地塞米松注射液聯(lián)合美能片治療大鼠皮膚壓迫性注射膠原蛋白導(dǎo)致過(guò)敏的研究

黃家鑫，黃 冉，李宏強(qiáng)

（1.杭州碧妍哲理健康管理有限公司金沙天街醫(yī)療美容診所，浙江 杭州，311500；2、斐縵（長(zhǎng)春）醫(yī)藥生物科技有限責(zé)任公司,吉林 長(zhǎng)春，130012）

膠原蛋白（Collagen）是人體內(nèi)最重要且分布最廣泛的蛋白質(zhì)之一，是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種由三條左旋多肽α-鏈纏繞而成的生物大分子[1]，約占體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的30%，其中50%以上的膠原蛋白位于人體皮膚組織中。膠原蛋白有很多重要的生物學(xué)特性，如低免疫原性、強(qiáng)親水性、生物可降解性、生物相容性、促凝血功能等[2-4]。膠原蛋白是構(gòu)成皮膚組織基本結(jié)構(gòu)的重要組成部分，會(huì)隨年齡增長(zhǎng)逐漸流失，出現(xiàn)皮膚松弛、皮膚彈性降低、皺紋等衰老表現(xiàn)。所以近年來(lái)，膠原蛋白作為生物醫(yī)用材料，在整形美容領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣，如消除皺紋、凹陷填充、面部塑形、提亮膚色等[5-9]。

目前膠原蛋白按功能可分為兩類(lèi)：（1）成纖維膠原，有I、II、III、XI、XXIV、XXVII 型等，占膠原總量的90%；（2）成纖維膠原，目前已知獲國(guó)家級(jí)相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)的可注射的膠原有十種以上[8]。隨著技術(shù)發(fā)展，膠原蛋白已不單純是填充劑，同時(shí)也是植入劑、再生劑或修復(fù)劑[8]。膠原蛋白以最符合人體中I型膠原與III型膠原配比的復(fù)合膠原，通過(guò)補(bǔ)充、誘導(dǎo)、刺激，重建膠原纖維，重塑皮膚纖維結(jié)構(gòu)，合成新膠原，促進(jìn)組織再生。

盡管如此，在臨床運(yùn)用中仍然發(fā)現(xiàn)不少患者在注射后會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，通過(guò)臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，可能原因是操作醫(yī)生錯(cuò)誤的注射方法（注射時(shí)壓迫血管）所致。針對(duì)這一情況，臨床上目前尚未明確統(tǒng)一的治療方案，因此，本次研究將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探索和驗(yàn)證這一可能原因，并進(jìn)一步探索應(yīng)對(duì)該問(wèn)題的有效治療措施。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

選取SD 大鼠，25 只，7-8 周，雌性（北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)NO：1102141911032015，飼養(yǎng)于 SPF 環(huán)境內(nèi)，溫度22±2℃，濕度 68%，明暗 12 陰性對(duì)照生理鹽水）。共有6組，每組5只，分為對(duì)照組：采用生理鹽水進(jìn)行淺表皮內(nèi)注射；皮內(nèi)注射組：采用醫(yī)用膠原蛋白進(jìn)行淺表皮內(nèi)注射；壓迫性皮內(nèi)注射組：采用壓迫血管的方式進(jìn)行醫(yī)用膠原蛋白皮內(nèi)注射；陽(yáng)性藥物組：采用C48/80，15 μg/mL進(jìn)行皮內(nèi)注射。藥物研究時(shí)，壓迫性注射造模后分為地塞米松注射液聯(lián)合美能片給藥組（聯(lián)合用藥組）、地塞米松給藥組（地塞米松組）、美能片給藥組（美能組）和生理鹽水對(duì)照組（對(duì)照組）。藥品試劑：醫(yī)用膠原蛋白[斐縵(長(zhǎng)春)醫(yī)藥生物科技有限責(zé)任有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)：20163131609]，陽(yáng)性藥物（中化藥品工業(yè)有限公司），地塞米松注射液（天津全耀藥業(yè)有限公司），美能片（復(fù)方甘草酸苷片，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司）。實(shí)驗(yàn)試劑：伊文思藍(lán)（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 造模與給藥

1.2.1 皮內(nèi)注射與壓迫血管注射方法

以 75%酒精消毒皮膚，待干，取出藥物驅(qū)盡注射器內(nèi)空氣。左手繃緊注射部位皮膚，右手持注射器，針頭斜面向上與皮膚成 5-15 度角刺入皮內(nèi)。待針尖斜面全部進(jìn)入皮內(nèi)后以左手拇指固定針?biāo)ǎ沂滞谱⑺幰?0.1mL 可見(jiàn)圓形隆起的皮丘，并顯露毛孔。注射完畢拔出針頭，切勿按壓勿用碘酊消毒皮膚。勿揉擦、蓋住注射部位。壓迫血管注射操作步驟同皮內(nèi)注射，但不同的是需尋找血管豐富處皮膚進(jìn)行。注射時(shí)，右手未懸空，直接壓在皮膚上，且針頭直接壓在皮膚上進(jìn)行注射。

1.2.2 給藥方法與取材

尾靜脈注射 0.1%的伊文思藍(lán)溶液，10 mL/kg，注射完成后動(dòng)物背部備皮，行脊柱周?chē)? 個(gè)點(diǎn)注射，膠原內(nèi)皮注射組動(dòng)物皮內(nèi)注射膠原 0.1 mL，壓迫組進(jìn)行壓迫血管注射方法注射膠原蛋白，陽(yáng)性藥物組注射 0.5 mg/100 ul，可造成快速過(guò)敏反應(yīng)。藥物研究時(shí)，壓迫性皮下注射造模后，隨機(jī)分為四組，共給藥7 天。第1 天，聯(lián)合用藥組和地塞米松組分別腹腔注射藥物地塞米松，美能組和對(duì)照組分別腹腔注射等量生理鹽水，隨后每2 天，聯(lián)合用藥組進(jìn)行地塞米松+美能片灌胃，地塞米松組進(jìn)行地塞米松灌胃，美能組進(jìn)行美能片灌胃，對(duì)照組進(jìn)行等量生理鹽水灌胃。第7天給藥后2 小時(shí)各組動(dòng)物尾靜脈注射0.1%伊文思藍(lán)10 mL/kg。隨后處死大鼠，剪開(kāi)腹腔，用生理鹽水沖洗腹腔，收集洗滌液5 mL。然后取皮下注射位置皮膚進(jìn)行病理實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 伊文思藍(lán)含量測(cè)定

將收集到的洗滌液，在723 型分光光度計(jì)于61 0nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，計(jì)算伊文思藍(lán)滲出量。

1.2.4 HE 染色

大鼠皮膚組織在4% 中性緩沖福爾馬林中固定24 h后，將組織包埋在石蠟中，切片后，進(jìn)行蘇木堿伊紅染色。使用 LEICA DM 2500 顯微鏡獲取圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，各組間比較采用ANOVA方法進(jìn)行方差分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組皮內(nèi)注射后大鼠背部皮膚變化比較

可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物背部快速過(guò)敏反應(yīng)，皮膚包塊比前兩組大，注射點(diǎn)位明顯水腫，壓迫性皮內(nèi)注射組，可見(jiàn)注射點(diǎn)位水腫，但不如陽(yáng)性藥物組明顯，見(jiàn)圖1。

圖1 各組皮內(nèi)注射后大鼠背部皮膚變化比較

2.2 各組間皮內(nèi)注射后大鼠背部皮膚藍(lán)斑變化比較

陽(yáng)性藥物組注射后，注射點(diǎn)有明顯水腫，且藍(lán)斑逐漸明顯（見(jiàn)圖2 A紅色箭頭所指）。而皮內(nèi)注射組和壓迫性注射組未見(jiàn)明顯藍(lán)斑（見(jiàn)圖2 B）。

圖2 各組間皮內(nèi)注射后大鼠背部皮膚藍(lán)斑變化比較

2.3 伊文思藍(lán)結(jié)果分析

與對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥物組和壓迫性皮內(nèi)注射組伊文思藍(lán)滲出量顯著升高（P＜0.01）。而皮內(nèi)注射組伊文思藍(lán)滲出量雖有升高趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖3。

圖3 各組間伊文思藍(lán)含量比較

圖4 各組組織HE 染色后的病理變化（×100）

圖5 藥物治療后四組間伊文思藍(lán)含量比較

2.4 各組病理結(jié)果

病理結(jié)果顯示皮內(nèi)注射組組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯角化過(guò)度角化不全，表皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯疏松水腫，真皮層膠原纖維豐富組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞就浸潤(rùn)（見(jiàn)圖3 A）。壓迫性皮內(nèi)注射組組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯角化過(guò)度角化不全，真皮層可見(jiàn)明顯疏松水腫（見(jiàn)圖3 B紅色箭頭所示），且組織可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖3 B黑色箭頭所示）。陽(yáng)性藥物組組織整體結(jié)輕度異常，表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯角化過(guò)度角化不全，真皮層可見(jiàn)膠原纖維斷裂明顯疏松水腫（見(jiàn)圖3 C黑色箭頭所示），真皮層毛囊數(shù)量明顯增多（見(jiàn)圖3 C紅色箭頭所示），組織未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.5 藥物治療后伊文思藍(lán)結(jié)果分析

在壓迫性注射醫(yī)用膠原蛋白后，與生理鹽水對(duì)照組相比，單獨(dú)地塞米松治療和單獨(dú)美能片治療，均無(wú)明顯變化。但經(jīng)過(guò)地塞米松注射液聯(lián)合美能片治療后，伊文思藍(lán)滲出量雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但呈降低趨勢(shì)。表明藥物治療后血管通透性有所降低。

2.6 藥物治療后病理結(jié)果

病理結(jié)果顯示對(duì)照組組織存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以分葉核白細(xì)胞為主，纖維母細(xì)胞增生。而經(jīng)過(guò)藥物治療后，地塞米松組和美能組組織均出現(xiàn)較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，聯(lián)合用藥組出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維母細(xì)胞增生。見(jiàn)圖6。

圖6 藥物治療后兩組組織HE 染色后的病理變化（×200）

3 討論

目前動(dòng)物源性膠原蛋白生物材料主要是從牛、豬等中提取。近年來(lái)隨著膠原蛋白酶解去端肽技術(shù)成熟，動(dòng)物源性膠原蛋白發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的概率逐漸降低。臨床上發(fā)生過(guò)敏的常見(jiàn)原因多為個(gè)人體質(zhì)原因或膠原蛋白變性[7，11-12]。但在嚴(yán)格篩選注射人群，嚴(yán)格把控膠原蛋白儲(chǔ)存條件的情況下，不正確的注射方式成為導(dǎo)致患者出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)又一要因。因此本次研究我們應(yīng)用大鼠模擬可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤操作來(lái)驗(yàn)證其與過(guò)敏反應(yīng)的相關(guān)性。

臨床結(jié)果以及病理結(jié)果表明，在大鼠表皮進(jìn)行壓迫性注射（即壓迫血管注射）后，會(huì)出現(xiàn)與陽(yáng)性藥物所致過(guò)敏相似的反應(yīng)，只是過(guò)敏反應(yīng)相對(duì)較輕。伊文思藍(lán)在正常情況下是不會(huì)滲出的，而壓迫性注射組的明顯升高，這表明表皮血管通透性增高，此時(shí)發(fā)生了過(guò)敏反應(yīng)[11,13]。因此，可以認(rèn)為錯(cuò)誤的注射方式可能造成患者出現(xiàn)相應(yīng)過(guò)敏癥狀。

目前臨床研究中，醫(yī)生對(duì)于壓迫性注射膠原蛋白導(dǎo)致過(guò)敏的治療措施知之甚少，因此我們基于前期壓迫性注射大鼠模型，對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

地塞米松因其具有抗炎、抗風(fēng)濕、抗過(guò)敏以及免疫抑制作用而被應(yīng)用于治療炎癥、過(guò)敏、自身免疫性疾病等治療中[13]。其原理可能是地塞米松注射液可降低毛細(xì)血管通透性，減少局部滲出，從而有利于過(guò)敏癥狀好轉(zhuǎn)。而在腫瘤化療患者經(jīng)外周靜脈穿刺中心靜脈置管(peripherally inserted central venous catheters,PICC) 相關(guān)皮膚過(guò)敏研究中發(fā)現(xiàn)地塞米松注射液可有效地改善PICC引起的皮膚過(guò)敏[14,15]。

美能片即復(fù)方甘草酸苷片，目前藥理學(xué)研究表明其主要成分甘草酸二銨可抑制肥大細(xì)胞顆粒、組胺和緩激肽等介質(zhì)的釋放[16]，此外其還具有抑制局部過(guò)敏壞死反應(yīng)和施瓦茨曼現(xiàn)象(Shwartzman Phenomenon)等抗過(guò)敏作用，對(duì)皮質(zhì)激素有著增強(qiáng)抑制應(yīng)激反應(yīng)的作用，但對(duì)激素的滲出作用無(wú)影響[17,18]。因此，基于這兩種藥物的特性，本次實(shí)驗(yàn)利用地塞米松注射液聯(lián)合美能片來(lái)研究其對(duì)壓迫性注射所致過(guò)敏的療效。研究發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠在分別服用地塞米松注射液和美能片，以及聯(lián)合用藥后，其病理結(jié)果顯示炎癥相比于對(duì)照組有著明顯改善，并且聯(lián)合用藥效果更佳。同時(shí)，伊文思藍(lán)結(jié)果也表明血管通透性有所降低。兩項(xiàng)結(jié)果皆證明地塞米松注射液聯(lián)合美能片對(duì)治療壓迫性注射膠原蛋白所引起的過(guò)敏反應(yīng)有一定的療效。

綜上所述，壓迫性注射是造成注射膠原蛋白時(shí)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的可能原因，聯(lián)合應(yīng)用地塞米松注射液和美能片可以有效地改善壓迫性注射所致的過(guò)敏反應(yīng)。

然而壓迫性注射所致過(guò)敏以及地塞米松注射液和美能片如何改善過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制均尚不清楚，因此我們將就此開(kāi)展更深層次的研究，探索相關(guān)病理生理機(jī)制、提供更多的理論依據(jù)，為臨床用藥提供更多思路。