金屬離子和葡萄糖溶液對(duì)加州鱸精子活力的影響

李永雄，梁瀟，王偉，王茂林，董鑫冉

（大連海洋大學(xué)，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

加州鱸，學(xué)名大口黑鱸（Micropterus salmonides），隸屬于太陽魚科、鱸形目、黑鱸屬，原產(chǎn)于北美洲的淡水水域，是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1]。加州鱸為淡水型食肉魚類，適應(yīng)范圍較廣，且具有生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高、抵抗力強(qiáng)及容易捕撈等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著魚類人工繁殖的開展，許多學(xué)者均對(duì)魚類精子的生物學(xué)進(jìn)行大量的研究，常采用不同溶液作為授精、激活的介質(zhì)，以提高受精率。徐敏[2]研究了不同鹽度和堿度對(duì)3 種鯉形目魚類精子活力和受精率的影響，討論了3 種魚類精子生存的最佳鹽度和堿性的區(qū)間。練青平等[3]研究了不同氯化鈉濃度對(duì)美洲鰣精子活力的影響。張濤等[4]對(duì)高體雅羅魚精子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）、葡萄糖及甘油，可提高高體雅羅魚精子活力，高濃度溶液對(duì)高體雅羅魚精子的激活率呈明顯的抑制作用?，F(xiàn)開展葡萄糖（Glu）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCI）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鎂（MgCl2）對(duì)加州鱸精子活力的影響試驗(yàn)，擬為加州鱸人工繁育提供參考[5]。

1 材料和方法

1.1 時(shí)間與地點(diǎn)

2023年5月11日。試驗(yàn)地位于大連海洋大學(xué)遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)試驗(yàn)室。

1.2 材料

從大連水產(chǎn)品市場購買5 尾性成熟、體表光滑無傷、體格健壯、腹部膨大的加州鱸，充氧運(yùn)輸至試驗(yàn)室內(nèi)，于進(jìn)排水方便、有充氣設(shè)備的水族箱中暫養(yǎng)，水溫為（20±0.5）℃。暫養(yǎng)期間停食，試驗(yàn)期間不注射催情劑。至雄魚腹部較粗糙、膨大輕壓腹部可擠出乳白色精子時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)[6]。試劑為Glu、NaCl、KCI、CaCl2、MgCl2，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)組

Glu、NaCl、KCI、CaCl2、MgCl2，每種試劑均用去離子水配置成5 個(gè)試驗(yàn)組，其濃度分別均為1.0，2.0、3.0，4.0 和5.0 g/L。以去離子水為對(duì)照組。

1.3.2 精液的獲取

用毛巾擦去雄魚生殖孔周圍以及體表水分，按壓腹部兩側(cè)擠出精液，并棄掉第1 滴精液，觀察到精液應(yīng)為乳白色、黏稠的液體，無糞、尿液、血液的污染。

1.3.3 觀察精子活力

使用一次性吸管，吸取1 滴配制完成的溶液于載玻片上，置于已調(diào)好焦距的顯微鏡下，再使用一次性帶針頭的注射器蘸取少許精液與溶液混合，立即觀察記錄其活動(dòng)情況，并使用秒表計(jì)時(shí)（精液與溶液相混合時(shí)開始計(jì)時(shí)）。根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（fast movement time, FT）:精子呈現(xiàn)快速運(yùn)動(dòng)，快到運(yùn)動(dòng)過程看不清路線，只能看到精子呈現(xiàn)“一團(tuán)旋渦”的持續(xù)時(shí)間；壽命時(shí)間（life time, LT）:從精子開始活動(dòng)至大約90%精子死亡的時(shí)間。對(duì)每一種不同濃度的樣品檢測3 次，并求出平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 ρ（Glu）對(duì)精子活力的影響

隨著ρ（Glu）升高，F(xiàn)T 及LT 先升高后降低。ρ（Glu）為0.5 和1.0 g/L 試驗(yàn)組，F(xiàn)T 及LT 均高于對(duì)照組；ρ（Glu）為2.0 和2.5 g/L 試驗(yàn)組，F(xiàn)T 及LT 均低于對(duì)照組。FT 及LT 最長出現(xiàn)在ρ（Glu）為1.0 g/L 試驗(yàn)組，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 加州鱸精子在不同ρ（Glu）中的活力①

2.2 ρ（Ca2+）對(duì)精子活力的影響

隨ρ（CaCl2）升高，F(xiàn)T 及LT 均先升高后降低。ρ（CaCl2）為3.0 g/L 試驗(yàn)組FT 最長，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），ρ（CaCl2）為4.0 和5.0 g/L 試驗(yàn)組，F(xiàn)T 則小于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。各試驗(yàn)組LT 均高于對(duì)照組，其中ρ（CaCl2）為3.0 g/L 試驗(yàn)組，LT 最長且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他試驗(yàn)組則差異不顯著（P＞0.05），見表2。

表2 加州鱸精子在不同ρ（CaCl2）中的活力②

2.3 ρ（K+）濃度對(duì)精子活力的影響

隨ρ（KCl）升高，F(xiàn)T 及LT 均先升高后降低。ρ（KCl）為3.0 g/L 試驗(yàn)組FT 最長，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），ρ（KCl）為5.0 g/L 試驗(yàn)組FT 則小于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。各試驗(yàn)組LT 均高于對(duì)照組，其中ρ（KCl）為3.0 g/L 試驗(yàn)組，LT 最長，但差異不顯著（P＞0.05），見表3。

表3 加州鱸精子在不同ρ（KCl）中的活力③

2.4 ρ（Mg2+）對(duì)精子的影響

隨ρ（MgCl2）升高，F(xiàn)T 及LT 均呈逐漸降低趨勢。各試驗(yàn)組加州鱸FT 均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中在ρ（MgCl2）為6.0 g/L 試驗(yàn)組最低。各試驗(yàn)組加州鱸LT 均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中在ρ（MgCl2）為4.0 g/L 試驗(yàn)組最低，見表4。

表4 加州鱸精子在不同ρ（MgCl2）中的活力④

2.5 ρ（Na+）對(duì)精子的影響

隨ρ（NaCl）升高，F(xiàn)T 及LT 均先升高后降低。ρ（NaCl）為3.0 g/L 試驗(yàn)組FT 最長，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；ρ（NaCl）為5.0 g/L 試驗(yàn)組FT 則小于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。ρ（NaCl）為3.0 g/L試驗(yàn)組LT 最長，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；ρ（NaCl）為4.0 和5.0 g/L 試驗(yàn)組LT 則小于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05），見表5。

表5 加州鱸精子在不同ρ（NaCl）中的活力⑤

3 討論

Glu 是精漿中碳水化合物重要組成部分。宋勇等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鯉精子在ρ（Glu）為1.5 g/L 時(shí)，LT 比在最佳濃度的NaCI 溶液中，壽命長約350 s。丁淑荃等[10]研究發(fā)現(xiàn)，加入適量Glu 后，能夠明顯延長蛇精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。本試驗(yàn)中，Glu 在一定濃度范圍內(nèi)，可提升加州鱸精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，延長精子壽命，高出一定濃度，會(huì)抑制精子活力。在ρ（Glu）為1.0 g/L 時(shí)，F(xiàn)T 及LT 均最長，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

魚類精漿中一般富含K+、Na+、Ca2+和Mg2+等，這些離子在精漿與水中含量的差異被認(rèn)為是精子激活的直接動(dòng)力[11]。羅明坤等[12]研究表明，低濃度的K+更適宜激活薩羅羅非魚精子。本試驗(yàn)中，ρ（KCl）為3.0 g/L 試驗(yàn)組FT 最長，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。K+、Na+同為單價(jià)陽離子，其化學(xué)性質(zhì)相近；KCl、NaCl溶液對(duì)加州鱸精子活動(dòng)影響的規(guī)律相似，F(xiàn)T 和LT也接近。也許是K+增強(qiáng)精子活動(dòng)的另一種方式，即在對(duì)抗較高滲透壓的抑制作用的同時(shí)，保持精子最佳活動(dòng)狀態(tài)[8]。

本試驗(yàn)中，Ca2+對(duì)加州鱸精子作用效果變化顯著，當(dāng)ρ（Ca2+）為3.0 g/L 時(shí)，F(xiàn)T 和LT 均達(dá)峰值，隨Ca2+濃度的持續(xù)增加，精子活力和激活率逐漸降低，精子活動(dòng)受到明顯抑制。高濃度的Ca2+對(duì)加州鱸精子有一定損傷，其原因可能是CaCl2溶液中的Ca2+濃度高于精漿中的Ca2+濃度，引起精子內(nèi)部發(fā)生變化，導(dǎo)致活力下降。Mg2+對(duì)加州鱸精子抑制作用的原理同Ca2+相似。Ca2+和Mg2+是水質(zhì)硬度評(píng)價(jià)的指標(biāo)，一般在魚類人工授精過程中，需提前檢測水體中Ca2+和Mg2+濃度，以提高受精率[13]。本試驗(yàn)表明，適宜濃度的Glu、K+、Na+、Ca2+，對(duì)加州鱸精子活力有促進(jìn)作用，Mg2+則有抑制作用。因此，可通過調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體Glu 及相關(guān)離子濃度，以激活加州鱸精子活力，提高受精率，其中Glu、K+、Na+及Ca2+較適宜的濃度分別為1.0，3.0，3.0 和3.0 g/L。