流行性感冒病毒感染的實驗室診斷技術應用進展

成軍 王寧寧 劉夢如 戴玉柱

流行性感冒（簡稱流感）病毒是流感的病原體，該病毒為單股負鏈RNA 病毒，歸屬于正粘病毒科。根據其核蛋白（nucleoprotein，NP）和基質蛋白（matrix protein，M）的抗原性不同，可分為甲、乙、丙、丁（或A、B、C、D）4 型[1]。此外，甲型流感病毒又根據表面的血凝素（hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）的不同分為不同亞型[2]。HA 分為18 種亞型，NA 分為11 種亞型。兩種抗原亞型之間組合形成了具有不同抗原特性和致病性的甲型流感病毒亞型；乙型流感病毒無亞型之分，隨著HA 持續不斷進化，逐漸形成Victoria 系和Yamagata 系[3]。目前，在人群中流行的主要有甲型流感病毒（H1N1、H2N2、H3N2 亞型）和乙型流感病毒中的Victoria 系[4]，其中H1N1 和H3N2 是引起季節性甲型流感的主要亞型，而其他甲型流感亞型的自然宿主要是鳥類和動物，其中H5、H7、H9 亞型對家禽影響最大。

2009 年3 月在墨西哥和美國先后爆發了大規模流感，后經證實是一種新型甲型H1N1 流感病毒，是由歐洲豬流感病毒（提供NA 和M 基因）和北美三源基因重配的豬流感病毒（提供PB2、PB1、PA、HA、NP和NS 基因片段）通過基因重配的產物[5]。據WHO 統計，此次流感大流行蔓延到214 個國家和地區，導致近20 萬人死亡[6]。至今，全世界每年約有5%成人和20%兒童感染甲型或乙型流感[7]，對世界公共衛生安全造成了一定意義的威脅。接種流感疫苗是預防流感的有效手段，但是現有疫苗無法對所有正在出現變異的單一流感病毒亞型提供保護，并且疫苗接種保護率也有待考證。所以，在流感流行季節、疫情暴發和存在流感高危因素時，流感病毒的早期診斷是刻不容緩的事。流感病毒的診斷具有一定的挑戰性，因為其臨床表現與鼻病毒、副流感病毒、腺病毒和新型冠狀病毒有相似之處[8]，所以，“早發現、早隔離、早診斷、早治療”是預防和控制流感傳播的有效方法。及時快速的檢測方法也有助于患者在感染后進展為更嚴重之前進行早期對癥治療。本文就流感病毒感染實驗室診斷技術應用進展作一述評，為其早期診斷提供參考。

1 病毒培養

狗腎傳代細胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）是流感病毒的敏感細胞[9]，且細胞代謝特性穩定，適合大規模培養流感病毒，因此目前常用MDCK 細胞分離培養流感病毒[10-12]。使用流感病毒樣本感染已建立的細胞系，觀察細胞病變作用，并通過特異性抗體染色、血凝抑制試驗（hemagglutination inhibition test，HI）和免疫熒光顯微鏡進行確定[13]。HI 不僅可以用于鑒定待檢病毒的型別及亞型，也常用于檢測同型別病毒的抗原變異情況[14]。基于病毒培養的免疫熒光法用于鑒定病毒具有快速、特異的優點，細胞內的病毒可被熒光素標記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染[15]。整個病毒培養過程耗時長，操作周期長，對實驗人員和環境要求高，因此難以快速檢測病毒，也不適用于大量樣本的檢測篩查。不過，病毒培養卻能夠獲取病毒株，這對于研究病毒基因特性、抗原性、疫苗研發以及耐藥性方面非常具有意義。

2 免疫學檢測

免疫學檢測主要是通過抗原檢測患者標本中的病原體抗體或通過抗體檢測患者標本中病原體的抗原。常用的免疫學檢測方法如HI、中和試驗（neutralization test，NT）、免疫熒光法（immunofluorescence，IF）、免疫膠體金技術（immune colloidal gold technique，ICG）和ELISA 等，與其他技術相比，免疫學檢測具有簡單、快捷、成本低廉的優點，但是不適用于早期感染，且無法量化病毒和出現假陽性率等缺點。近年來，免疫學方法不斷發展，如基于納米酶的免疫學檢驗備受關注，使免疫學檢查中的不足得到了一定程度的優化。

2.1 HI HI 是確定人和其他動物模型自然感染和接種疫苗后血清中是否存在特異性流感病毒HA 抗體的最常用方法[16-17]。該試驗是基于血凝反應的原理，通過觀察病毒與紅細胞之間的相互作用來評估抗體對病毒的中和抑制效果。通過比較添加不同濃度待測樣品后的血凝情況，可以確定待測樣品中的抗體滴度，即最低有效稀釋度。抗體滴度越高，說明抗體對病毒的中和抑制效果越強。但是HI 的重復性較低，有時會與其他病毒發生交叉反應。HI 測定的標準化可提高該方法的可重復性[18]。在一項研究中，使用HI 和補體結合試驗（complement fixation，CF）對120 例患者進行了當前流感毒株檢測，結果發現HI 比CF 更敏感，但特異度較低[19]。CF 由于靈敏度較低已被HI、NT 所取代。

2.2 NT NT 可用于檢測病毒、細菌、毒素和其他生物分子的抗原性質，也可以用于疫苗和藥物的研發。基本原理是基于病毒特異性抗體能夠中和病毒的特性。NT 常用于檢測季節性或禽流感毒株的抗體效價。NT測定法較HI 測定法更為靈敏，NT 測定法中病毒中和抗體的特異性高，持續時間久，以往受顯性或隱性感染后，血中可長期存在中和抗體，所以適用于流行病學調查或人群免疫水平研究，但因試驗方法繁雜，且需要在認證的BSL2+和BSL3+實驗室中使用其感染性病毒，所以在常規診斷中的應用受到限制[13]。

2.3 IF IF 包括直接免疫熒光技術、間接免疫熒光技術、時間分辨熒光免疫分析法和補體法。IF 用于檢測臨床標本中病毒抗原，具有快捷、特異的優勢。檢測原理是細胞或組織中的抗原或抗體，與標記了相應熒光素抗體或抗原結合形成抗原-抗體復合物，之后肉眼在顯微鏡下進行觀察，標本中的抗原或抗體可通過因激發光照射發出的熒光而被定量檢測。免疫熒光技術靈敏度高、特異性強、觀察直觀，相對于病毒培養，大大縮短了試驗時長。但其依賴特異性高、穩定性好的抗體，并進行熒光標記，這可能大大增加了試劑的成本和操作的復雜性。

2.4 ICG ICG 是繼免疫熒光技術、放射同位素示蹤技術和酶標記三大技術之后，以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型免疫標記技術[20]，具有操作簡單、快捷直觀、靈敏度高等優點，是目前最廣泛的免疫學檢測技術之一。其中應用最多的是膠體金免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA）。GICA 基本原理是將特異性抗原或抗體以條帶狀固定于膜上，并采用膠體金標記試劑吸附在結合墊上，樣品在層析作用下向前移動，當樣品中存在相應的特異性病毒抗原時，可與結合墊處金標抗體相結合，并聚集于檢測帶上，大量積聚后可肉眼觀察到顯色結果。王璽榮等[21]建立了一種基于量子點熒光免疫層析技術的高準確率快速檢測甲型/乙型流感病毒的方法，該方法不僅能夠通過簡單的步驟進行結果定性，而且還可以通過一個低成本儀器定量檢測病毒濃度。但是仍需要檢測儀器觀察定量結果，導致該方法在諸如欠發達地區、家庭自測等場景的應用局限性。另外，GICA 的靈敏度和特異度受抗體或抗原的影響較大，需要高質量的抗體或抗原來提高其準確性。

2.5 ELISA ELISA 因靈敏度高、操作簡單、特異性強等特點成為目前發展速度最快和應用范圍最廣泛的免疫學技術，其基本原理是采用酶蛋白分子來標記抗體或抗體分子形成酶標抗體，酶標抗體與結合在固相載體上的抗原或抗體進行特異性結合，用洗滌法將液相中游離成分洗出。滴入底物溶液，通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應存在，從而推斷待測抗體或抗原的量。廈門大學在2009 年甲型H1N1pdm0 9 流感大流行期間進行了一項新的基于夾心ELISA 的診斷研究，采用特異性單克隆抗體和辣根過氧化物酶連接兔抗HA 多克隆抗體，該方法具有較高的靈敏度[22]。鄧濤等[23]建立的NA 雙抗體夾心ELISA 定量檢測法具有良好的準確度、重復性、中間精密度和耐用性，可用于流感疫苗的檢測及生產過程中對NA 含量的質量控制。但需要注意的是，ELISA 有時也會出現交叉反應，這就可能導致假陽性或者假陰性的結果，需要進一步確認和鑒定。

2.6 納米酶免疫學技術 2007 年，閻錫蘊團隊發現了納米粒子具有辣根過氧化物酶的催化活性，能夠在溫和的生理條件下，催化酶的底物并遵循酶促反應動力學將其轉化為產物，并在2015 年成功研制了用于埃博拉病毒快速檢測的“納米酶試紙”[24]，該試紙條充分利用了磁納米材料的催化活性、磁性和顯色反應，其測試靈敏度比常規試紙條高100 倍。納米酶作為2022年度化學領域十大新興技術之一，在免疫學、生物學、疾病監測等領域顯示出了巨大的應用潛力。該方法的基本原理就是將納米酶與檢測目標相關的抗體或其他生物分子進行結合，使納米酶獲得特異性識別能力，之后與目標抗原結合時，會催化產生可檢測的信號，以此作為病毒檢測的結果。采用模擬天然酶的催化位點或為反應提供多價元素，現已成為天然酶的替代品。劉鍵等[25]建立了磁珠納米酶催化免疫層析試紙條用于檢測H7N9 亞型禽流感病毒，該方法的靈敏度比膠體金法可提高1～2 個數量級，與目前常用的核酸檢測方法相比，檢測時間大大縮短，適用于即時檢測（point of care test，POCT）。但是目前納米酶的種類較少，且納米酶的質量和性能參差不齊，所以方法的可靠性和標準化還有待進一步研究和提升。

3 分子生物學試驗

隨著核酸擴增PCR 的發展，其在病毒檢測方面得到了廣泛的應用[26]。PCR 檢測基于病毒的特異性DNA或RNA 序列，用于檢測流感病毒感染的分子生物學方法主要包括實時熒光逆轉錄PCR（real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR）、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、連接酶鏈反應（ligase chain reaction，LCR）和基于核酸序列的擴增等。與基于抗原的免疫學檢測法相比，能夠更早的監測到病毒，且PCR 檢測更加靈敏。其中real-time RT-PCR 不僅能夠有效解決PCR 造成的污染，同時能夠實現自動化檢測，特異度較高，目前已經成為臨床監測流感病毒的“金標準”[27]。近年來，PCR 技術不斷創新，微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[28]的發展進一步提高了病毒檢測的準確度，并且同時具有良好的抗干擾能力，表現出了較高的應用價值和發展前景，但是由于其設備和耗材昂貴，ddPCR 的普及及應用具有一定的限制。

3.1 real-time RT-PCR real-time RT-PCR 是使用特異性引物進行檢測并分型流感病毒亞型。該方法包括從樣本中提取病毒RNA，通過逆轉錄酶將RNA 轉錄成互補的DNA，并對產物進行熒光擴增檢測，通過熒光強度觀察產物量的變化，從而建立熒光擴增曲線圖[29]。多重real-time RT-PCR 方法中通過多條特異性引物，可以在一個反應中進行檢測多種流感病毒亞型。該方法敏感、快速、特異性強，能直接檢測臨床標本，該技術的靈敏度在所有傳統檢測方法中較高。另一方面，也有研究指出該檢測方法實驗過程耗時長，例如Shigemoto 等[30]用多重熒光real-time RT-PCR 方法檢測諾如病毒，需要6 h 時長；采用核酸擴增技術，準確檢出H7 亞型禽流感病毒通常需要4～6 h。另外，該方法診斷費用較高、設備昂貴，需要特殊的實驗室條件是其弊端所在。

3.2 LAMP LAMP 測定法常用于流感病毒、嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）、鼻病毒、腺病毒等多種病毒的檢測。通常使用DNA 聚合酶或RNA 逆轉錄酶和兩套引物來識別目的DNA 上的6 個不同位點[31]，采用光度法擴增目的基因的敏感性一般與real-time RT-PCR 檢測相似。一種特定的逆轉錄入LAMP（reverse transcription LAMP，RT-LAMP）方法被開發出來用于流感病毒的特異性評估和分型[32]，其特異度為93.8%。LAMP 測定法在等溫條件下進行，不需要復雜的溫度循環步驟，因此可在短時間內完成擴增反應。但是相比普通PCR 技術，LAMP 技術在引物設計上更為復雜，需要設計多個特異性引物來擴增目標序列，這增加了技術上的挑戰和實驗的復雜性。所需的試劑盒和設備成本較高，這限制了其在某些資源有限環境中的應用。

3.3 ddPCR ddPCR 是基于傳統PCR 方法的改進。根據DNA 有限稀釋法和松泊分布[33]來測定目標核酸分子的濃度。ddPCR 中的病毒核酸分子被稀釋成單個分子進行獨立平行PCR 擴增，擴增后對各PCR 反應的熒光信號進行分析，從而達到對核酸分子進行絕對定量的目的。ddPCR 中核酸分子單獨反應，避免了交叉污染，使其結果更加準確、特異。該方法用于檢測流感病毒已經得到了較好的證實[34-36]，有研究開發了一種六重ddPCR，可在單一反應混合物中檢測甲型流感（H1、H3 和M）和乙型流感（YamagataHA、VictoriaHA 和M）片段[37]。有研究已經證明，與RT-PCR 相比，ddRTPCR 可以更敏感更可靠的估計甲型H7N9 流感病毒載量[38]。甲型H1N1 流感病毒的一些突變可能改變神經氨酸酶抑制劑奧司他韋的反應，有研究使用ddPCR 方法對這些突變進行量化，結果發現ddPCR 在量化H1N1 病毒耐藥菌株方面的靈敏度比qPCR 高30 倍，準確度比qPCR 高10 倍[39]。

4 生物傳感器檢測方法

生物傳感器具有操作簡單、靈敏度高和反應時間短等優點，這均是得益于電極制造和生物識別元件的設計。生物傳感器基于與互補片段的親和力可以感知DNA、RNA、蛋白質、酶、抗原、抗體等任何生物物體[40]。一個基本的生物傳感器包括生物分析物、傳感器、放大器和處理器。將樣本中的生物成分與已經預先附著在電極表面的受體結合時，以電流、熱量和氣體的形式產生信號，然后由傳感器轉換為可讀的形式。根據生物傳感器所使用的信號讀取方式不同可以分為電化學生物傳感器、半導體生物傳感器、光學生物傳感器、壓力晶體生物傳感器、測熱性生物傳感器等，其中用于呼吸道病毒檢測的電化學生物傳感器的研究已是發展最快的科學領域之一，主要包括基于核酸型、免疫型和其他親和型生物傳感器[41]。另一方面，生物傳感器在反復使用之后，由于基質效應的存在，其穩定性和準確性會受到影響。此外，生物傳感器的靈敏度取決于所使用生物識別元素的特性，如果生物分子濃度較低，常導致檢測結果的靈敏度不夠高，這就可能會導致產生假陰性或者假陽性的結果。

4.1 基于核酸型生物傳感器 以核酸為識別元件的電化學生物感受器一般采用DNA 或RNA，其序列通常固定在傳感器界面，它通過核酸的特異性序列識別和結合，實現與待測物質發生反應，形成電極信號，信號轉換器將其轉化為可測量的信號輸出。Bhardwaj 等[42]通過5 輪適配體篩選出了一種針對甲型流感病毒HA蛋白莖區的ssDNA 適配體，同時，該適配體可以識別mini-HA 蛋白和整個H1N1 病毒。基于核酸型生物傳感器與基于免疫型傳感器相比，核酸體積更小、成本相對低、更穩定、易于生產且免疫原性較低，在開發具有高特異性的新型電化學生物傳感器方面具有相當大的潛力[43]。

4.2 基于免疫型傳感器 抗體是基于免疫型傳感器的生物識別原件，可以識別和結合靶標（抗原）。抗體因具有高特異度、高親和力和高靈敏度，目前已經成為商業化和實驗室生物分析檢測的主要選擇，并在檢測病毒、蛋白質和癌細胞方面顯示出了極高的應用價值[44]。由于抗原抗體反應具有特異性，所以免疫型傳感器成為檢測呼吸道病毒最常用的檢測工具之一。抗體可以通過天然或重組、單克隆或多克隆等方法獲得，但是其成本相對較高、不穩定、合成復雜，且不適用于小分子、藥物和金屬離子的檢測[45]。

4.3 基于親和型生物傳感器 除核酸、抗體外，還有許多其他類型的生物識別原件，如胎兒蛋白A、多肽和聚糖等。其中胎兒蛋白A 可以通過NA 蛋白與不同的流感病毒結合，因此可以作為低成本、高選擇性的流感病毒檢測中的生物識別元件。例如，Anik 等[46]開發了一種基于石墨烯-金混合納米復合材料的電化學生物傳感器，用于識別甲型流感。

5 總結與展望

流感的早期診斷有助于及時發現感染病因，可在第一時間內采取有效措施，防止病原傳播和阻止疫情擴散。傳統的病毒培養方法結果客觀、準確，但是耗時長、操作繁瑣，對于檢測流感病毒來說已經逐漸被淘汰，但是在基礎研究方面依然具有一定的意義。免疫學、分子生物學和生物傳感器檢測由于近年來的快速發展，在靈敏度、準確度和降低成本等方面均進行了優化和改善，其各領域新興技術不斷與POCT 技術相結合，特別是與分子生物學和納米材料等技術的結合，大大縮短了檢測時間和檢測成本，但真正實現高靈敏度的POCT 檢測流感病毒仍是醫學領域一大挑戰。希望在未來檢測流感病毒技術領域中，可以實現快速、靈敏、便捷的POCT 技術。將眾多方法的研究性和實用性真正有效的融為一體，為疾病的預防和控制打下堅實的基礎。

（本文由浙江省醫學會推薦）