雙黃連口服液質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)研究△

勞永真，徐凌川，趙桉熠，蘇江敏，郭叢，劉安，章軍*，劉艷*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

雙黃連口服液（SHLO）是由金銀花、黃芩、連翹按一定工藝制成的中藥制劑，方中金銀花清風(fēng)溫?zé)帷ⅫS芩清腸中濕熱、連翹清心瀉火，主要用于外感風(fēng)熱所致的發(fā)熱、咳嗽、咽痛等[1]。SHLO 的生產(chǎn)廠家有12家，市場(chǎng)規(guī)模超10億，但有研究表明，不同生產(chǎn)廠家產(chǎn)品質(zhì)量存在差異[2]。目前，關(guān)于SHLO的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法較多，主要為采用紅外光譜法[3]、紫外光譜法[4]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、核磁共振法[6]等方法對(duì)樣品中連翹酯苷A、綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、木犀草素、黃芩苷、五福花苷酸等成分和總黃酮[7-13]進(jìn)行定性定量檢測(cè)。另有學(xué)者通過建立SHLO指紋圖譜評(píng)估樣品質(zhì)量[14]，或利用生物效價(jià)評(píng)價(jià)方法測(cè)定SHLO 樣品的抗菌性[15]。雖然已有方法可從不同角度檢測(cè)SHLO 的有效成分、生物效應(yīng)等，但這些數(shù)據(jù)基于不同平臺(tái)和不同樣品，彼此之間不能貫通使用，無法體現(xiàn)同類產(chǎn)品的優(yōu)劣和一致性差異，無法區(qū)分市售產(chǎn)品的質(zhì)量等級(jí)。

本研究旨在探索SHLO 的質(zhì)量一致性，一方面將成藥指標(biāo)成分與原料藥關(guān)聯(lián)，運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)來自SHLO 中3 味原料的6 個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行定性定量分析；另一方面將成藥指標(biāo)成分與生產(chǎn)制造相關(guān)聯(lián)，考察樣本批內(nèi)、批間質(zhì)量差異，運(yùn)用批內(nèi)一致性差異值（PA）、批間一致性差異值（PB）、指紋圖譜相似率（PC）3個(gè)參數(shù)量化質(zhì)量均一化水平，結(jié)合主成分分析（PCA）模型實(shí)現(xiàn)不同廠家SHLO 質(zhì)量一致性評(píng)估，為SHLO 的質(zhì)量提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括G7117C 型四元梯度泵、G7129C 型自動(dòng)進(jìn)樣器、G7116A 型柱溫箱、G7104 型二極管陣列檢測(cè)器）；XSR105/A 型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250DB 型超聲波清洗儀（蘇州昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品新綠原酸（批號(hào)：BCY-000316，純度≥98%）、綠原酸（批號(hào)：BCY-000315，純度≥98%）、連翹酯苷A（批號(hào)：BCY-000491，純度≥98%）、黃芩苷（批號(hào)：BCY-000376，純度≥98%）、連翹苷（批號(hào)：BCY-000490，純度≥98%）均購于江西佰草源生物科技有限公司；對(duì)照品漢黃芩苷（批號(hào)：1119-090905，純度≥98%，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心有限公司）；乙腈（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆涣姿幔ㄉV純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；甲醇（分析醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈飲料有限公司）。雙黃連口服液（每1 mL 相當(dāng)于飲片1.5 g）來自8個(gè)生產(chǎn)廠家，產(chǎn)品信息見表1。

表1 雙黃連口服液樣品信息

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備

分別取新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、漢黃芩苷對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為35.3、29.9、41.9、41.3、18.9、41.3 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液和黃芩苷質(zhì)量濃度為707.9 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

取本品1 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲提取5 min（功率為250 W，頻率為40 kHz），冷卻至室溫，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；流動(dòng)相0.4%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，91%～88%A；10～12 min，88%～86%A；12～22 min，86%～83%A；22～48 min，83%～67%A；48～63 min，67%～36%A）；檢測(cè)波長為254 nm。HPLC圖見圖1。

圖1 對(duì)照品和SHLO樣品HPLC圖

2.4 質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)

為考察不同廠家樣品質(zhì)量一致性情況，本研究引用PA、PB、PC3個(gè)一致性參數(shù)。PA為同批號(hào)5 個(gè)包裝單位樣品相同指標(biāo)成分含量極差值與均值的百分比[16]，當(dāng)所測(cè)指標(biāo)數(shù)為n時(shí)，PA為n個(gè)指標(biāo)成分一致性差異值的均值，按公式（1）計(jì)算。PB為5 個(gè)不同批號(hào)樣品相同指標(biāo)成分含量極差值與均值的百分比[16]，當(dāng)所測(cè)指標(biāo)數(shù)量為n時(shí)，PB為n指標(biāo)成分一致性差異值的均值，按公式（2）計(jì)算。

PC為各廠家5 個(gè)批號(hào)樣品指紋圖譜與生成對(duì)照?qǐng)D譜的相似率，取供試品溶液在254 nm 下的色譜圖為指紋圖譜，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2.0 版），采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正、全峰匹配后生成的圖譜為參照?qǐng)D譜，計(jì)算各批樣品與生成圖譜的相似度，相似度最小值的百分值為PC。

2.5 化學(xué)計(jì)量分析

以8 個(gè)廠家3 個(gè)一致性參數(shù)為變量，采用SIMCA-P 13.0 軟件對(duì)變量以主成分特征值和累積方差貢獻(xiàn)率進(jìn)行PCA。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 線性關(guān)系 計(jì)算各成分的線性回歸方程及范圍，結(jié)果見表2，在相應(yīng)范圍內(nèi)各成分的r均大于0.999 5，表明6 個(gè)成分的校準(zhǔn)曲線表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性。

表2 SHLO中6個(gè)成分線性關(guān)系及范圍

3.1.2 精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為201208 的樣品制備供試品溶液，按2.3 項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.2%、0.5%、0.3%、0.1%、0.7%、0.1%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選擇批號(hào)為201208 樣品的供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣，新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷質(zhì)量濃度的RSD分別0.5%、0.4%、0.2%、0.1%、0.3%、0.1%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為201208 的樣品平行制備6 份供試品溶液，按2.3 項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，6 份供試品溶液中新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷質(zhì)量濃度的RSD 分別0.4%、0.9%、0.9%、0.4%、0.9%、0.4%，表明該方法具有良好重復(fù)性。

3.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為201208的樣品0.5 mL，按2.2 項(xiàng)方法制備供試品溶液6 份。分別精密加入已知質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下條件測(cè)定，6 個(gè)成分的平均加樣回收率及RSD 見表2，說明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性良好。

表2 SHLO中6個(gè)成分加樣回收率結(jié)果

3.2 含量測(cè)定

樣品中綠原酸、黃芩苷、連翹苷的質(zhì)量濃度分別為0.66～1.25、12.71～21.89、0.39～0.66 mg·mL-1，依據(jù)《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》2020 年版（一部）對(duì)SHLO 的相關(guān)要求[17]，所有樣品均為合格品。樣品中新綠原酸、連翹酯苷A、漢黃芩苷的質(zhì)量濃度分別為0.75～1.44、0.07～0.94、0.001 3～1.930 0 mg·mL-1（表3）。

表3 8個(gè)廠家40批SHLO中6個(gè)成分的質(zhì)量濃度（n=2） mg·mL-1

對(duì)比不同廠家相同成分的質(zhì)量均一性發(fā)現(xiàn)，不同廠家6 個(gè)指標(biāo)成分質(zhì)量濃度的RSD為0.5%～48.4%（綠原酸為2.3%～12.0%、黃芩苷為0.5%～3.6%、連翹苷為3.1%～10.6%、新綠原酸為3.2%～10.8%、連翹酯苷A為7.4%～39.7%、漢黃芩苷為10.3%～48.4%），即廠家間樣品含量控制水平不一，連翹酯苷A、漢黃芩苷的質(zhì)量均一性較差。

為了比較不同廠家產(chǎn)品的質(zhì)量、分析其與原料藥的關(guān)系，將6 個(gè)指標(biāo)成分分為3 類并進(jìn)行加和統(tǒng)計(jì)，以代表不同原料藥的含藥量結(jié)果。樣品含金銀花以新綠原酸和綠原酸總量計(jì)，含連翹以連翹苷和連翹酯苷A 總量計(jì)，含黃芩以黃芩苷和漢黃芩苷總量計(jì)。每個(gè)指標(biāo)為來自同一廠家5 個(gè)批次的平均含藥量，結(jié)果見圖2。如圖2所示，各廠家樣品金銀花的含藥量為1.58～2.55 mg·mL-1，黃芩的含藥量為13.67～22.76 mg·mL-1，連翹的含藥量為0.60～1.29 mg·mL-1，各廠家產(chǎn)品質(zhì)量存在明顯差異。連翹含藥量的差異達(dá)到每單位約2.2 倍。因采收時(shí)期不同，連翹可分為青翹和老翹。《中國藥典》2020年版規(guī)定，連翹苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.15%，青翹的連翹酯苷A 質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于3.5%，老翹的連翹酯苷A 質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.25%，因此推測(cè)各生產(chǎn)廠家的連翹原料可能存在青翹、老翹混合使用的情況，導(dǎo)致質(zhì)量差異較大。另外，不同廠家對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)注點(diǎn)不同，如T 廠家中金銀花和連翹成分含量較高，而X 廠家連翹和黃芩成分含量較高。

同一制造商不同指標(biāo)組分的含藥量在限度要求之上變化無法直接比較產(chǎn)品質(zhì)量，因此，統(tǒng)計(jì)SHLO 中3 個(gè)藥味的總含量以比較各樣品質(zhì)量差異，結(jié)果見圖2D。8 個(gè)廠家SHLO 中代表性成分的總含藥量為16.47～26.16 mg·mL-1，其中X 廠家含藥量最高，Z 廠家最低，3 個(gè)成分中黃芩含藥量占比明顯高于其他藥味，表明其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響最大，國家標(biāo)準(zhǔn)以其作為關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)具有一定的合理性。

3.3 質(zhì)量一致性

依據(jù)2.5 項(xiàng)下描述的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)方法統(tǒng)計(jì)不同廠家產(chǎn)品的質(zhì)量一致性參數(shù)，結(jié)果見表4。8 個(gè)廠家的PA為1.2%～7.7%，除Z廠家外，各PA≤3.6%，表明這些廠家批內(nèi)一致性質(zhì)量控制水平良好；PB為16.6%～39.1%，反映出不同廠家間批間質(zhì)量控制存在差別，其中F、R 廠家的PB＜20%，T、S、X 3 個(gè)廠家20%＜PB＜30%，Z、L、J 3個(gè)廠家30%＜PB＜40%；各廠家PC均≥99.3%，表明其內(nèi)部樣品整體相似度較高。

表4 8個(gè)廠家SHLO的質(zhì)量一致性差異 %

3.4 PCA

以8 個(gè)廠家SHLO 的3 個(gè)一致性參數(shù)為變量進(jìn)行性PCA 擬合，8 個(gè)廠家樣本的PCA 得分散點(diǎn)圖見圖3，2 個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為88.7%，可以代表變量的大部分信息。

圖3 8廠家SHLO的PCA得分

對(duì)3 個(gè)一致性參數(shù)提取新的主成分，分別設(shè)置為p1 和p2，兩因子是不同樣本的第一和第二分量矩陣得分，新生成的主成分因子的表達(dá)公式分別為p1=0.604×PA+0.745×PB-0.284×PC、p2=0.537×PA-0.116×PB+0.836×PC。兩公式計(jì)算使用了成分矩陣的結(jié)果，有利于對(duì)不同樣本進(jìn)行評(píng)分。隨后，以每個(gè)主成分的方差百分比作為權(quán)重，設(shè)置一致性區(qū)分因子（P），計(jì)算公式為P=0.504×p1+0.383×p2，各廠家得分結(jié)果見表5。根據(jù)分值可以將8個(gè)廠家分為3類，Z、L、J 3個(gè)廠家P值均大于30.0，分為一類；S、T、X 3個(gè)廠家25.0＜P＜30.0，分為一類；F、R 2個(gè)廠家P＜25.0，分為一類。由于P值越小一致性越好，該結(jié)果說明F 和R 2 個(gè)廠家產(chǎn)品一致性較好。

表5 8個(gè)廠家SHLO的主成分因子和一致性區(qū)分因子得分

4 討論

為盡可能對(duì)所選擇成分進(jìn)行完全提取，本研究在樣品前處理部分（提取溶劑、料液比、提取時(shí)間）進(jìn)行了詳盡的考察，為盡可能對(duì)各成分準(zhǔn)確定量，將各成分在190～400 nm 掃描，發(fā)現(xiàn)連翹苷、黃芩苷和漢黃芩苷的最大吸收波長相差6 nm 以內(nèi)，經(jīng)綜合考慮最終選取278 nm 作為此3 個(gè)成分的檢測(cè)波長；新綠原酸、綠原酸及連翹酯苷A 的最大吸收波長相差4 nm 以內(nèi)，故將330 nm 作為此3 個(gè)成分的檢測(cè)波長；在定性部分預(yù)先設(shè)定6 個(gè)檢測(cè)波長，比較不同波長下樣品的色譜峰數(shù)量、峰形、分離度后選取254 nm 作為樣品指紋圖譜的檢測(cè)波長。

定量指標(biāo)中黃芩苷、連翹苷、綠原酸為《中國藥典》2020 年版必檢成分；新綠原酸作為綠原酸的同分異構(gòu)體，有抗炎、增強(qiáng)免疫、心血管保護(hù)等作用[18]，且在金銀花中含量較高；連翹酯苷A為連翹中主要活性成分，有抗炎、抗氧化、改善肺損傷的作用[19]；漢黃芩苷為黃芩中重要活性成分之一[20]，具有抗炎、緩解急性肺損傷的作用[21]，因此將此6個(gè)成分作為定量指標(biāo)。《中國藥典》2020 年版必檢成分與非《中國藥典》2020 年版規(guī)定成分相組合的方式，可以較真實(shí)地還原原料藥味的真實(shí)性，從而避免藥品質(zhì)量唯《中國藥典》2020 年版指標(biāo)成分是重的絕對(duì)性。

由研究結(jié)果可知，《中國藥典》2020 年版指標(biāo)成分含量均合格且差異較小，非《中國藥典》2020年版指標(biāo)成分含量則存在較大差異。尤其是漢黃芩苷，分析樣本產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)，河南制造商（如F、T 和Z）生產(chǎn)的SHLO 樣品中該成分質(zhì)量濃度相對(duì)穩(wěn)定，為0.20～0.40 mg·mL-1，而東北制造商（如R、S、L、X）生產(chǎn)的樣品中漢黃芩苷質(zhì)量濃度差異較大，為0.002 1～1.580 0 mg·mL-1，相差700 余倍。此結(jié)果值得筆者團(tuán)隊(duì)更加深入分析研究。各制造商生產(chǎn)的SHLO 產(chǎn)品PA差異較小（＜8%），說明各廠家生產(chǎn)工藝相對(duì)成熟，在保證每次投料飲片質(zhì)量均一的情況下，產(chǎn)品批內(nèi)質(zhì)量一致性能得到較好的控制；PB遠(yuǎn)大于PA表明批間一致性控制較難，也說明原料質(zhì)量差異是影響不同批次樣品質(zhì)量的重點(diǎn)。在中藥制劑的生產(chǎn)過程中，中藥材的質(zhì)量差異會(huì)傳遞至處方藥味、中間體及成品，直接影響中藥制劑批間質(zhì)量的穩(wěn)定性。為減少此類原因?qū)е碌馁|(zhì)量波動(dòng)、提高中藥制劑批間質(zhì)量一致性，建議各生產(chǎn)廠家依據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心2020 年發(fā)布的《中藥均一化研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[22]，以減少批間質(zhì)量波動(dòng)、達(dá)到質(zhì)量均一為目標(biāo)，在不改變投料量的前提下，對(duì)不同批次具有一定質(zhì)量波動(dòng)的合格處方藥味采用合適的均一化投料的措施。根據(jù)P將廠家分為3 類，各廠家一致性（24.2≤P≤33.3）有差異但不明顯，且R、F廠家產(chǎn)品質(zhì)量均一性較其他產(chǎn)品更好。

藥品是具有預(yù)防治療疾病功能的特殊商品，質(zhì)量好壞關(guān)系到用藥人群的健康安全。本研究結(jié)果揭示了常見8 個(gè)廠家的SHLO 存在一定程度上的質(zhì)量差異，此結(jié)果值得醫(yī)藥企業(yè)關(guān)注。該結(jié)果也反映出現(xiàn)階段僅依靠國家、地方標(biāo)準(zhǔn)難以使藥品質(zhì)量均一穩(wěn)定，期望更多的國家相關(guān)部門和專家同行一起關(guān)注中成藥質(zhì)量的一致性問題并提出解決辦法，制定能體現(xiàn)藥品品質(zhì)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，共同推進(jìn)中成藥質(zhì)量提升，保障中成藥的質(zhì)量安全穩(wěn)定。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。