡導(dǎo)致的心臟損傷提供新的防治靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40 只SPF 級(jí)SD 大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量（220±30）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（新）2018-0002，實(shí)驗(yàn)已通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（20 200 320-145）。

1.1.2 藥品與試劑二乙酰嗎啡粉劑，純度：90%以上，由新疆維吾爾自治區(qū)禁毒總隊(duì)提供。HK2、VDAC1、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白基因（Bcl-2 associated X protein，Bax）、β-肌動(dòng)蛋白（Betaactin，β-actin）抗體，均由英國(guó)Abcam 公司生產(chǎn)。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B-cellymphoma-2，Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cysteinylaspartate specific proteinase-3，Caspase-3）抗體，均購(gòu)自中國(guó)Abclonal 公司。Total RNA Kit I 試劑盒，中國(guó)北京諾博萊德科技有限公司生產(chǎn)。TUNEL 試劑盒，美國(guó)Roche 公司生產(chǎn)。LDH 和GOT 試劑均購(gòu)自中國(guó)索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；BX43 熒光顯微鏡，日本Olymplus 公司產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、二乙酰嗎啡成癮模型構(gòu)建SD大鼠隨機(jī)分為3 組，分別為正常組（Control）、模型組（Model）、模型+10 D 組（Model+10 D）。參照Min Ji[9]的方法，首次皮下注射二乙酰嗎啡劑量為 5 mg/kg，以后逐日劑量遞增法[遞增劑量2.5 mg/（kg·d）] 建立二乙酰嗎啡成癮大鼠模型。模型建立成功后，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)遞增劑量至第10 天，進(jìn)一步建立二乙酰嗎啡成癮+10 D 模型。

1.2.2 ELISA 檢測(cè)LDH、GOT 含量給藥結(jié)束后，腹主動(dòng)脈采血，采用ELISA 檢測(cè)各組大鼠血清GOT、LDH 含量，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.3 HE 染色觀察心肌組織病理變化將心臟組織固定后，切片等步驟結(jié)束后，進(jìn)行HE 染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察心臟組織的形態(tài)。

1.2.4 TUNEL 染色檢測(cè)心肌凋亡隨機(jī)抽取6 張心肌組織石蠟切片，烤片脫蠟等步驟結(jié)束后，PBS 洗2 次，配置蛋白酶K∶PBS=1∶200 覆蓋于組織（常溫，15～30 min），PBS 洗2 次，蛋白酶K 覆蓋期間可配置TUNEL 反應(yīng)液，反應(yīng)液1∶反應(yīng)液2=1∶9，每張切片50 μL 反應(yīng)液覆蓋即可（37 ℃，1 h），PBS 洗3 次進(jìn)行DAPI 染色（常溫，10 min），最后滴1 滴PBS 在片子上以防干片，熒光顯微鏡下觀察。每張切片在200×視野下隨機(jī)選取3～5個(gè)視野獲取圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞凋亡率為細(xì)胞凋亡數(shù)（紅色）/總細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色）×100%。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)切片標(biāo)本隨機(jī)抽取6 張，EDTA 修復(fù)后，滴加HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 一抗（37 ℃，60 min），隨后滴加通用型二抗（37 ℃，15 min）。每張切片在200×視野下隨機(jī)選取3～5 個(gè)視野獲取圖像，Image J 軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量測(cè)量，在細(xì)胞中觀察到棕色反應(yīng)顆粒顯示為陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性信號(hào)的平均光密度值（AOD＝累積光密度值／視野面積）。

1.2.6 RT-qPCR 檢測(cè)心肌組織中相關(guān)基因表達(dá)將小塊心肌組織剪至平底研磨管，放入研磨儀中研磨（3 次，45 s）。提取組織總RNA 后，上機(jī)測(cè)260/280>1.8 時(shí)合成cDNA。后續(xù)按PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以β-actin 作為內(nèi)參，用2－△△Ct法計(jì)算HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)按照心肌組織：RIPA 裂解液=1 mg∶10 μL 比例進(jìn)行勻漿，離心（4 ℃，20 min，12 000 r/min），離心后取上清液，通過(guò)BCA 蛋白定量法（定2 μg/μL）測(cè)定蛋白含量后，每組取蛋白3 μL 進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，之后將分離的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5×脫脂奶粉在搖床中進(jìn)行封閉（37 ℃，2 h），一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗常溫孵育1 h，通過(guò)顯色成像并用Image J 軟件分析灰度值做量化分析，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 二乙酰嗎啡對(duì)大鼠心功能的影響

給藥完畢后，與正常組相比，模型組、模型+10 D 組大鼠血清中的LDH、GOT 表達(dá)水平升高（P<0.05），說(shuō)明損傷隨二乙酰嗎啡干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而呈遞增趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組LDH、GOT 表達(dá)水平（，n=6）Fig.1 LDH and GOT levels in each group（，n=6）

2.2 二乙酰嗎啡對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)的影響

正常組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌間質(zhì)輕微水腫但未見(jiàn)炎性細(xì)胞，心肌組織形態(tài)學(xué)正常；模型組出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞核散落在細(xì)胞外現(xiàn)象或細(xì)胞核固縮、溶解現(xiàn)象明顯，炎癥浸潤(rùn)，肌原纖維絲局部出現(xiàn)斷裂；隨著加藥時(shí)間的延長(zhǎng)，模型+10 D 組的形態(tài)變化比模型組更加明顯，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞破碎嚴(yán)重，肌原纖維絲排列紊亂并且斷裂增多，見(jiàn)圖2。

2.3 TUNEL 染色檢測(cè)二乙酰嗎啡對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與正常組相比，模型組和模型+10 D 組陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（×200）Fig.3 Apoptosis of cardiomyocytes in each group of rats（×200）

2.4 二乙酰嗎啡對(duì)心肌組織中HK2、VDAC1 及相關(guān)凋亡蛋白的影響

與正常組比較，模型組和模型+10 D 組的心肌組織中HK2 和Bcl-2 蛋白AOD 降低（P<0.05），VDAC1、Bax 和Caspase-3 蛋 白AOD 升 高（P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠心肌組織HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)（×200）Fig.4 Expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 protein in rat myocardial tissue（×200）

2.5 二乙酰嗎啡對(duì)心肌組織中HK2、VDAC1 及相關(guān)凋亡基因的影響

與正常組相比，模型組、模型+10 D 組心肌組織中HK2、Bcl-2 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；VDAC1、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá) 上調(diào)（P<0.05），見(jiàn)表1 和圖5。

表1 二乙酰嗎啡對(duì)心肌組織中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）Tab.1 Effects of diamorphine on the mRNA expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in myocardium（，n=6）

表1 二乙酰嗎啡對(duì)心肌組織中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）Tab.1 Effects of diamorphine on the mRNA expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in myocardium（，n=6）

與正常組比較，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。組間比較，#P <0.05。

圖5 大鼠心肌組織HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)（，n=6）Fig.5 Expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 mRNA in rat myocardial tissue（，n=6）

2.6 二乙酰嗎啡對(duì)心肌組織HK2、VDAC1 及相關(guān)凋亡蛋白的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組HK2 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平下降，VDAC1、Bax、Caspase-3 和Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平上升。隨著二乙酰嗎啡干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，趨勢(shì)愈加明顯。上述指標(biāo)，正常組與模型組或與模型+10 D 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 各組心肌組織中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)變化（，n=6）Fig.6 Changes in Protein Expression of HK2,VDAC1,Bax,Bcl-2,Caspase-3,and Cleaved Caspase-3 in Myocardial Tissues of Various Groups（，n=6）

3 討論

近年來(lái)，阿片類藥物使用率逐年上升，海洛因化學(xué)名為二乙酰嗎啡，作為阿片類藥物具有高度成癮性[1]。盡管公眾意識(shí)逐漸加強(qiáng)且出現(xiàn)大量新的合成藥物，但二乙酰嗎啡的吸引力并沒(méi)有減弱。研究表明二乙酰嗎啡對(duì)心血管系統(tǒng)危害極為嚴(yán)重[10]，但目前對(duì)其具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。

杜磊等[11]發(fā)現(xiàn)嗎啡治療急性心肌缺血再灌注大鼠后，大鼠的心臟功能有所恢復(fù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)二乙酰嗎啡干預(yù)后心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、GOT 表達(dá)水平升高，且心肌組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，肌原纖維絲發(fā)生斷裂，這與本研究結(jié)論不一致，考慮可能原因與藥物給藥劑量與給藥時(shí)間長(zhǎng)短不同所致。細(xì)胞凋亡存在于各種細(xì)胞生物中，是一種受促凋亡因子和抗凋亡信號(hào)調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，其生物學(xué)特征是半胱天冬酶的激活[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)二乙酰嗎啡會(huì)降低視網(wǎng)膜組織抗氧化能力，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[13]；二乙酰嗎啡對(duì)大腦產(chǎn)生各種神經(jīng)毒性作用，例如灰質(zhì)喪失、神經(jīng)元凋亡等[14]；以上研究提示二乙酰嗎啡可使組織器官受損并參與細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)建立二乙酰嗎啡成癮模型，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織在二乙酰嗎啡干預(yù)下有不同程度地?fù)p傷，且凋亡率顯著升高，這與劉小山等[15]的研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)二乙酰嗎啡干預(yù)后造成心肌組織損害并發(fā)生凋亡。HK2 作為己糖激酶同工酶之一，主要存在于胰島素敏感組織如脂肪、骨骼肌和心肌[16]。有研究表明，HK2 在某些疾病模型上能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡。Song G 等[17]發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中HK2 的表達(dá)及其活性增加，沉默HK2 可降低促炎因子的產(chǎn)生和細(xì)胞活力，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Kim 等[18]研究表明過(guò)氧化氫可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而預(yù)防HK2 下調(diào)可能挽救心肌細(xì)胞免于凋亡。在哺乳動(dòng)物中，VDAC 有3 種亞型，其中VDAC1 最豐富，它不僅可以控制能量來(lái)源和代謝，還可以調(diào)節(jié)表觀基因組元件和細(xì)胞凋亡[19]，這證明了該蛋白質(zhì)可作為多種病理中的藥物靶點(diǎn)的潛力。Shoshan-BarmatzV 等[20]學(xué)者證明在阿爾茨海默氏病患者的大腦中，表現(xiàn)出高水平的VDAC1，通過(guò)靶向干預(yù)VDAC1 以防止這種促凋亡活性。宋阿北[21]等表明在結(jié)核病中，卡介苗感染能夠引起巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡并導(dǎo)致VDAC1 表達(dá)上調(diào)，敲低VDAC1 后能夠降低細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。凋亡是癌細(xì)胞克服化學(xué)抗性的主要機(jī)制之一，HK2 可通過(guò)在線粒體上表達(dá)并與VDAC1結(jié)合來(lái)抵抗癌細(xì)胞的凋亡[22]。Yuan S 等[23]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素可刺激內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)HK2 減少，促進(jìn)VDAC1 積累。既往研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)與VDACl相結(jié)合，HK2 能夠抑制凋亡，提高其對(duì)化療的抗性[24]。本研究通過(guò)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HK2 和Bcl-2 蛋白AOD 顯著下降，VDAC1、Bax、Caspase-3 蛋白AOD 顯著上升。此外，RT-qPCR和Western blot 結(jié)果顯示在二乙酰嗎啡成癮模型中HK2 mRNA 和蛋白表達(dá)下降，VDAC1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，心肌組織損傷加重且凋亡率增加，蛋白表達(dá)差異更加顯著，這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果相一致，同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)水平下降，促凋亡因子Bax、Clevead Caspase-3 表達(dá)水平升高，進(jìn)一步提示HK2 和VDAC1 參與了二乙酰嗎啡所致的心肌凋亡。

綜上所述，本研究表明HK2 和VDAC1 都有不同程度地改變，其機(jī)制可能與二乙酰嗎啡造成心肌損傷且引起心肌凋亡有關(guān)，這些研究結(jié)果將為二乙酰嗎啡吸入和注射引起的心肌損傷患者的治療和預(yù)防提供了理論依據(jù)。但本研究結(jié)果是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到的驗(yàn)證，并沒(méi)有探討HK2 和VDAC1 之間的作用關(guān)系，其對(duì)凋亡過(guò)程的調(diào)控機(jī)制尚不完善，后續(xù)將進(jìn)一步研究，更好的為之后臨床診斷、治療以及預(yù)后提供新思路。