用于評價動物社交偏好程度的新方法

伍永鴻 奠雅雯 張天睿 歐文靜 黃喜燕 張明倩 崔 爽 梁五林 張碩峰

(北京中醫藥大學中藥學院,北京,102488)

社交行為障礙是許多神經發育障礙和精神疾病的典型特征,表現為與人交往時(尤其是大眾場合下),會不由自主地感到緊張、害怕,以致手足無措、語無倫次,嚴重的甚至害怕見人,稱為社交恐懼癥、人際恐怖癥[1],并常出現于注意力缺陷多動障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)、抑郁癥、自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder,ASD)等疾病[2]。因此,社交行為的變化就成了判斷精神疾病的標準之一。社交行為亦存在于動物之間,為了在動物模型上研究社交行為的變化,科學家開發出了一系列的行為學實驗,常見的包括嗅覺適應或不適應試驗、鉆管試驗、食物偏好轉變測試、社會偏好或逃避行為測試、三箱社交行為測試(Three-Chambered Social Test,TCT)等[3]。其中,TCT是評價動物社交行為最常用的實驗方法,主要使用大鼠、小鼠,其原理是基于小鼠天生喜群居、對新物體具有探索傾向的特性[4],用于檢測待測動物的社交探索行為、社交識別和社交趨新能力。但由于評價指標多為觀察者主觀記錄,且觀察時間較短,缺乏客觀的技術參數,難以準確、客觀地評價動物的社交程度。考慮到傳統三箱實驗的以上缺陷和不足,故研究者在其原來的基礎上進行了改進,重新區域劃分。本實驗采用ADHD大鼠作為社交障礙模型,以WKY大鼠和Wistar大鼠作為對照組,模型動物采用治療ADHD的臨床常用中成藥小兒黃龍顆粒進行治療,以待測鼠在密切交流區域及有陌生鼠側區域的時間、頻次、路程及比例作為行為學指標,測試該裝置與評價方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級自發性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)24只,雄性,2周齡,體質量45～60 g;SPF級同源正常血壓WKY大鼠8只,雄性,2周齡,體質量45～60 g;SPF級Wistar大鼠8只,雄性,2周齡,體質量45～60 g,均由斯貝福(北京)生物技術有限公司[許可證編號:SCXK(京)2019-0010]提供。動物合格證號:SHR:110324211105414141、11032411106224726,WKY大鼠:110011211111739136、110011211113633112,Wistar大鼠:11032411105414438、110324211106224824。室溫(23±2)℃,相對濕度為65%±5%,給藥前使動物先適應性飼養2 d,自由攝取食水,并且實驗過程中對動物的操作符合醫學動物倫理學標準(動物實驗倫理審批號:BUCM-4-2022110801-4028)。

1.2 藥物 小兒黃龍顆粒:由重慶希爾安藥業有限公司生產,規格5 g/袋,批號:201002。小兒黃龍顆粒臨床人用量為6～9歲,1袋/次,2次/d;10～14歲,2袋/次,2次/d。按12歲體質量32 kg計算,人用量為5 g/32 kg=0.156 25 g/kg。大鼠低劑量用藥量按照人用量的6倍計算,2袋/d,即1.88 g/kg;大鼠高劑量用藥量按照人用量的12倍計算,2袋/d,即3.75 g/kg。

1.3 儀器 AR1140/C型電子分析天平,奧豪斯(上海)公司產品;Ethovision XT 9.0型動物行為跟蹤儀(荷蘭Noldus公司);新三箱社交裝置。

1)立體空間結構圖,裝置的空間結構見圖1。其外側為透明的立方結構(44 cm×44 cm×44 cm),內部由中間塑料板和前側塑料板(其塑料板均不透明)以及里側鐵絲網將該裝置劃分為5個不同的腔室,其各腔室位置和所占區域大小圖中已標明。實驗時,待測動物由入口處進入通道區域1,并可經自由選擇隨機進入區域2或區域3。鐵絲網內側區域被均分為區域4和區域5,作為空白區域和陌生鼠區域。實驗期間,陌生鼠被隨機放置在區域4或5,另一側區域作為空白區域;待測動物可在區域1、2、3內自由活動,并能通過鐵絲網與陌生鼠進行嗅、靠近、接觸等社交行為。

圖1 新三箱裝置立體空間結構

2)俯視區域劃分,利用EthoVision XT 9.0軟件對動物社交行為進行分析時,對采集到的畫面進行區域劃分。見圖2。首先,將通道區域1標記為K區域,并將區域2、3均分為a、b和A、B區域。b、B區域為靠近鐵絲網和內側陌生鼠的區域,待測動物在該區域可與陌生鼠之間發生頻繁接觸、靠近、攀附鐵絲網(企圖靠近)等親密行為,故可視為待測鼠與陌生鼠的密切交流區域,而a、A區域距離內側陌生鼠和空白區域均較遠,動物間的交流減少,通過對交流密切區域和交流稀疏區域的劃分,可以反映動物的真實社交程度,達到對動物社交行為的精確量化與系統評價。最后,將區域4、5在鏡頭下所形成的區域標記為C、D區域,作為陌生鼠區域和空白區域,實驗時將陌生鼠隨機放入C區域。數據統計時,以a+b、b表示有陌生鼠側區域和密切交流區域,其對應空白側的區域分別為A+B、B,基于以上區域劃分,對動物社交行為進行系統分析。

圖2 新三箱裝置俯視區域劃分

1.4 方法

1.4.1 分組 將SHR按體質量隨機分為3組,每組8只,即SHR組、小兒黃龍顆粒1.88 g/kg組、小兒黃龍顆粒3.75 g/kg組,另設WKY大鼠組、Wistar大鼠組作為對照,6只雄性、體質量相似的Wistar大鼠作為社交實驗的陌生鼠。

1.4.2 給藥方法 各給藥物均按1 mL/100 g體質量灌胃給藥,給藥組灌胃用生理鹽水配成的小兒黃龍顆粒溶液,SHR組、WKY大鼠組、Wistar大鼠組灌喂生理鹽水,1次/d,灌胃時間為早上9:00,連續給藥16 d。

1.4.3 檢測方法與指標 在給藥期結束后的第1天進行社交偏好實驗,每組選取1只進行平行實驗,每次4只。實驗時,先在鐵絲網內側的C或D區域隨機放入1只陌生鼠,將待測鼠由入口處放入所改進的三箱實驗裝置中,使其首先適應環境1 min,再觀察30 min,所得視頻文件用Noldus動物行為跟蹤儀Ethovision XT 9.0進行分析。每做完1組后,將鼠取出歸籠,清理裝置內的尿液和糞便,并用乙醇擦拭,消除殘余氣體,再進行下1組測試。檢測指標:1)區域交流時間,待測動物在區域b、區域a+b所待時間,以及不同區域的時間百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。2)區域運動路程,待測動物在區域b、區域a+b所運動的路程,以及不同區域的路程百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。3)區域進出頻次,待測動物進出區域b、區域a+b的頻次,以及不同區域的頻次百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。

1.5 統計學方法 采用IBM SPSS Statistics 20統計軟件處理,所有計量數據以均值表示,各組計量數據先進行正態檢驗和方差齊性檢驗,凡符合正態分布和方差齊性的數據,采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD檢驗;對不符合正態分布和方差齊性的數據,則應用非參數檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對幼年SHR社交時間的影響 通過統計待測鼠在改進的三箱裝置中不同區域所待的時間及時間占比,檢測到WKY大鼠與SHR對陌生鼠的社交偏好程度明顯偏低,表現為在陌生鼠側b區域、a+b區域所待時間顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01),不同區域所待的時間占比如a+b/A+B、b/B、b/a顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01)。小兒黃龍顆粒1.88 g/kg可顯著增加SHR在b區域、a+b區域的所待時間以及a+b/A+B、b/B區域時間占比(與SHR組比較,P<0.05),并能提高b/a區域時間占比。小兒黃龍顆粒3.75 g/kg可不同程度增加SHR上述各指標數值,能明顯增加大鼠在b區域、a+b區域的所待時間以及a+b/A+B區域時間占比。見表1。

表1 小兒黃龍顆粒對幼年SHR社交時間的影響

2.2 對幼年SHR社交移動距離的影響 通過統計待測鼠在所改進的三箱裝置中不同區域所運動的路程及路程占比,檢測到WKY大鼠區域運動路程比例b/a降低,其中在b區域、a+b區域所運動路程以及區域運動路程占比a+b/A+B、b/B顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01)。SHR組上述各項指標數值也降低,其中區域運動路程占比a+b/A+B、b/B顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01)。小兒黃龍顆粒2種劑量組均能不同程度地增加SHR上述各項指標數值,能明顯增加模型大鼠在b區域、a+b區域的運動路程及a+b/A+B、b/B區域運動路程占比(與SHR組比較,P<0.05)。見表2。

表2 小兒黃龍顆粒對幼年SHR社交移動距離的影響

2.3 對幼年SHR社交頻次的影響 通過統計待測鼠在所改進的三箱裝置中不同區域的頻次及頻次占比,與Wistar大鼠組比較,WKY大鼠組在b區域、a+b區域的頻次以及區域頻次比例b/a、b/B降低,尤其是a+b/A+B區域頻次比例顯著降低(P<0.05)。SHR除了在a+b區域的頻次略高于Wistar組大鼠外,其余各指標數值均降低。與SHR組比較,小兒黃龍顆粒1.88 g/kg組大鼠上述各指標數值均增加,尤其是在區域b、區域a+b的頻次及區域頻次比例b/a顯著增加(P<0.05)。小兒黃龍顆粒3.75 g/kg組大鼠的區域頻次比例b/a顯著增加(P<0.05),其余上述各項指標數據均有不同程度的提高。見表3。

表3 小兒黃龍顆粒對幼年SHR社交頻次的影響

3 討論

社交行為障礙是許多神經發育障礙和精神疾病的典型特征,如ADHD、抑郁癥、ASD等[5]。因此評價藥物對實驗動物社交行為的影響,是研發治療這些疾病的新型藥物和揭示社交障礙發生機制的重要研究手段。目前,常用的使用方法包括嗅覺適應或不適應試驗、鉆管試驗、食物偏好轉變測試、社會偏好或逃避行為測試、TCT等。其中TCT以其需要設備簡單,易于操作最為常用[6]。但由于多數指標為觀察者主觀記錄,且觀察時間較短,缺乏客觀的技術參數,難以準確、客觀評價動物的社交情況。

本研究考慮到傳統三箱社交實驗的不足,在原來的空間基礎上做了改進,重新劃分了空間區域和設定了指標。其主要的設計思路和原理:1)傳統三箱實驗以中央室為起始區域,左右兩側分別為空白區域和陌生鼠區域,為長方形立體結構,但由于中央室兩側擋板的遮擋,待測動物在空白區域和陌生鼠區域中的視野暴露不完全,故在本裝置中對其空間布局做了重新規劃,將其改為矩形的立方結構,空白區域和陌生鼠區域由一塊中央擋板隔開,處于整個觀察區域的中央,無視野死角,并可以直接使用Noldus動物行為分析系統對動物的社交行為進行分析。2)本裝置以區域a、b、A、B為指標統計的關鍵區域,其在攝像頭下界限清晰,無視野盲區,通過Noldus動物行為分析系統能準確地統計待測鼠在各區域內的滯留時間、行走路程、出入頻次、運動軌跡等指標。3)在進行區域劃分時,將區域2、3分別均分為a、b區域和A、B區域,因為b、B為靠近鐵絲網與陌生鼠的一側區域,動物間的交流接觸更加頻繁,故作為交流密切區域,而相應的a、A區域則為交流稀疏區域,通過對交流密切區域和交流稀疏區域的劃分,更能反映動物的真實社交情況。4)通過a、b區域的劃分,統計動物在這2區域的出入頻次、滯留時間、行走路程等指標,可以得到動物在局部區域和整體區域的社交情況;整個裝置劃分為a+b、A+B、K3個大區域,待測鼠在有陌生鼠側區域的滯留時間、行走路程及出入頻次比例a+b/A+B值,以及在密切交流區域的滯留時間、行走路程及出入頻次比例b/B值,可以評價動物的社交偏好程度;在有陌生鼠側區域,b區域更加靠近陌生鼠,待測動物與陌生鼠之間交流密切,而a區域距陌生鼠較遠,動物間交流減少,b區域和a區域各指標的b/a值可以反映動物的真實社交活動程度,從而做到更加系統、全面、客觀地評價動物的社交偏好。5)傳統三箱社交實驗的適應環境時間為10 min,觀察時間10 min,而在本實驗中將觀察時間增加到30 min,以保證待測動物能夠與陌生鼠之間充分接觸,自由選擇社交或逃避,使結果能更加真實反映動物的社交偏好程度,增加結果的可靠性和減少偶然誤差。

為了驗證本實驗方法的可行性,我們選擇2周齡的SHR及同源的WKY大鼠、Wistar大鼠的進行測試。SHR起源于東京遠交系Wistar大鼠,是OKAMOTO和AOKI[7]在1963年運用選擇性近親交配法培育的WKY大鼠的基礎上,經過交叉培育而成,因其10周齡后出現高血壓癥狀而得名,常用于高血壓的研究。而4～10周齡的SHR具有活動異常活躍,易沖動,易怒,學習記憶能力差,注意力不集中等特點[8],與人類兒童注意力缺陷多動障礙的癥狀吻合,故而用于ADHD模型大鼠。行為學研究表明其具有較強的活躍性和沖動性,并且由于沖動、多動的特點,易于陌生鼠間產生摩擦,表現出較弱的社交偏好程度,符合社交障礙模型的條件[9]。ADHD俗稱小兒多動癥,是指兒童和青少年期以注意力缺陷、多動、沖動為主要行為特征的神經行為障礙性疾病[10],并常伴隨學習與記憶障礙、品行異常、社交障礙等問題。與正常兒童比較,ADHD患兒更多地表現出焦慮、害羞、退縮,害怕與他人交流,從而影響社會功能的形成與發展[11]。ADHD兒童的社會功能損害發生率高達89.8%[12],在情感因素方面存在困難,例如動機延遲和情緒調節,是兒童社會技能問題的根本基礎[13]。故本實驗選取幼年SHR作為社交行為障礙的模型動物。SHR來源于WKY大鼠,其在10周齡后表現出高血壓的癥狀[14],故在做降壓實驗時常采用正常血壓的WKY大鼠作為SHR的天然對照;且因其比其他品系大鼠自主活動低,在曠場實驗中總運動量下降,在水迷宮實驗中易漂浮不動,故亦常作為ADHD模型SHR曠場實驗時的對照動物[15]。WKY大鼠雖然源自Wistar大鼠,但由于采取了近交維持措施,該品系大鼠已經與原先的Wistar大鼠有了差別,常表現出抑郁樣的特征,在行為學方面表現為主動回避行為增加、對新異物體識別能力低,與臨床中抑郁患者興趣降低、認知功能受損、求生欲下降的特點較為相符,故不適用于用來作為幼年SHR社交行為實驗的對照大鼠[16]。由于SHR、WKY大鼠均源自Wistar品系大鼠,故本研究設Wistar大鼠組,亦作為對照,目的是為了增加與SHR社交障礙行為學特征的可比性,客觀反映SHR社交偏好情況。

本研究結果顯示,與Wistar大鼠組比較,WKY大鼠組與SHR組大鼠在b區域、a+b區域滯留的時間及時間比例均顯著降低(P<0.01),且在a+b區域更偏向于待在a區域,二者與陌生鼠的交流時間均減少;從區域移動路程結果來看,由于考慮到WKY大鼠自主活動低、運動速度慢,SHR多動、運動速度快的因素,其對區域運動路程存在客觀影響,故用區域運動路程占比更具合理性,而結果表明與Wistar大鼠組比較,2組大鼠在b區域、a+b區域兩區域運動路程比例a+b/A+B、b/B均顯著降低(P<0.01),說明WKY大鼠組與SHR組大鼠與陌生鼠交流均減少;同樣,從區域頻次分析,考慮到各組大鼠自主活動程度、運動速度的不同對區域頻次的影響,此外若待測動物與陌生鼠接觸時間短暫,則其出入區域頻次則增多,故用區域頻次占比結果來衡量動物的社交偏好程度更好,結果顯示,WKY大鼠組與SHR組大鼠區域頻次占比a+b/A+B、b/B,與Wistar大鼠組比較均減少,且在a+b區域里在b區域頻次占比更小,2組均表現出較低的社交偏好。

研究結果提示,WKY大鼠組與SHR組大鼠均存在社交障礙,且2組差異不大,較難區分,符合實際情況;Wistar大鼠更適合作為SHR社交障礙行為學實驗的對照動物。本實驗方法能詳細記錄動物的社交行為,并且所選取的指標(b區域和a+b區域的時間、路程、頻次及比例)能明顯、客觀、全面地反映不同組間的社交偏好差異,能夠辨別社交障礙動物與社交正常動物。小兒黃龍顆粒為第一個由國家食品藥品監督管理局批準的治療ADHD的中成藥[17],其方組成為熟地黃、白芍、麥冬、知母、五味子、煅龍骨、煅牡蠣、黨參、石菖蒲、遠志、桔梗。陳瑤[18]研究發現,ADHD患兒在使用6周小兒黃龍顆粒治療后,口干咽燥、手足心熱、盜汗、失眠多夢及大便秘結積分均顯著降低;萬源[19]發現小兒黃龍顆粒能改善多動不寧、神思渙散2項主癥與手足心熱、大便秘結2項次癥,并且未發現不良反應。此外,在相關動物實驗中,其能改善動物行為學障礙,減少動物多動、沖動等異常行為,促進學習記憶,并能增加SHR對陌生鼠的偏好程度,延長與陌生鼠的交流時間,改善SHR的社交障礙[20]。鑒于小兒黃龍顆粒在臨床ADHD治療方面有著良好的安全性與有效性,并能改善ADHD大鼠模型的社交障礙,故作為本實驗的陽性藥物。

研究表明,小兒黃龍顆粒可使SHR在b區域和a+b區域的時間、路程、頻次及比例均有不同程度增加。提示,在本方法可以評價小兒黃龍顆粒對社交障礙大鼠模型的逆轉作用,說明該方法能準確、系統捕捉動物的社交行為,對其社交偏好情況進行客觀評價。

綜上所述,該方法空間區域劃分合理,不僅解決了傳統三箱實驗的視野遮擋問題,能夠清晰觀察到待測動物在關鍵區域的行為情況;并且動物的社交行為可直接使用行為分析系統進行分析,實驗所選取的指標能將動物的社交行為精確量化,真實反映動物的社交偏好程度,區分社交障礙動物與社交正常動物。本實驗還通過增加觀察時間增強了結果的可靠性和減少偶然誤差,同時也避免了以往社交實驗人為記錄的主觀性,提高了實驗效果。此外,相比于WKY大鼠,Wistar大鼠更適合作為ADHD模型動物SHR社交障礙行為學實驗的對照動物。

利益沖突聲明:無。