腸桿菌科細菌mcr-1 流行病學研究

錢嬌 王怡嵐 洪加穩 秦佳佳 王麗莎 厲世笑 許春燕 毛穩 鄭淑芳 張嶸 余素飛

近年來，多重耐藥菌的檢出率在全球范圍快速增長[1]，而抗生素的選擇極為有限，使得臨床抗感染治療面臨嚴峻挑戰，迫使臨床使用像多黏菌素和磷霉素等“老藥”。目前多黏菌素被認為是治療碳青霉烯耐藥細菌所致嚴重感染的重要選擇[2-4]。但是隨著臨床應用的增多，多黏菌素耐藥細菌也在不斷出現[5]。多黏菌素耐藥最主要的機制主要是染色體介導導致病原體脂質A 的改變，從而降低對多黏菌素的親和力[5-6]，其傳播范圍和速度較為有限。自2015年Liu 等[7]在柳葉刀雜志首次報道了質粒介導的多黏菌素耐藥基因（mobile co1istin resistance，mcr-1）后，mcr-1 在人類、食品、動物和環境中的傳播和流行已被廣泛報道[8-9]。該基因即使沒有黏菌素的選擇性壓力，也可穩定存在并廣泛傳播。更令人擔憂的是，同時攜帶mcr-1 和新德里金屬β-內酰胺酶Ⅰ型（New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1）的大腸埃希菌不斷有報道[10-12]，成為真正的“超級細菌”。本研究通過檢測mcr-1 在浙江省臺州醫院臨床分離得到的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的流行情況，同時探討攜帶mcr-1 基因質粒的水平轉移能力及與其他耐藥基因共存的現象，為多重耐藥菌的防控工作提供理論依據。

1 資料和方法

1.1 菌株來源 收集2018 年1 月至2022 年3 月浙江省臺州醫院臨床分離得到的非重復大腸埃希菌1 400株和肺炎克雷伯菌580 株，將菌株接種于中國藍平板，置于35 ℃孵箱孵育16～18 h，所有菌株均通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）（法國生物梅里埃公司）進行菌種鑒定。菌株來源于臨床各類標本，其中尿液706 例，分泌物604 例，全血496 例，呼吸道132 例，無菌體液22 例，糞便15 例，其他標本類型5 例。

1.2 主要儀器和試劑 中國藍平板（杭州濱和微生物試劑有限公司）；腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、MH 肉湯和瓊脂（英國OXOID 公司）；微量肉湯稀釋法藥敏板（溫州市康泰生物科技有限公司）；PCR 擴增試劑及DNA 分子量標準（日本TaKaRa 公司）；核酸電泳瓊脂糖（上海生工生物技術有限公司）；紫外成像系統（德國Whatman Biometra 公司）；TIANGEN 細菌基因組DNA 試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 PCR 檢測mcr-1 制備細菌DNA 模板，參照文獻[1]合成引物序列（mcr-1-F：5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3'；mcr-1-R：5'-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3'）。PCR 總反應體系50 μL，包括待測菌DNA 模板3 μL、15 U/μL TaqDNA 聚合酶0.25 μL、10×PCR buffer 5 μL、5 mmol/L dNTP mixture 4 μL、25 μmol/L 下游引物1 μL、25 μmol/L 下游引物1 μL、ddH2O 35.75 μL。反應條件：94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸50 s。PCR 產物在1% 普通瓊脂糖凝膠上電泳，150 V 恒壓電泳15 min，紫外成像系統觀察分析電泳條帶。與mcr-1陽性質控在同一位置出現電泳條帶判斷為mcr-1 陽性。

1.4 抗生素敏感性試驗 mcr-1 陽性菌株采樣E-test法檢測多黏菌素最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），其余抗生素采用微量肉湯稀釋法。多黏菌素藥敏結果判斷參考歐盟藥物敏感性試驗標準委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）標準：S≤2 mg/L，R≥4 mg/L。其他抗生素藥敏結果判斷折點參考美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2022 年M100 文件中腸桿菌目細菌抑菌圈直徑和MIC 折點。

1.5 接合試驗 采用肉湯法。mcr-1 陽性菌株為供體菌，利福平耐藥大腸埃希菌（EC600）為受體菌。供體菌和受體菌在BHI 37 ℃、200 r/min 下過夜培養，分別取200 μL 過夜培養的供體菌和受體菌菌液至新鮮的2 mL BHI，37 ℃200 r/min 培養4 h，使之到達對數生長期，取供體菌與受體菌新鮮菌液，將OD600 值調整至0.5 麥氏濁度；分別取供體菌與受體菌各600 μL混合至2 mL 離心管，4 000 r/min、5 min 收集菌體（沉淀部分），棄上清液，用新鮮6 mL 含有0.5 μg/mL 多黏菌素的BHI 重懸菌體。隨后在37 ℃孵箱靜置過夜孵育。吸取100 μL 上述過夜培養的混合菌液均勻涂布到篩選平板（含1.5 μg/mL 多黏菌素和600 μL/mL利福平），用混合前供體菌和受體菌作為空白對照，37 ℃孵箱過夜孵育將上述篩選平板上單菌落細菌轉劃到另一篩選平板上，再次孵育并對接合子作耐藥基因和藥敏鑒定。

1.6 全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）挑取mcr-1 陽性菌株新鮮菌落，按照TIANGEN 細菌基因組DNA 試劑盒說明書提取基因組。經DNA 文庫構建后在Illumina nova-seq 6000 平臺上進行測序，測序下機的數據經過處理后DNA 信息儲存于FASTQ 格式的文件中。在Linnux 系統下采用SPAdes-3.0 軟件進行序列拼接。組裝后的基因組序列在基因組流行病學中心（Center for Genomic Epidemiology, CGE）網站（http：//www.genomicepidemiology.org/）上進行多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、質粒Inc 分型和耐藥基因識別等分析。

2 結果

2.1 mcr-1 檢測結果 對收集到的所有腸桿菌科細菌進行mcr-1 基因篩查，在1 400 株大腸埃希菌中，共檢測出6 株攜帶mcr-1，陽性率為0.43%；580 株肺炎克雷伯菌，僅1 株檢出mcr-1，陽性率0.17%，陽性菌株PCR電泳結果見圖1。

圖1 mcr-1 陽性PCR 擴增電泳圖

2.2 mcr-1 陽性菌株藥敏試驗 7 株細菌對多黏菌素B 的MIC 范圍為1、2、4 g/L。具體藥敏試驗結果見表1，其中ECO1022 是耐碳青霉烯大腸埃希菌。

表1 mcr-1 陽性菌株及接合子藥敏（μg/mL）

2.3 接合試驗 ECO910 的MIC 是1 mg/L，未進行接合試驗。其余6 株菌株成功接合5 株，ECO1022 沒有接合成功。接合子對多黏菌素B 的MIC 值在1～2 mg/L，較原始菌株有下降。mcr-1 陽性菌株及接合子藥敏信息見表1。

2.4 全基因組測序結果分析 7 株細菌（6 株大腸埃希菌，1 株肺炎克雷伯菌）經過二代測序及拼接后得到約5 Mb 的全基因組序列。MLST 結果顯示6 株大腸埃希菌屬于不同的ST 型，分別是ST648、ST95、ST359、ST602、ST453、ST156，肺炎克雷伯菌為ST25。耐藥基因分析發現7 株細菌攜帶大量的耐藥基因，除了攜帶介導mcr-1 耐藥基因外，還攜帶介導β 內酰胺類（blaCTX-M、blaTEM、blaCMY、blaSHV、blaLAP、blaOXA、blaVIM-48、blaNDM-5）、磷霉素（fosA）、喹諾酮類[oqxAB，qnrS1 和aac（6'）-Ib-cr]、四環素類[tet（A）]、氯霉素類（floR，cmlA 和catA2）、大環內酯類[mph（A），mdf（A）和erm（B）]、甲氧芐啶（dfrA）、磺胺類（sul）、利福平（ARR）和氨基糖苷類（aac、aad、aph 和arm）10 種不同種類的抗菌藥物耐藥，見表2。其中1 株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌同時攜帶臨床上被認為最后用于治療多重耐藥的陰性桿菌的抗菌藥物的耐藥基因：碳青霉烯耐藥基因（blaNDM-5、blaOXA-10、blaVIM-48）和mcr-1。

表2 7株細菌的基本情況

7 株細菌的mcr-1 基因所在的片段長度在4 450～63 861 bp。片段所在的質粒類型有IncX4（2 個）和IncI2（4 個），還有1 株由于mcr-1 基因所在片段長度短，尚且不知道mcr-1 基因所在的位置。IncX4、IncI2 是mcr-1 基因所在的常見質粒類型。本研究中4 個IncI2類型的質粒序列與分離自國內安徽巢湖的大腸埃希菌pAH62-1（GenBank 序列號CP055260）高度相似，見圖2（插頁）；而另2 個IncX4 類型的質粒則與分離自埃及的大腸埃希菌pCFSAN061769_01（GenBank 序列號CP042970）高度相似，見圖3（插頁），提示攜帶mcr-1相同質粒在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌之間的傳播。

圖2 4 株細菌mcr-1 基因所在IncI2 質粒序列的比較圖

圖3 2 株細菌mcr-1 基因所在IncX4 質粒序列的比較圖

3 討論

由于多黏菌素類藥物對人體有腎毒性和神經毒性，所以在20 世紀后期，臨床應用逐漸減少。而在養殖業中該類藥物被大量應用于禽畜的疾病預防，但其耐藥性一直保持較低水平。2015 年，我國學者在動物來源的大腸埃希菌中發現mcr-1，并驗證了其水平傳播能力，解釋了近年來多黏菌素耐藥率激增的現象。這一發現引發了全球研究mcr-1 的熱潮。有研究結果發現該基因廣泛流行，不僅存在于動物和人體內，在環境中也有發現[13-15]，而且動物源、動物性食物源標本中mcr- 1 檢出率遠遠高于人源標本（0.63% ～37.50%）[7，9，16]。盡管目前在臨床感染患者的檢出率在0.30%～1.65%之間[7，17-19]。但基于“One Health”理念，地球生物圈的健康是相輔相成且無法相互分割的。而且現階段，多黏菌素作為多重耐藥菌治療的有效藥物被重新啟用，有必要擔心其在臨床實踐中耐藥性增加的問題，所以對mcr-1 的流行情況進行監測十分必要。

本研究得到浙江省臺州醫院臨床分離的大腸埃希菌mcr-1 檢出率是0.43%，肺炎克雷伯菌是0.17%，與研究報道一致。所有患者均無多黏菌素暴露史，其中1 例是門診兒童患者。6 株mcr-1 陽性大腸埃希菌屬于不同ST 型，說明浙江省臺州醫院分離得到mcr-1的大腸埃希菌不是同一克隆來源。本研究沒有檢測到ST131 型，但作為大腸埃希菌最主要克隆流行株，mcr-1 在大腸埃希菌中傳播只是時間問題[20]。此外，有1 株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的mcr-1 所在質粒類型是IncX4，兩者非常相似，提示攜帶相同質?？梢栽诓煌N之間傳播。目前為止，已報道多種mcr 基因突變體[8，21]，且質粒種類多樣，隨著臨床上多黏菌素的應用在不斷增加，在相應的選擇壓力下，mcr 陽性菌株可能也會造成新一波的流行。

雖然mcr-1 主要介導低水平耐藥，但mcr-1 可以與不同的耐藥基因整合于同一個轉移性質粒上。本研究分離到的菌株多黏菌素MIC 值為1～4 mg/L，但攜帶大量耐藥基因。盡管本研究中耐碳青霉烯大腸埃希菌ECO1022 接合試驗沒有成功，但已有來源于不同供體的blaNDM-5與mcr-1 共轉移到同一受體菌的報道[22]。本研究分離得到的肺炎克雷伯菌（blaOXA-10和blaVIM-48）分離自血液，但因其抗生素還是敏感居多，對患者預后沒有產生嚴重影響。而攜帶blaNDM-5大腸埃希菌來源于糞便，臨床考慮是腸道定植未作處理，但腸道是耐藥基因的儲存庫,是臨床抗感染治療的一大隱患。

綜上所述，mcr-1 在浙江省臺州醫院大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中分離率較低，且為散在分布。但是，由于攜帶mcr-1 的質?？稍诓煌N間水平傳播，而且mcr-1 可以與多種耐藥基因整合在同一質粒，尤其是與碳青霉烯類耐藥基因共存，提示臨床需要加強對多重耐藥菌的管理。