高效液相色譜法測定柚子農(nóng)藥殘留

蔣軒 張英明 羅丹 黃翠莉

柚子作為最大的柑橘類水果，在我國已經(jīng)有3000多年的栽培歷史，品種也越來越豐富，憑借酸甜適中、含糖量高、易存儲等特點，一直享有“天然罐頭”的美譽。新鮮柚子雖然好吃，但是柚子皮很容易有農(nóng)藥殘留，對人體健康造成潛在風險。因此，開發(fā)一種高效準確的方法用于柚子中農(nóng)藥殘留的測定具有重要意義。目前，高效液相色譜法被廣泛應用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的分析，具有較高的靈敏度，而且分離效果好，操作簡單。本文應用高效液相色譜法測定柚子農(nóng)藥殘留，能滿足對柚子農(nóng)藥殘留檢測的需求。

1.材料和方法

1.1材料與試劑

在研究中，隨機選擇了3個不同的市場，并從每個市場購買了1千克的柚子樣品，將這些樣品帶回實驗室后，使用勻漿機對其進行勻漿處理，將處理后的樣品裝入密封袋中。為了保持樣品的新鮮度和穩(wěn)定性，將密封袋放置在超低溫冰箱中（-70℃）備用。

辛硫磷99.7%、吡蟲啉98.5%、多菌靈99.5%和除蟲脲98.8%標準品；甲酸、甲醇、乙腈為色譜純；純凈水、無水硫酸鈉、正己烷、弗羅里硅土、粉末活性炭、甲苯等為分析純。

1.2儀器設備

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；冷凍高速離心機；電子天平ME104E/02；HZQ-Q恒溫振蕩器；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)；中性氧化鋁柱（500mg/3mL）。

1.3試驗方法

1.3.1配制溶液

由于光照可能導致光敏性農(nóng)藥分解或降解，從而影響溶液的濃度和準確性。因此，這些溶液要避光、低溫保存，以減緩可能的化學反應速率，確保溶液的穩(wěn)定性。有效期為30天。

（1）配制標準儲備液。精準性稱量1.1中標準品，并在其中滴加乙腈溶液，充分攪拌進行溶解，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中定容，配制成質(zhì)量濃度為500mg/L的標準儲備液。

（2）配制標準中間液。取配制的標準儲備液1mL，利用乙腈定容到10mL，配制成質(zhì)量濃度10mg/L 的標準中間液。

（3）甲酸溶液。首先準備500mL的水，然后取出0.5mL的甲酸，緩慢地滴入500mL的水中，充分攪拌。

（4）乙腈溶液。首先準備400mL的水，然后取出600mL的乙腈，緩慢地倒入400mL的水中充分攪拌。

1.3.2樣品處理

精準稱取25g柚子樣品，將其放入容量為50mL的離心管中，加入20mL乙腈，先進行2分鐘高速勻漿，然后在常溫狀態(tài)下靜置5分鐘，之后加入6gNacl，充分震蕩1分鐘。置于冷凍高速離心機中，設置轉(zhuǎn)速為4000r/min，實施5分鐘離心操作。將上清液10mL通過移液管吸取后，置于梨形瓶中的中性氧化鋁柱中進行凈化收集流出液，應用1mL乙腈淋洗中性氧化鋁柱，洗出在柱中殘留的雜質(zhì)。然后中性氧化鋁柱中的溶液放入40℃氮氣中，通過氣流將溶液吹干，直到溶液接近干燥狀態(tài)，以此去除溶劑并濃縮樣品。接下來，將適量的甲醇加入梨形瓶中的中性氧化鋁柱中，與樣品進行溶劑交換。根據(jù)需要，將溶液體積調(diào)整到5mL進行定容，然后將溶液通過0.45?m微孔濾膜過濾，以去除殘留的固體顆粒或雜質(zhì)，最后實施高效液相色譜測定操作。

1.3.3樣品凈化

采取規(guī)格為30cm×15mm的玻璃層析柱進行樣品凈化操作，在凈化之前，先應用15mL的正己烷預淋洗濕潤玻璃層析柱，進而將厚度為4cm的無水硫酸鈉、4g弗羅里硅土、0.8g粉末活性炭混合物、厚度為4cm的無水硫酸鈉依次加入玻璃層析柱中，然后應用3：1的乙腈：甲苯混合液作為淋洗液，使用20mL進行洗脫處理，收集洗脫液，將其放置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，設置溫度為35℃條件下，然后開啟儀器，直至近干后冷卻應用甲醇定容。

1.3.4測定條件

（1）使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，規(guī)格為4.6mm×250mm，粒徑為5.0?m。

（2）流動相試驗：試驗過程中選擇的流動相分別是①甲醇：水=75：25（V：V）②乙腈：水=75：25（V：V）③甲醇：水= 65：35（V：V）④甲醇：水= 85：15（V：V），之后設置檢測條件為流速1.0mL/min，波長為280nm。依據(jù)檢測結(jié)果可得出，盡管②為流動相時可檢測出四種農(nóng)藥殘留，但是有兩種無法分開。之后經(jīng)過檢驗后得出，②為流動相時吡蟲啉與多菌靈的峰值時間相接近，只差0.086分鐘。而選擇甲醇：水為流動相時，①的峰形較為對稱，保留時間比較均勻，而且沒有托峰。為了進一步判定流速的選擇，在試驗過程中，針對①流動相設置流速為0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min，得出色譜圖，從中可以得出流速為0.5mL/min時保留時間較長，而且峰形不夠?qū)ΨQ；流速為1.5mL/min時保留時間較短，但是分開效果較差，峰形也不對稱；流速為1.0mL/min時，保留時間較短，分開效果良好，峰形也較為對稱。

（3）測定條件確定：依據(jù)上述結(jié)果可得出，流動相及其流速對保留時間、分離度等影響較大，而且保留時間較短時，分開效果最佳，峰形也最對稱，沒有托峰、峰尾的情況出現(xiàn)。因此，測定條件確定為使用甲醇和水的混合物作為流動相，混合比例為甲醇：水= 75：25（V：V），設置流速為1.0mL/min，檢測波長280nm，設置進樣量為10?L，設置柱溫為30℃。

2.結(jié)果與分析

2.1檢測波長確定

使用三維檢測器對所測定的4種農(nóng)藥進行掃描，結(jié)果顯示225nm處辛硫磷的吸收較大，且基線噪音小，色譜峰信噪比處于理想狀態(tài)，因此選擇225nm作為辛硫磷的檢測波長；吡蟲啉在270nm處的吸收較大，基線噪音小，因此選擇270nm為辛吡蟲啉的檢測波長。采取同樣方式對多菌靈和除蟲脲的檢測播放進行分析，發(fā)現(xiàn)前者為210nm、后者為254nm的波長比較合適。

2.2線性關系

分別應用移液槍吸取標準中間液0.02mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL于容量瓶中，定容至10mL，制成0.1?g/mL、0.5?g/mL 、1.0?g/mL 、2.5?g/mL 、5.0?g/mL、10.0?g/mL 的標準品樣液，將配置好的這些樣液按照濃度依次裝入樣品瓶中，應用高效液相色譜儀進行檢測，根據(jù)上述的測定條件進行測定，測定結(jié)果以因變量峰面積（y）和自變量濃度（X）繪制成標準曲線，使用最小二乘法計算回歸方程及相關系數(shù)，如表1所示，發(fā)現(xiàn)這四種農(nóng)藥在0.02-0.30mg/mL的線性關系良好，而且相關系數(shù)均維持在0.999以上。

2.3檢出限和定量限

根據(jù)線性范圍最低的質(zhì)量濃度進行進樣操作，將檢測限和定量限的信噪比分別設置為3：1和10：1，得出這4種農(nóng)藥的檢出限和測定限，結(jié)果如表2所示。

2.4回收率和精密度

選擇新鮮的柚子作為空白樣，并在其中分別添加0.2、0.5、1.0mg/mL的辛硫磷標準品、吡蟲啉標準品、多菌靈標準品和除蟲脲標準品，根據(jù)回收率測定方法，通過添加平行樣，可以計算加標回收率和精密度，以評估方法的準確性和重復性。結(jié)果顯示，平均回收率在83-105.8%之間，RSD在0.5-3.4%之間，如表3所示。從這可以看出，這4種農(nóng)藥的回收率比較高，而且標準偏差值較小。以此可以得出，應用高效液相色譜法對柚子農(nóng)藥殘留進行測定，精確度和精密度較高。

結(jié)論

本文選擇柚子作為研究對象，通過合理選擇材料與試劑，明確溶液配制方法，做好樣品處理和凈化工作，確定測定條件，構建了一種用于柚子辛硫磷、吡蟲啉、多菌靈、除蟲脲四種農(nóng)藥同時測定的高效液相色譜法，使用乙腈溶液作為溶劑，通過高效液相色譜儀進行測定，并采用外標法進行定量分析，獲取較高的試驗靈敏度、精準度。總的來說，高效液相色譜法在柚子農(nóng)藥殘留測定中具有高效性和簡便性，易上手操作，十分適合辛硫磷、吡蟲啉、多菌靈、除蟲脲等農(nóng)藥殘留的檢測。

基金項目

本文系2022年度廣東質(zhì)檢院內(nèi)部科技項目“柚皮宴”預制菜食品安全關鍵指標標準化應用研究（2022GQI09）階段性成果之一。

*通訊作者

蔣軒（1989.02-），男，漢族，湖南祁陽人，碩士研究生，中級工程師；研究方向：食品及食品相關產(chǎn)品安全檢驗與風險監(jiān)測。