CRISPR/Cas 系統在核酸檢測中的應用和挑戰

張鈞 張路 孔瑩瑩

成簇的規律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及CRISPR 相關基因（CRISPR-associated，Cas）系統，即CRISPR/Cas 系統，通常由一組特征性CRISPR 陣列和CRISPR 相關基因組成，CRISPR 陣列包含重復序列和間隔序列，重復序列分散在可變的間隔序列之間。CRISPR 相關基因轉錄翻譯為Cas 蛋白，具有核酸酶活性[1]。

CRISPR/Cas 系統是遍布于古菌和細菌的適應性免疫系統，其防御過程通常包括3 個階段：適應、表達和干擾。當噬菌體等外源基因入侵時，細菌表達Cas蛋白形成復合物，通過識別外源基因中稱為原間隔鄰近基序（protospacer-adjacent motif，PAM）的特定短序列結合外源基因，并切割部分外源序列插入自身重復序列之間，形成CRISPR 陣列，此階段稱為適應階段。當噬菌體等外源基因再次入侵，古菌和細菌中CRISPR 陣列經轉錄加工成前CRISPR RNA（precrRNA），并進一步加工成更成熟的CRISPR RNA（crRNA），每個RNA 包含間隔序列和部分側翼重復序列，此階段稱為表達階段。接著，crRNA 與Cas 蛋白復合物結合形成有活性的復合體，在crRNA 引導下，Cas 蛋白復合體識別外源基因中的PAM 序列并在上游3 nt 位置切割降解外源核酸，此階段稱為干擾階段[1]。目前CRISPR/Cas 系統已被用作強大的RNA 引導DNA/RNA 靶向平臺，用于基因組編輯[2-4]、轉錄干擾[5-6]、表觀遺傳調控[7]、靶標檢測[8]等。

已經發現了多種CRISPR/Cas 系統，不同系統中Cas 蛋白序列、基因組成和基因組位點結構顯示出較大多樣性。根據上述基因序列的進化關系，將CRISPR/Cas 分為6 型（Ⅰ～Ⅵ）[9]。按照各系統發揮作用的不同方式又將這6 型分為兩大類[9-10]，這兩類系統在crRNA 加工和干擾相關效應模塊的體系結構方面存在根本差異。Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型屬于經典的1 類CRISPR/Cas 系統，由多個Cas 蛋白組成的效應模塊介導pre-crRNA 加工和干擾。相比之下，2 類系統由單一多結構域的Cas 蛋白發揮作用，它結合了干擾所需的所有活動，更適合用于開發基因編輯和靶標檢測平臺[11-14]。2 類系統主要包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ類系統，其中，Cas9、Cas12 和Cas13 分別代表Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統的效應器。

核酸是分子診斷技術檢測感染性疾病、抗生素耐藥性基因、癌癥或遺傳疾病發展相關的突變、單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）和生物標志物的重要目標。當前核酸檢測技術主要基于PCR，需要專業的設備，且需高溫打開雙鏈以啟動后續擴增循環，極大限制了其在實驗室外場景中的應用。CRISPR/Cas 系統具有在溫和環境下對靶標進行高效特異識別和切割的優勢，將其應用于核酸檢測將是開發高靈敏度和高特異度的快速、便攜、低廉的床旁檢測方向，本文就這一領域的最新發展方向作一述評。

1 各種CRISPR/Cas 系統的基本原理

1.1 Cas9 Cas9 作為Ⅱ型系統的標志蛋白，CRISPR/Cas9 是最早發現并應用于基因編輯的經典系統。該系統由Jinek 等[15]于2012 年首次發現，已在體外證明其可切割雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）。不久，Cong 等[2]利用CRISPR/Cas9 系統在大腸桿菌中實施基因組編輯，Pardee 等[16]利用CRISPR/Cas9 的PAM 特異識別切割特性，與核酸序列擴增（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）結合，以單堿基分辨率區分Zika 菌株。

CRISPR/Cas9 系統是RNA 引導的dsDNA 靶向平臺，包含Cas9 蛋白、crRNA 和反式激活crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）三部分[17]。其中，Cas9 蛋白為雙葉結構，具有RuvC、HNH 核酸酶結構域等多個參與靶DNA 切割的亞結構域（圖1A）[18-19]。crRNA 和tracrRNA 通過互補序列結合形成雙鏈向導RNA（small guide RNA，sgRNA）[20]。可以根據靶DNA 及上下游序列設計合適的sgRNA，其中crRNA 部分與目標序列互補而結合到目標序列上，該過程起到了招募和引導功能，同時引起整個sgRNA 結構發生改變，激活與之結合的Cas9 蛋白。Cas9 蛋白被激活后識別靶DNA 上的PAM 位點，即形式為5'-NGG-3'（N 代表任意堿基）的短DNA 序列，并在PAM 位點上游3 nt 位置進行特異性切割[2-3]。一般情況下，Cas9 蛋白需要與sgRNA（或crRNA 和tracrRNA）進行預孵育，形成Cas9 sgRNA 復合物，該復合物能精確定位于原間隔序列的PAM 靶位點，以實現對dsDNA 的精確特異切割功能，這種切割方式稱為順式切割。CRISPR/Cas9 的特異識別和順式切割特性是其用于開發核酸檢測系統的主要原理。

圖1 CRISPR/Cas 的結構和裂解活性示意圖[18]

1.2 Cas12 和Cas14 Cas12a（以前稱為Cpf1）是V 型系統的標志蛋白。由Zetsche 等[21]在2015 年發現第1個用于基因組編輯的Cas12 核酸酶。與Cas9 相似，Cas12a 可介導順式切割，即識別和切割目標dsDNA 中PAM（“TTTN”，N 代表任意堿基）附近的靶序列。不同之處在于Cas12a 只有唯一的催化結構域RuvC，且介導其自身crRNA 的成熟，無需tracrRNA 和額外的核酸酶來處理crRNA（圖1B）[18]。此外Cas12a-crRNA 復合物還具有非特異性反式切割活性，即一旦Cas12a 完成對目標dsDNA 的順式切割，RuvC 的活性位點就會空出，供任何單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）進入并被切割[22-24]。Cas12a 的反式切割活性裂解報告熒光探針是其用于開發核酸檢測系統的重要原理。

CRISPR/Cas12b（也稱為C2c1）作為一種獨特的VB 型系統，是一種雙RNA 引導的DNA 核酸內切酶系統[25]。與Cas12a 不同，crRNA 和tracrRNA 與Cas12b 的結合對于引導鏈和靶鏈之間的配對至關重要。值得注意的是，Cas12b 的反式切割特性對單核苷酸錯配極為敏感，這對于開發單核苷酸分辨率的檢測系統具有極大的優勢[26]。另外，Cas12b 的體積比Cas9 和Cas12a小，在與病毒載體一起遞送細胞時具有優勢[27]。

Cas14a 也屬于Ⅴ型系統，具有對ssDNA 的特異順式切割活性和非特異反式切割活性（圖1C）[18]。Cas14（也稱為Cas12f）是一個非常緊湊的RNA 引導核酸酶家族，大小為400～700 個氨基酸，是目前已知的Ⅱ類CRISPR/Cas 的一半，在與病毒載體一起遞送細胞時特別有吸引力。另外，Cas14 可以在tracrRNA 和crRNA（或sgRNA）的引導下特異性結合和切割靶ssDNA，而不需要PAM 位點的限制，具有較大的靈活性[28-30]。

1.3 Cas13 Ⅵ型系統的典型代表Cas13a（也被命名為C2c2），由Shmakov 等[13]于2015 年發現，具有高級真核生物和原核生物核苷酸結合結構域（nucleotidebinding，HEPN）（圖1D）。Cas13a 是一種RNA 引導的RNA 靶向平臺，即利用crRNA 作為向導來識別和切割靶RNA[13]。研究證實，Cas13a 既能特異性識別和剪切靶向RNA 片段，也能不加選擇地切割任意RNA序列（類似于Cas12a）[31-32]。特異順式切割靶RNA 以及非特異反式切割報告熒光探針是Cas13a 用于建立核酸檢測的兩個主要特性。利用這些特性，Gootenberg 等[8]建立了首個基于CRISPR/Cas13 的核酸檢測系統SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlock），實現單堿基分辨率檢測DNA 和RNA 靶標。

總的來說，諸如對dsDNA/ssDNA/RNA 的特異性識別和順式切割、對ssDNA/RNA 的非特異性反式切割以及僅使用crRNA 的引導等特性，已經引起了CRISPR/Cas 在核酸檢測應用的關注。

2 CRISPR/Cas 系統在核酸靶標檢測的應用

CRISPR/Cas 系統對核酸的特異性識別為核酸檢測提供了獨特的優勢。通常情況下，由于靶標檢測濃度較低，需要將CRISPR/Cas 系統與核酸擴增技術相結合進行檢測。近年來，基于CRISPR/Cas 系統的無預擴增核酸檢測系統也在陸續開發中。無預擴增核酸檢測系統主要通過兩種方案放大信號：第一，利用Cas12a、Cas13a 和Cas14 蛋白靶向結合后激活的反式裂解活性，可以在一定程度上實現對原始信號的擴增。第二，利用多種Cas 效應蛋白作為高度特異性的序列識別元件，結合電化學、比色法和熒光等多種信號輸出方法，開發無擴增系統，實現核酸的高靈敏度和高特異度檢測。

2.1 結合靶標預擴增的CRISPR/Cas 核酸檢測系統

2.1.1 基于順式切割原理的核酸靶標檢測

2.1.1.1 CUT-PCR Lee 等[33]基于CRISPR 內切酶活性結合PCR 方法開發了一種新方法，即CUT-PCR（CRISPR-mediated ultrasensitive detection of target DNA）。該方法可以利用CRISPR/Cas 內切酶切割野生型序列，減少背景DNA 信號，并通過PCR 擴增豐富癌癥特異性突變體DNA 信號。CUT-PCR 方法尤其適合去除血液中大量的野生型片段，極大提高循環腫瘤DNA（circulating tumor deoxyribonucleic acid，ctDNA）的檢測靈敏度。CUT-PCR 還可以結合靶向深度測序檢測廣泛的癌基因，具有較高的靈敏度（＜0.01%）和準確性，優于傳統的靶向深度測序。

2.1.1.2 CRISPR/Cas9 觸發的等溫指數擴增反應（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR） Huang 等[34]結合CRISPR/Cas9 位點特異性切割的優勢和等溫指數擴增技術的動力學優勢構建的檢測系統稱為CAS-EXPAR，該方法具有快速、位點特異性核酸檢測的功能。該方法的主要原理是利用CRISPR/Cas9 的特異識別和切割特性從長鏈DNA 或RNA 產生特異性EXPAR 觸發器，觸發指數擴增，既利用了EXPAR 優越的擴增動力學，又采用CRISPR/Cas9 彌補傳統EXPAR 只適用于檢測短序列的局限，見圖2。結果表明，該方法對單堿基錯配具有良好的特異性，檢出限為0.82 amol，且可以在1 h內檢測到DNA。通過將單堿基甲基化轉化為單堿基突變，CAS-EXPAR 還能夠實現位點特異性DNA 甲基化檢測，這對于監測腫瘤的診斷和預后至關重要。

圖2 CAS-EXPAR 的機制示意圖[34]

2.1.1.3 CRISDA 檢測系統 雖然PCR 是最廣泛使用的DNA 擴增方法，但熱循環的要求限制了其非實驗室應用。因此，等溫DNA 擴增技術在代替傳統PCR 的現場診斷應用中具有價值。鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）具有較高的擴增效率，采用在引物上引入限制性內切酶識別序列而使擴增反應可在恒溫條件下進行，但第一步仍然需要高溫打開雙鏈，并未達到真正的“恒溫”。Zhou 等[35]利用CRISPR/Cas9 系統在天然DNA 分子中引入單鏈斷裂或缺口，恒溫條件下從天然雙鏈DNA 生成大量單鏈DNA，啟動SDA，建立了稱為CRISDA（a CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplification method）的檢測系統，具體原理見圖3。整個過程在25～40 ℃的恒定溫度下進行，真正實現了恒溫擴增。結合肽核酸侵襲介導的終點測量，該方法在復雜樣品背景下檢測各種DNA 靶標時具有aM 靈敏度和單核苷酸特異性。CRISDA 是一種強大的等溫工具，用于超靈敏和特異性的核酸檢測，尤其適用于即時診斷和現場分析。

圖3 CRISDA 的反應機制示意圖[35]

2.1.1.4 RACE 檢測系統 細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）衍生的miRNA 譜在疾病診斷和預后評估中具有重要價值。但直接和可靠地檢測EV 衍生的多個miRNA 仍然具有挑戰性，因為大約19～23 個核苷酸的小尺寸很難設計用于傳統PCR 反應的引物[36-37]。Wang 等[38]整合CRISPR/Cas9 高度特異識別切割和方便快捷的優點以及滾環擴增（rolling circular amplifification，RCA）高靈敏度和高特異度的優勢建立了稱為RACE（RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage）的檢測系統。該系統通過在RCA 循環中引入PAM 位點，設計帶有PAM 且與RCA 產物中特異性靶標互補的熒光探針，CRISPR/Cas9 特異識別和切割RCA 產物中PAM 附近的靶標序列和熒光探針，釋放熒光，見圖4。釋放的CRISPR/Cas9 復合體觸發新一輪的識別和切割，通過這一過程可以實現循環切割，直到所有靶標都被切割。通過設計多對RCA 的掛鎖探針和熒光探針，并改變熒光探針的熒光基團即可實現多重miRNA 的檢測。RACE 在檢測培養癌細胞和臨床肺癌患者與RT-qPCR顯示出高度一致性，驗證了其穩健性，單重檢測可以達到90 fM 的靈敏度，揭示了其在疾病的篩查、診斷和預后方面的潛力。總之，RACE 具有高靈敏度和高特異度，可實現多重檢測的方便快捷檢測系統，用于即時診斷和現場分析。

圖4 RACE 的反應機制示意圖[38]

2.1.2 基于反式切割原理的核酸靶標檢測

2.1.2.1 DETECTR 檢測系統 一旦CRISPR/Cas12a 與crRNA 和靶DNA 形成復合體，該系統的反式切割活性就能有效裂解系統中的任何ssDNA。Chen 等[24]充分利用了這一特點，將重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）與Cas12a 結合建立了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）的檢測系統。該系統包括Cas12a、crRNA 和熒光團猝滅劑標記的報告基因，一旦Cas12a 檢測到并切割目標DNA 序列，就會激活反式切割活性，切割帶有熒光團猝滅劑標記的TaqMan 探針，釋放熒光。通過監測熒光信號可以準確地定量靶DNA 的存在。結果表明，DETECTR 系統可以準確地從臨床樣本中檢測出16 型和18 型以外的HPV 類型。Harrington 等[28]將DETECTR 的原理與Cas14a 的高特異性結合靶標特性相結合，開發出Cas14a-DETECTR，可實現高保真SNP基因組分型。

2.1.2.2 HOLMES Li 等[39]利用Cas12a 在熒光標記的ssDNA上的反式切割功能，開發了HOLMES（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）。HOLMES與DETECTR 系統的不同之處在于，HOLMES 借助PCR對實驗模板進行擴增。在目標DNA 存在的情況下，Cas12a-crRNA 與目標DNA 形成三元復合物，并反式切割ssDNA，產生熒光信號。SNP 是人類最常見的遺傳變異，與疾病的易感性和發病率密切相關。HOLMES平臺通過在引物中引入相關的PAM 序列，能夠檢測SNP 位點的存在。

2.1.2.3 CDetection Teng 等[40]發現從嗜酸乳桿菌Cas12b（Alicyclobacillus acidophilus Cas12b，AaCas12b）中提取的Cas12b 系統對dsDNA 敏感。該團隊基于AaCas12b-sgRNA-dsDNA 激活劑系統設計基于Cas12b的DNA 檢測（CDetection）平臺[41]。當激活劑濃度超過10 nM 時，CDetection 不僅可以檢測HPV，還可以區分HPV16 和HPV18。若引入調諧向導RNA（tune guide RNA，tgRNA），CDetection 可以在單堿基水平上區分差異，并以較高的準確性確定ABO 血型。

2.1.2.4 SHERLOCK 不同于Cas12 的crRNA 引導的dsDNA 識別和切割活性，Cas13 是一種crRNA 引導識別和切割靶RNA 的核酸酶活性[13]，特別適合用于開發RNA 靶標檢測。張峰團隊首次利用Cas13 對RNA 特異識別和非特異反式切割活性，結合RPA 擴增靶標，開發了SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking），提供了具有aM 靈敏度和單堿基錯配特異性的快速DNA 或RNA 檢測[8]。隨后，多個團隊在SHERLOCK 的基礎上修改完善補充，開發了多個高靈敏高特異方便快捷的檢測系統[42-45]。

2.2 無靶標預擴增的CRISPR/Cas 核酸檢測系統 為了達到較好的靈敏度和特異度，目前的CRISPR 系統經常與擴增技術相結合，以實現靶富集和信號擴增。而無擴增核酸檢測的優點主要包括原始信號檢測提高保真性、避免潛在的氣溶膠污染和縮短檢測時間等。利用無擴增系統是CRISPR/Cas 檢測的大趨勢。構建無擴增系統的策略主要包括CRISPR/Cas 產生的反式裂解活性增強，以及提高信號檢測器的靈敏度兩個方面。

第一，基于CRISPR/Cas 產生的反式裂解活性增強的無擴增系統。Fozouni 等[46]基于CRISPR/Cas13a 開發了一種可在30 min 內以100 拷貝/μL 的靈敏度檢出鼻拭子樣品中新型冠狀病毒的無擴增精密檢測方法。該方法將多個crRNA 連接起來以提高CRISPR 診斷的檢測靈敏度，并利用酶動力學參數來量化病毒載量。Liu 等[47]利用多個crRNA 探針進行串聯，建立了靈敏度高達30 拷貝/μL 的無擴增靶RNA 檢測方法。該方法通過靶RNA 觸發Cas13a/crRNA 的反式裂解活性，裂解ssRNA 探針，激活Csm6 蛋白的RNA 內切酶活性來剪切熒光分子，使分子爆裂放大信號。該系統中將8 個crRNA 探針串聯，檢測靈敏度再次從1 000 拷貝/μL 提高到31 拷貝/μL。Tian 等[48]采用微滴法，通過減少CRISPR 反應的體積，使其達到Cas13a 蛋白所需的最小濃度，從而提高靶核酸的濃度，在單分子水平上實現無擴增檢測，將濃度提高到pM 水平。

第二，通過提高信號檢測器的靈敏度構建CRISPR/Cas 無擴增檢測系統。Dai 等[49]建立了以CRISPRCas12a 為基礎的電化學生物傳感器（E-CRISPR）系統，在靶核酸存在的情況下，Cas12a 的反式裂解被激活，亞甲基藍修飾的ssDNA 偶聯在金電極上被裂解，導致亞甲基藍的脫離和電導率的轉變，通過電流值的變化來監測目標核酸，可以達到pmol 的靈敏度。該團隊還嘗試利用E-CRISPR 結合核酸適配體檢測非核酸靶標。Xu 等[50]通過將CRISPR 裂解活性引入E-DNA 傳感器，構建了Cas9/Cas12a 增強的E-DNA 傳感器，該檢測系統可以在無擴增的情況下檢測到pmol 水平的核酸。Hajian 等[51]整合CRISPR/Cas9 和基于石墨烯的場效應晶體管技術，開發了石墨烯場效應晶體管技術，稱為CRISPR-chip。該檢測系統可以在15 min 內以高達1.7 fM 的靈敏度實現無擴增直接檢測目標DNA。

3 CRISPR/Cas 檢測非核酸靶標

多項研究正在嘗試利用CRISPR/Cas 構建非核酸靶標如蛋白質、小分子、細胞等的檢測系統。通過生物祖體（包括適體、DNAzymes 和抗原-抗體反應）特異性識別靶物質實現非核酸信號轉換為核酸信號，將實現基于CRISPR/Cas 的非核酸物質檢測系統[18]。如核酸適體是一種短的寡核苷酸序列，能以高親和力和高特異性與相應的配體結合，常被稱為“化學抗體”[52]。適體在溶液中主要表現為非結構化。一旦適體與其配體結合，它們就折疊成分子結構，配體就成為核酸結構的固有部分。適配體-配體結合的特異性通常依賴于平面部分的精確堆疊、特定的氫鍵和分子形狀的互補性[53-54]。因此，結合適體已經開發了許多基于CRISPR/Cas 的非核酸檢測系統，用于檢測蛋白質、小分子、細胞等。隨著技術的進步，基于CRISPR/Cas 系統構建非核酸靶標檢測系統將越來越成熟，有巨大的應用潛力。

4 討論

CRISPR/Cas 系統在基因編輯中的應用且已取得極大的突破[2-3，55]，除了其強大的基因編輯能力，CRISPR/Cas 系統中Cas 蛋白的特性，如序列特異性識別、特異性核酸內切酶活性以及Cas12、Cas13 和Cas14 的反式裂解活性，以及CRISPR 可編程特性等激發了人們對開發新型檢測工具的極大興趣。本文旨在介紹CRISPR/Cas 系統在檢驗中的檢測原理以及在核酸檢測應用中的現狀，以期掌握CRISPR/Cas 系統的發展方向，為臨床疾病診斷帶來積極的影響。

CRISPR/Cas 系統對核酸的特異性識別為核酸檢測提供了獨特的優勢，目標中痕量原始濃度的信號轉換和放大是分析系統的關鍵挑戰。解決的方案主要包括：（1）將CRISPR/Cas 系統與核酸擴增技術，如PCR[56]以及SDA[57-58]、RCA[59]、環介導等溫擴增[60]等恒溫擴增技術相結合，提高核酸檢測靈敏度。（2）利用Cas12、Cas13 和Cas14 等的反式裂解活性，即特異識別激活后裂解非特異性核酸探針，使信號明顯放大[13]。該策略實現無靶標預擴增的核酸檢測，便于現場及時檢測；實現原始信號的放大，避免了預擴增中引入的錯誤，大大提高特異度和靈敏度。（3）利用多種Cas 效應蛋白作為高特異度的序列識別元件，結合電化學、比色法和熒光等多種信號輸出方法，開發了一系列無擴增系統，實現了核酸的高靈敏度和選擇性檢測[49]。

基于CRISPR/Cas 系統對非核酸靶標的檢測仍處于起步探索階段[18]。CRISPR/Cas 系統檢測非核酸靶標面臨的挑戰是如何進行將非核酸信號轉化為核酸信號。核酸適體、DNAzymes 和抗原抗體等具有特異性結合靶蛋白的能力，可以有效地完成非核酸信號的轉化和輸出。

盡管CRISPR/Cas 系統在生物傳感方面已經突出了各種優勢，但仍有一些挑戰需要克服。首先，由于目標預擴增過程容易出現錯誤，因此開發基于CRISPR/Cas 的檢測方法，在不進行預擴增的情況下達到預期靈敏度是非常關鍵的。最近，多種crRNA 組合的策略被設計用來提高靈敏度和特異度，從而可以直接定量分析病毒載量。此外，延長crRNA 的3'或5'端可以提高Cas12a 的側支裂解活性和識別特異性。其次，Cas 蛋白存在一定的背景活性，不同批次的背景活性不同，導致樣品檢測結果存在差異。第三，crRNA 和ssDNA/ssRNA 信號報告序列在臨床復雜樣品中仍然存在降解的風險。添加RNase 抑制劑和重新設計報告基因可以避免不必要的降解。

綜上所述，由于CRISPR/Cas 系統具有模塊化和可編程的特點，可以與擴增技術相結合，實現對超低濃度樣品的精確、靈敏檢測。此外，通過將CRISPR/Cas系統與其他設備如基于紙張的橫向流動分析、場效應晶體管和微流體設備耦合，可以實現高靈敏度和特異度的即時檢測。目前，結合特異性適配體，CRISPR/Cas 系統已成功用于循環腫瘤細胞、蛋白質和金屬離子等非核酸檢測，同時已經實現了細胞內的基因編輯，也將成為細胞內檢測的有力工具。

（本文由浙江省醫學會推薦）