肝細(xì)胞癌雙硫死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

方 霞，孫江云，袁豐華

（1. 贛南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2. 贛南醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

肝癌是全球范圍內(nèi)常見的癌癥，具有快速生長(zhǎng)、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及高死亡率等特點(diǎn)，主要的病理類型為肝細(xì)胞癌［1］。目前，肝癌最主要的治療策略仍然是根治性切除［2］。由于肝細(xì)胞癌發(fā)病隱匿且進(jìn)展迅速，多數(shù)患者在診斷時(shí)已為晚期，導(dǎo)致治療難度增加，且治療效果差［3］。盡管存在一些治療方法，如經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、射頻熱消融和靶向藥物（如索拉非尼），用于治療晚期且無法進(jìn)行手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌患者，但這些方法療效較差［4］。因此，迫切需要在現(xiàn)有治療方法的基礎(chǔ)上尋找更有效的治療靶點(diǎn)或方法，以提高肝細(xì)胞癌治療的療效并改善患者預(yù)后。

調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡是一種經(jīng)過精確調(diào)控的正常細(xì)胞死亡過程，在維持組織穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤發(fā)展中起重要作用［5-6］。然而，當(dāng)細(xì)胞死亡調(diào)控失衡或異常時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤形成。腫瘤細(xì)胞通過突變或異常表達(dá)凋亡調(diào)控因子（如p53）逃避細(xì)胞凋亡的觸發(fā)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖［7］。雙硫死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的涉及多種代謝途徑的細(xì)胞死亡方式，它與已知的鐵死亡和銅死亡不同，是溶質(zhì)載體家族7成員11（Solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞在葡萄糖饑餓環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)的二硫化物含量異常增加，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架中二硫鍵含量增加，進(jìn)而引發(fā)肌動(dòng)蛋白絲過度收縮，最終破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的過程［8］。這種細(xì)胞死亡方式可能會(huì)成為靶向抑制腫瘤的新方法。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，LncRNA）是指核苷酸分子大于200的RNA，不具備編碼功能，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理和病理過程［9］。LncRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起著至關(guān)重要的作用。研究表明，LncRNA 在肝細(xì)胞癌中異常表達(dá)，通過與其他蛋白質(zhì)或RNA 相互作用，影響腫瘤細(xì)胞增殖和死亡［10］。例如LncRNA HEPPAL 通過降低SLC7A11 表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的鐵死亡［11］。目前，雙硫死亡相關(guān)的LncRNA 在肝細(xì)胞癌中的作用研究較少。本文利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選與HCC 預(yù)后有關(guān)的雙硫死亡LncRNA，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型，并驗(yàn)證該模型的可行性，為尋找與雙硫死亡相關(guān)的生物學(xué)靶點(diǎn)以及進(jìn)一步研究雙硫死亡相關(guān)LncRNA 在HCC中的生物學(xué)作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和處理 從癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc. cancer. gov/）獲取肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集的RNA-seq和相關(guān)臨床信息數(shù)據(jù)，包括50 例正常樣本和374 例腫瘤樣本，提取HCC 的mRNA 和LncRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)，從相關(guān)文獻(xiàn)中得到10 個(gè)雙硫死亡相關(guān)基因包括：GYS1、NDUFS1、OXSM、LRPPRC、NDUFA11、NUBPL、NCKAP1、RPN1、SLC3A2、SLC7A11［8，12-13］，提取雙硫死亡基因的表達(dá)量，使用Limma 包進(jìn)行共表達(dá)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Pearson 相關(guān)性系數(shù)|cor|＞0.4和P＜0.001。

1.2 構(gòu)建并驗(yàn)證HCC 雙硫死亡相關(guān)LncRNA 的預(yù)后模型 對(duì)TCGA 肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，保留HCC 患者的年齡、性別、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、腫瘤分級(jí)、分期，去除生存狀態(tài)和生存時(shí)間未知的樣本，并將表達(dá)數(shù)據(jù)與生存數(shù)據(jù)進(jìn)行整合。使用Caret 包將HCC 數(shù)據(jù)按1∶1 隨機(jī)分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，在訓(xùn)練集中進(jìn)行單因素Cox 回歸分析（P＜0.05），Glmnet 包［14］進(jìn)行LASSO 回歸分析，用多因素Cox回歸構(gòu)建模型。計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)值公式為：score=∑i=1n Coef i*xi，其中xi和Coef i分別代表每個(gè)樣品的LncRNA 表達(dá)量和風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)。根據(jù)訓(xùn)練集中風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)將OS 患者分成高、低風(fēng)險(xiǎn)組，并在驗(yàn)證集和整個(gè)數(shù)據(jù)集中進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，使用survminer 包［15］繪制生存曲線、受試者工作特征（ROC）曲線和C 指數(shù)（C-index）評(píng)估模型的可行性，scatterplot3d 包進(jìn)行主成分分析（PCA），評(píng)估分組的效果。運(yùn)用單因素和多因素Cox回歸評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否為獨(dú)立預(yù)后因素。

1.3 高、低風(fēng)險(xiǎn)組基因的功能富集分析 使用clusterProfiler 包［16］對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異基因進(jìn)行GO和KEGG 富集分析，并對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組的基因進(jìn)行GSEA 功能富集分析，探究這些基因在HCC 中參與的生物學(xué)功能，過濾條件為P＜0.05。

1.4 高、低風(fēng)險(xiǎn)組基因的免疫細(xì)胞功能及免疫治療效果分析 使用GSVA 和GSEABase 包計(jì)算不同風(fēng)險(xiǎn)組之間免疫功能的差異，并從癌癥免疫圖譜（TCIA）數(shù)據(jù)庫（https：//tcia. at/home）獲得免疫治療評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫治療效果。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建HCC 雙硫死亡相關(guān)LncRNA 的預(yù)后模型 提取TCGA 肝細(xì)胞癌RNA-Seq 數(shù)據(jù)中mRNA 和LncRNA，得到13 162 個(gè)LncRNA，利用Pearson 相關(guān)性分析13 162 個(gè)LncRNA 和10 個(gè)雙硫死亡相關(guān)基因，得到320 個(gè)雙硫死亡相關(guān)的LncRNA，未發(fā)現(xiàn)與OXSM相關(guān)的LncRNA（圖1A）。隨后，利用雙硫死亡LncRNA 構(gòu)建預(yù)后模型，使用Caret 包將TCGA 肝細(xì)胞癌患者樣本劃分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行單因素Cox 回歸分析（P＜0.05）得到了40 個(gè)與HCC 預(yù)后相關(guān)的雙硫死亡LncRNA（圖1B），使用LASSO 回歸和多因素Cox 回歸分析進(jìn)一步篩選，最終得到6 個(gè)雙硫死亡相關(guān)LncRNA（ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR、AL161645.1 和AC069307.1）（圖1C、圖1D）。

圖1 HCC雙硫死亡相關(guān)LncRNA的預(yù)后模型

2.2 評(píng)估HCC 雙硫死亡相關(guān)LncRNA 的預(yù)后模型效果 使用Kaplan-Meier（K-M）生存曲線分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后情況，結(jié)果顯示，在整個(gè)數(shù)據(jù)集、訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中，總體生存期（Overall survival，OS）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存期比低風(fēng)險(xiǎn)組的總生存期短（圖2A、圖2B、圖2C）。此外，對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布圖（圖2D、圖2E、圖2F）和生存狀態(tài)散點(diǎn)圖（圖2G、圖2H、圖2I）顯示，隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分增加的患者死亡逐漸增加。 風(fēng)險(xiǎn)熱圖結(jié)果表明，ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR 在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)，而AL161645.1 和AC069307.1 在高風(fēng)險(xiǎn)組中低表達(dá)（圖2J、圖2K、圖2L）。

單變量和多變量Cox 回歸分析評(píng)估模型的臨床意義，結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤分期是臨床獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05）（圖3A、圖3B）。ROC 曲線結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在AUC 值上明顯優(yōu)于其他臨床特征（圖3C）。在1 年、3 年和5 年的時(shí)間點(diǎn)上，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC 曲線下面積分別為0.745、0.709 和0.735（圖3D）。相比其他臨床因素，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的C 指數(shù)值更高（圖3E）。此外，通過主成分分析結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)模型中LncRNA 雙硫死亡基因的表達(dá)具有更分散的分布特征（圖3F、圖3G、圖3H、圖3I），說明該模型中將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組質(zhì)量較好。

圖3 評(píng)估HCC雙硫死亡相關(guān)LncRNA預(yù)后模型臨床效果

2.3 高、低風(fēng)險(xiǎn)組基因的功能富集分析 對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，GO 富集分析顯示，生物學(xué)過程主要富集在外部封裝結(jié)構(gòu)組織，細(xì)胞組分主要富集在含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)，分子功能主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)成分（圖4A），KEGG 主要富集在PI3K/AKT 信號(hào)通路（圖4B）。此外，對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體途徑（圖4C），而低風(fēng)險(xiǎn)組主要富集在藥物代謝細(xì)胞色素p450途徑（圖4D）。

2.4 高、低風(fēng)險(xiǎn)組基因的免疫細(xì)胞功能分析 通過GSEABase 包分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫功能之間的差異，結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組抗原呈遞細(xì)胞共刺激（APC_CO_stimulation）、趨化因子受體（CCR）、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類呈遞（MHC_class_Ⅰ）、副炎癥（Parainflammation）和輔助性T細(xì)胞2（Th2）的表達(dá)高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5），高風(fēng)險(xiǎn)組的TIDE 評(píng)分高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖6）。

圖5 基因免疫細(xì)胞功能分析

圖6 TIDE評(píng)分比較

3 討論

肝細(xì)胞癌是一種常見的惡性腫瘤，具有快速生長(zhǎng)、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及高死亡率等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命健康［17］，雖然很多學(xué)者不斷研究新的治療策略及藥物靶點(diǎn)，但因?yàn)橥砥诟伟┑闹委熛拗菩砸约皩?duì)靶向藥物的耐藥性，治療效果差，患者生存率較低。因此，研究肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找HCC有效的治療靶點(diǎn)對(duì)于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

LncRNA 是一類核苷酸分子長(zhǎng)度大于200 的非編碼RNA，參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)錄后水平的分化等［18］。在細(xì)胞增殖過程中，LncRNA 可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖能力；在細(xì)胞凋亡過程中，通過調(diào)節(jié)與凋亡相關(guān)基因家族（如Bcl-2 家族）的表達(dá)，可改變細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性；在轉(zhuǎn)錄后水平的分化過程中，LncRNA 還可通過影響mRNA 的剪切和修飾影響基因表達(dá)，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能［19］。

目前已有多項(xiàng)研究證明，LncRNA 參與調(diào)節(jié)腫瘤代謝及細(xì)胞信號(hào)通路影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20-21］。LncRNA 在肝癌中表達(dá)異常，促進(jìn)肝癌的惡性增殖及血管生成，且與細(xì)胞的鐵死亡及銅死亡密切相關(guān)［22-23］。雙硫死亡是一種與糖代謝、線粒體呼吸及能量代謝等多個(gè)代謝途徑相關(guān)的細(xì)胞死亡方式。有研究［24］表明，LRPPRC（Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein-1）作為一種參與雙硫死亡的基因，能通過調(diào)控能量代謝途徑影響線粒體自噬。LncRNASNHG17與LRPPRC相互作用，增強(qiáng)c-Myc 蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展［25］。然而雙硫死亡相關(guān)LncRNA 在HCC 中作用研究尚少，具體作用機(jī)制尚不清楚。通過查閱文獻(xiàn)及應(yīng)用共表達(dá)分析得到雙硫死亡相關(guān)LncRNA，并利用單因素Cox回歸、lasso回歸和多因素Cox 回歸構(gòu)建了6 個(gè)雙硫死亡相關(guān)LncRNA 預(yù)后模型，包括ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR、AL161645.1 和AC069307.1。已有研究［26-27］表明，ELFN1-AS1 可促進(jìn)結(jié)腸癌及視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展。MKLN1-AS 在HCC 中高表達(dá)且與患者不良預(yù)后相關(guān)［28］，與本研究結(jié)果一致。CYTOR 可通過調(diào)節(jié)miR-125b-5p/KIAA1522 軸影響肝癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡［29］。其中AL049840.2、AL161645.1 和AC069307.1 的作用尚未有研究報(bào)道。

隨后，為了驗(yàn)證該模型的可行性，應(yīng)用K-M 生存曲線分析得知模型中的高風(fēng)險(xiǎn)組總生存率低于低風(fēng)險(xiǎn)組，在1 年、3 年和5 年的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC 曲線下面積分別為0.745、0.709和0.735，這些值均大于0.65，表明該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，主成分分析及C指數(shù)分析也證明該模型具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。高風(fēng)險(xiǎn)組功能富集分析結(jié)果表明，雙硫死亡相關(guān)LncRNA 功能主要富集在與細(xì)胞外基質(zhì)受體途徑有關(guān)，此途徑已證實(shí)在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成過程中起重要作用［30］。

在免疫功能方面，通過免疫功能差異分析發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組中抗原呈遞細(xì)胞共刺激（APC_CO_stimulation）、趨化因子受體（CCR）、主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類呈遞（MHC_class_Ⅰ）、副炎癥和輔助性T細(xì)胞2（Th2）高表達(dá)，表明雙硫死亡相關(guān)LncRNA 可影響腫瘤免疫功能。并且，高風(fēng)險(xiǎn)組的TIDE 高于低風(fēng)險(xiǎn)組，表明高風(fēng)險(xiǎn)組免疫逃逸潛能大于低風(fēng)險(xiǎn)組，免疫治療效果更差。

雙硫死亡是一種新的細(xì)胞死亡方式，可能成為靶向治療腫瘤的新方法。LncRNA 通過多種形式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本文基于TCGA 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的雙硫死亡相關(guān)LncRNA 預(yù)后模型具有良好預(yù)測(cè)性能，為HCC的臨床治療和研究提供新思路。