耐藥結核病患者外周血中補體3的臨床意義

徐錦 張臘紅 劉曉婷 孟憲梅 姚心怡 許寧沁 陳兆軍

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病[1]。根據《2023 全球結核病報告》顯示，全球范圍預估上一年度結核病新發病例為1 060 萬，約130 萬人死于結核[2]。耐藥結核病包括單耐藥結核病、多耐藥結核病、耐多藥結核病、準廣泛耐藥結核病、廣泛耐藥結核病以及利福平耐藥結核病[3]。最新數據表明，全球耐多藥/利福平耐藥結核病的患者數量約為41 萬，我國耐藥結核病患者報告病例數大致是1.24萬（總數預估為3 萬多），僅有40%左右患者確診，而其中得到有效治療的耐藥結核病患者約占80%[2]。耐藥結核病數量的增加，對當前結核病防治工作帶來了極大挑戰。已有文獻報道，耐藥結核病與非耐藥結核病患者有免疫反應的差異[4]。目前大多數文獻報道集中在耐藥和耐多藥結核病患者的T 淋巴細胞表達水平方面[5-7]，但鮮有報道耐藥結核病患者外周血指標表達情況的報道。因此，本研究檢測了耐藥結核病患者外周血中補體3（complement3，C3）、C4、IgA、IgM、IgG、轉鐵蛋白、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白、纖維蛋白原（fibrinogen，Fib）及D-二聚體（D-dimer，D-D）的表達情況并進行分析，以期發現耐藥結核病的特異性實驗室指標。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年1 月至2023 年6 月于杭州師范大學附屬醫院收治的386 例非耐藥結核病患者，男207 例，女179 例，年齡18～78（52±22）歲；118 例耐藥結核病患者，男66 例，女52 例，年齡18～79（46±20）歲；選取同期同院體檢健康者76 名作為健康組，男35名，女41 名，年齡18～75（42±13）歲；各項體檢指標及影像學檢查均正常。3 組對象性別（χ2=2.370，P=0.379）和年齡（F=1.825，P=0.162）比較差異均無統計學意義。結核病的診斷標準依據肺結核診斷標準（WS 288-2017）和結核病分類標準（WS 196-2017）。非耐藥結核病患者納入標準：（1）低熱、咳嗽、咳痰、咯血等明顯的臨床癥狀；（2）胸部X線或CT 檢查考慮結核，且為初次治療；（3）痰涂片抗酸桿菌陽性及痰結核分枝桿菌培養陽性；（4）結核分枝桿菌藥敏試驗未發現耐藥現象。耐藥結核病患者納入標準：（1）有明顯臨床癥狀，胸部X線或CT 檢查考慮結核；（2）痰結核分枝桿菌培養陽性；（3）結核分枝桿菌藥敏試驗結果表明,至少對1 種及以上一線抗結核藥物耐藥。所有對象均排除使用糖皮質激素等免疫抑制劑以及艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病、血液系統疾病、非結核分枝桿菌感染的肺部疾病、妊娠或哺乳期婦女等。本研究經杭州師范大學附屬醫院醫學倫理委員會審查通過[批準文號：2023（E2）-KS-059]，患者或家屬均知情同意。

1.2 標本采集與檢測方法 于清晨空腹抽取所有研究對象的外周靜脈血2 管（枸櫞酸鈉抗凝管、含促凝劑管）各5 mL，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm）分離血漿或血清備用。血清檢測C3、C4、IgA、IgM、IgG、轉鐵蛋白、總蛋白、白蛋白、球蛋白以及白蛋白/球蛋白，血漿檢測Fib 及D-D。血清C3、C4 和IgA、IgM、IgG 及轉鐵蛋白的檢測用免疫散射比濁法測定，使用貝克曼IMMAGE800 特定蛋白分析儀及配套試劑操作；血清總蛋白檢測采用雙縮脲法，白蛋白檢測采用溴甲酚綠法，球蛋白及白蛋白/球蛋白檢測采用計算法，使用貝克曼AU5800 全自動生化儀及配套試劑操作；血漿Fib 檢測采用凝固法，血漿D-D 檢測采用膠乳免疫比濁法，使用SYSMEX CS5100 全自動凝血分析儀及配套試劑操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS 26.0 統計軟件。正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；非正態分布計量資料則用M（P25，P75）表示，多組間比較采用非參數檢驗，組間比較用Kruskal-WallisH檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

結果表明，3 組對象C3、C4、IgA、IgG、轉鐵蛋白、Fib、D-D、總蛋白、白蛋白及白蛋白/球蛋白比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；耐藥組C3明顯低于非耐藥組和健康組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；非耐藥組C4 高于耐藥組，差異有統計學意義（P＜0.05）；非耐藥組IgA、IgG 均高于健康組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；耐藥組與非耐藥組Fib、D-D 均高于健康組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；耐藥組與非耐藥組總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白及轉鐵蛋白均低于健康組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 3組對象外周血指標結果的比較

3 討論

結核分枝桿菌為兼性胞內寄生菌，寄生于宿主細胞內。結核分枝桿菌的各種免疫逃逸機制使之可以在宿主中長期生存繁殖[8]。結核病患者的細胞免疫和體液免疫功能均受到不同程度的損害[9]，機體自身的免疫水平與結核病進展也有著密切聯系[10-13]。而耐藥結核病相比于非耐藥結核病其免疫系統受到更嚴重的損害[14-15]。

通過對耐藥結核病和非耐藥結核病患者外周血指標的檢測發現，結核病患者（耐藥/非耐藥）與健康組相比，D-D 和Fib 升高，總蛋白、白蛋白、白球比、轉鐵蛋白下降；這說明耐藥結核病和非耐藥結核病患者有著基本相似的免疫反應：肝臟損傷（總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白及轉鐵蛋白下降），凝血指標異常（Fib、DD 升高）。在耐藥結核組中C4 低于非耐藥結核組，但與健康組比較差異無統計學意義；耐藥結核組與非耐藥結核組、健康組均有差異性的外周血指標只有C3。

C3 是補體系統中最重要的組成成分。補體系統屬于體液免疫，是抵御病原菌的首要防線[16]，由絲氨酸蛋白酶級聯反應組成，通過補體蛋白的連續裂解，最終導致膜攻擊復合物的形成，其目的是清除和遏制感染，但是補體系統不平衡也會影響宿主細胞，使細菌持續存在并逃避免疫系統的清除[17-18]。補體受體（complement receptor，CR）協助結核分枝桿菌進入吞噬性巨噬細胞，并通過各種適應性防御在其胞內成功增殖從而導致疾病[19]。Wang 等[20]通過iTRAQ-2D LC-MS/MS 技術聯合Solexa 測序發現耐多藥肺結核和非耐藥肺結核患者組間有50 多種差異表達蛋白大多有補體途徑參與。有研究實驗表明結核分枝桿菌生物膜修飾了其細胞壁碳水化合物使補體沉積減少，即補體系統活化減少[21]。在結核感染中補體具有至關重要的作用[22]。補體系統中C3 為參與增強單核巨噬細胞對結核分枝桿菌的黏附和攝取人血清中的主要成分，并且能夠調理結核分枝桿菌表面，通過CR1 和CR3 被巨噬細胞識別[23]。Naranjo 等[24]對野豬和牛分枝桿菌之間分子相互作用的表征表明，編碼補體成分C3 和其他先天性及適應性免疫反應蛋白的基因在淋巴結和扁桃體中的上調與對天然分枝桿菌感染的抗性相關。更高的C3 水平可能允許增加的調理吞噬作用和有效的細菌清除，同時干擾CR3 介導的分枝桿菌的聲波和非聲波吞噬作用[25]。有回顧性研究表明低水平的C3 在結核性腦膜炎感染中有較高的死亡率[26]。耐藥結核病患者中較低的C3 水平，進一步說明耐藥結核桿菌在感染宿主時，因補體系統功能嚴重紊亂不能很好的清除結核分枝桿菌，從而導致單核巨噬細胞對細菌的附著和吞噬能力減弱，病原菌清除受限，繼而促進了病原菌在宿主的進一步生長。本研究結果發現C3 在耐藥組中低于非耐藥組和健康組，差異有統計學意義。這說明C3 在耐藥結核病患者中表達水平的降低對于臨床有一定應用價值，但是否能作為耐藥結核病的特異性指標，有待于進一步深入研究探討。

綜上所述，外周血中C3 在耐藥結核病患者中的表達差異，提示耐藥結核病患者補體系統失衡，體液免疫功能受損。